本發(fā)明涉及動(dòng)物疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，具體地指一種安卡拉病毒毒株FAdV-HB及其滅活疫苗的制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

禽腺病毒(Fowl adenovirus)根據(jù)不同的群特異性抗原分為三個(gè)群:I群，II群和III群。I群禽腺病毒包括傳統(tǒng)的禽腺病毒(Fowl adenovirus，F(xiàn)AV)及其它禽類(lèi)分離物，共12個(gè)血清型，代表株為雞胚致死孤兒病毒(chicken embryo lethal orphan,CELO)。Ⅱ群禽腺病毒包括火雞出血性腸炎病毒(HEV)、雉雞大理石脾病毒和雞大脾病毒，它們與I群禽腺病毒無(wú)抗原相關(guān)性(Domermuth et al.,1980)。Ⅲ群禽腺病毒是與減蛋綜合征(egg drop syndrome,EDS)有關(guān)的一類(lèi)病毒，可從雞、雞、鵝體內(nèi)分離得到，致病性差異很大(Russell W C.,1995)，它們只是部分含有I群禽腺病毒的共同抗原(McFerran et al.,1978)。

I群禽腺病毒呈現(xiàn)世界性分布，可感染多種禽類(lèi)，在鴨鵝體內(nèi)多呈隱性感染，但是對(duì)雞的致病力較強(qiáng)。其所有12個(gè)血清型均能引起包涵體肝炎(IBH),只有血清4型禽腺病毒是心包積水肝炎綜合征(HHS)的主要病原。很多研究表明，腺病毒相關(guān)病毒(adeno-associated viruses,AAV)傳染性法氏囊病毒和雞傳染性貧血病毒可有效增強(qiáng)I群禽腺病毒的致病性(Fadly et al.,1976)。

心包積水-肝炎綜合征是由血清4型禽腺病毒(FAdV-4)引起的一種新型家禽疾病，其典型癥狀是導(dǎo)致3～5周齡肉雞突然死亡，并伴有嚴(yán)重的心包積水和肝炎，因此而得名。又因本病1987年首次于報(bào)道于巴基斯坦安卡拉地區(qū)，故該病又被稱(chēng)為安卡拉病。隨后本病逐漸蔓延至世界各地，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。FAdV-4具有明顯的致病年齡段，對(duì)3-5周齡的致病力最強(qiáng)，即可通過(guò)水平傳播也可通過(guò)垂直傳播。其主要病變?yōu)樾陌环e有清亮或淡黃色的水樣或果凍狀液體，肝臟有局灶性壞死出血。病理組織切片觀察肝臟，肝細(xì)胞出現(xiàn)大量的嗜堿性核內(nèi)包涵體。

本病主要發(fā)生于3～5周齡的肉雞、817麻雞，偶見(jiàn)于20周齡肉種雞和蛋雞，其中以3～7周齡的雞易發(fā)病。發(fā)病雞群多于感染后3周齡開(kāi)始死亡，4～5周齡達(dá)高峰，高峰持續(xù)期4～8d，5～6周齡死亡減少。病程8～15d，死亡率高達(dá)80％。發(fā)病雞無(wú)明顯先兆而突然倒地，沉郁，羽毛成束，出現(xiàn)呼吸道癥狀，兩腿劃空。雞感染后可成為終身帶毒者，并可間歇性排毒。

自2014年江蘇省第一次報(bào)到禽腺病毒的爆發(fā)，本病已在全國(guó)多地集中爆發(fā)，尤其是河南湖北和山東等地，對(duì)養(yǎng)禽產(chǎn)業(yè)造成巨大損失。通過(guò)對(duì)我國(guó)流行的Ⅰ群禽腺病毒進(jìn)行血清型和基因型分析，發(fā)現(xiàn)我國(guó)主要流行A、B、C三種基因型，共6個(gè)血清型(火雞1型、1型、4型、5型、8a/b型)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)近期在豫南、皖北、蘇北、魯西北和膠東地區(qū)流行的禽腺病毒主要是血清4型和8a/b型，對(duì)雞群的致死率較高，發(fā)病急，蔓延迅速，對(duì)我國(guó)的養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的威脅。因此，研制安全有效的I群禽腺病毒滅活疫苗，為提高國(guó)內(nèi)I群禽腺病毒疫苗的防控能力和防止I群禽腺病毒蔓延具有重要的使用意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種安卡拉病毒毒株FAdV-HB及其滅活疫苗的制備和應(yīng)用。該安卡拉病毒毒株FAdV-HB具有免疫原性好、增殖滴度高

該制備方法將FAdV-HB毒株接種在雞肝癌細(xì)胞(LMH)上，使病毒能在雞肝癌細(xì)胞(LMH)上增殖，制備出能產(chǎn)生較高抗體的安卡拉病毒滅活疫苗。疫苗的生產(chǎn)工藝、安全性、保護(hù)效果、免疫程序和有效期實(shí)驗(yàn)研究表明該疫苗是安全有效的。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一株安卡拉病毒毒株FAdV-HB，從湖北應(yīng)城發(fā)病雞場(chǎng)的肝臟組織樣品中分離得到，經(jīng)PCR擴(kuò)增，連接T載體進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)鑒定該病毒為安卡拉病毒。該毒株FAdV-HB命名為：I群禽腺病毒株FAdv-HB，該毒株于2017年1月3日送交中國(guó).武漢.武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號(hào)為CCTCC NO：V201703。

上述毒株FAdV-HB的形態(tài)特征：

FAdV-HB屬于I群禽腺病毒，呈球形，病毒顆粒直徑70-90nm(電鏡圖)，無(wú)囊膜，其基因組為單分子的、線狀、雙股DNA，二十面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)；DNA的分子量大小約45kb，占整個(gè)病毒粒子的11.3％～13.5％，其余部分為蛋白；病毒粒子具有252殼粒，其中二十面體的頂角殼粒為12個(gè)五鄰體(penton)，每個(gè)五鄰體有二條纖維突起，長(zhǎng)度為100A-370A，這些纖突以五鄰體為基底由衣殼表面伸出，纖突頂端形成頭節(jié)區(qū)；五鄰體和纖突的頭節(jié)區(qū)可與細(xì)胞表面的病毒受體結(jié)合，在病毒感染細(xì)胞過(guò)程中起著非常重要的作用；此外，二十面體上還有240個(gè)非頂角殼粒，稱(chēng)為六鄰體(Hexon)；六鄰體是病毒粒子內(nèi)最大的蛋白，是禽腺病毒的主要表面抗原蛋白，含有型、型間特異性抗原表位及中和性抗原表位；病毒含有約14條多肽，多肽II為hexon，III為五鄰體；IIIa為五鄰體周?chē)鞍?；IV為纖維蛋白62K，V為核心蛋白；VI為六鄰體相關(guān)蛋白；VII為核心蛋白II；VIII為五鄰體相關(guān)蛋白；IX為9個(gè)六鄰體組的特異性蛋白；TP為DNA的末端蛋白。

利用上述安卡拉病毒毒株FAdV-HB制備滅活疫苗的方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)將上述毒株FAdV-HB接種雞肝癌細(xì)胞上，培養(yǎng)，收獲病毒液，

2)經(jīng)甲醛滅活后與礦物油佐劑混合乳化制成安卡拉滅活疫苗，用于預(yù)防安卡拉。

本發(fā)明還提供了一種上述制備得到的滅活疫苗在預(yù)防安卡拉病中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明提供FAdV-HB毒株，能在雞肝癌細(xì)胞(LMH)上穩(wěn)定增殖。由這個(gè)毒株制備的毒株FAdv-HB滅活疫苗能有效預(yù)防安卡拉病。

2、本發(fā)明制備的疫苗穩(wěn)定性好，試驗(yàn)證明具有良好的安全性，免疫保護(hù)效果達(dá)到100％。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的總體技術(shù)流程圖；

圖2為安卡拉病毒的電鏡圖；

圖3為凝膠電泳圖；

圖中，1:陰性對(duì)照、M：2000Plus Maker、2:PCR產(chǎn)物；

圖4為安卡拉病毒接種LMH細(xì)胞的細(xì)胞病變情況圖；

圖中，4A為正常細(xì)胞對(duì)照?qǐng)D，4B為接毒后細(xì)胞病變圖

圖5為免疫雞與未免疫對(duì)照雞攻毒后剖解的病理變化圖；

圖6為遺傳進(jìn)化分析圖。

具體實(shí)施方式

為了更好地解釋本發(fā)明，以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1 安卡拉滅活疫苗的制備

1、FAdV-HB毒株的分離鑒定

自2013年以來(lái)，湖北，山東，河南多地肉雞場(chǎng)爆發(fā)一種致死率高達(dá)80％的禽病，該病多對(duì)3-5周齡肉雞致死，并且多數(shù)死雞剖檢呈現(xiàn)明顯心包積水和肝炎癥狀。2015年，發(fā)明人在湖北麻城雞場(chǎng)出現(xiàn)嚴(yán)重心包積水和肝炎的病死雞的臟器中成功分離到本株毒。

具體操作步驟如下：

1.1 病毒分離

無(wú)菌采集病死雞病變明顯的臟器(心臟、肝臟)剪碎勻漿后，按1:4(v/v)的比例加入滅菌PBS，反復(fù)凍融3次后3000r/min離心30min，取上清加入青鏈霉素，使終濃度均為10000單位/ml，4℃過(guò)夜。用0.22μm的濾器過(guò)濾除菌，濾過(guò)液無(wú)菌檢驗(yàn)合格后-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。將上濾過(guò)液經(jīng)卵黃囊接種6日齡SPF雞胚，0.2ml/胚，棄24h內(nèi)死胚，取接種48h-168h內(nèi)死亡雞胚的尿囊液和胎兒，用上述方法處理后連續(xù)傳3代，觀察第3代死胚肝臟和病變。死胚胚體縮小，出血，肝臟腫大出血。收集死胚胚體和尿囊液，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 空斑純化

將尿囊液用0.22μm的濾器過(guò)濾除菌。將LMH傳代細(xì)胞接6孔板，使其生長(zhǎng)成無(wú)空隙的單層細(xì)胞。倒掉生長(zhǎng)液，并用PBS液將已長(zhǎng)好的單層細(xì)胞洗2次，2ml PBS/孔/次。加1000倍稀釋的尿囊液懸液0.5mL/孔，并使之均勻布滿于細(xì)胞表面，置37℃吸附1h。吸附結(jié)束后，用PBS液洗2次，2ml PBS/孔/次。加預(yù)溫至46～50℃的1.6％的低熔點(diǎn)瓊脂和2％的無(wú)酚紅的DMEM等體積混合液(加1％的胎牛血清)，2mL/孔，并迅速使其均勻覆蓋于細(xì)胞層，然后4℃放置10min左右。待瓊脂完全凝固，置于37℃溫箱培養(yǎng)3天。當(dāng)肉眼觀察到有局部病灶(即瓊脂下細(xì)胞層中有白色“斑點(diǎn)”)出現(xiàn)后，用中性紅染色液(配制濃度為1％，用時(shí)用無(wú)菌PBS 1:10稀釋?zhuān)靠准?-2mL。染色(避光操作)，并使之均勻布滿于瓊脂層表面，37℃溫箱避光放置1h后，吸去中性紅染色液，即可見(jiàn)紅色背景下無(wú)色的蝕斑。

用白色無(wú)菌槍頭挑選較大的蝕斑于2％胎牛血清的F12維持液中，-80℃保存?zhèn)溆?。同樣的方法接毒挑斑純化至少三代后保留毒液?80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病毒的鑒定

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參照GENEBANK上公布的基因序列，設(shè)計(jì)39對(duì)引物擴(kuò)增病毒全基因組，引物由武漢奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

FADV-1F CATCATCTTATATAACCGCGTCT

FADV-1R CCTCCTCGGATCGTGTCAT

FADV-2F TTGAGCGAATCTTTACACCG

FADV-2R TCCACCATAGTTCCCTCCC

FADV-3F GTGGATTGGCGGAATAGGG

FADV-3R TTGGGTTGACGAAGTAAGAGCA

FADV-4F GCGTCCTTCTTGATCCTCG

FADV-4R CGTCCACCTGTCCTGCTTC

FADV-5F ACTTGTTCGTCTTCGGGTGTC

FADV-5R CCTGTTCCTCCAACTGCCTC

FADV-6F GGATGCTACTCTGGCGTTGT

FADV-6R CGACTCCTTTCGCTGGTG

FADV-7F GCGAGTCTGAGGGAGAAATG

FADV-7R CCACAACGAGCAGCTAACG

FADV-8F GGGGTGTTCGGTGTCGTA

FADV-8R TAGACATCATCACGCTTCACAA

FADV-9F GGGCGTTGCTGAGCATTT

FADV-9R CACCTTACCGTCCGATTTCTA

FADV-10F ATGAAACGCACAAAGACGG

FADV-10R AGACAAGTCGGGAGACATCG

FADV-11F GATGGTATCGCTGTTGGAAGTC

FADV-11R GTCACCGACAGATCCGGATTAC

FADV-12F TATCGCTGTTGGAAGTCGC

FADV-12R AGAGGAGTCGTCGTGGGTC

FADV-13F TCTATACGTGCTTTCGGTGGT

FADV-13R GCTGCGGGTTCAGTTTGA

FADV-14F TATCGCTCGGGACAGGTAGT

FADV-14R GCCGTAGTCGTAGAAGGTGC

FADV-15F TTGCTCCGCTTGTTCGTG

FADV-15R CGGTAAGTGTCCCTTAATAATGG

FADV-16F GCGGAATCAGAGGGTCGGGACT

FADV-16R ATCGGGCACCGTCAGCAAGG

FADV-17F AACGCTGCTCCCCTTTTA

FADV-17R GCCCGTAGTCAGGTCTCG

FADV-18F ACAGACAGGACGGACCAGC

FADV-18R TGCGAACCTAGACGAAACG

FADV-19F GAGATGGTGACGGAGGTG

FADV-19R CCAGTTTCTGTGGTGGTTG

FADV-20F CCAACGCCACTACCAACT

FADV-20R GAAAGCGGTGACGAGGAT

FADV-21F GTGGACCATCCCGTTCAGT

FADV-21R GCATCGAGCAGTGCGTGT

FADV-22F TGTGCGGGTGCTTGTGGT

FADV-22R GCGAGGTAGGAGGCGACTAA

FADV-23F CTGGTCGTCTTCTTCTTCGG

FADV-23R CAGAGTCGCTAGAGTGGCTAAA

FADV-24F CGGTTACTATTCGGCAGATGG

FADV-24R GATAAGCCTCGATGGTTTCCT

FADV-25F CCTTCCATCACGGTTTCG

FADV-25R TGCTCATCTGGTCCTCTTCC

FADV-26F GCCCGAAATCTACAATCCC

FADV-26R ACCTCCCATCATGCCTCC

FADV-27F CAGACCAACAGCCCTACGC

FADV-27R CGAGCACTTTGAGCACCC

FADV-28F GCCACTAAGCAAGCCAACG

FADV-28R CCTGATCCACGAGCAAGGT

FADV-29F ACGATGACTGGGAACTGGC

FADV-29R GGACAAATGGACGATCAATAAA

FADV-30F CCGCTACACCCTTCTATGCT

FADV-30R CGGTCCCTTCTGTGATTGC

FADV-31F CGGAGATTTGCGATTGTGAGT

FADV-31R TGACTCATCATGGGTGTGGC

FADV-32F ACACTAACTTCCTCATTGACCCTC

FADV-32R TGTCTGTCTGAACCTGCCTACC

FADV-33F ACGATGGCGTGATAGGCGGAGC

FADV-33R ATGAACCGTAGCCCCGCCCTTT

FADV-34F ACTACCGAGATCAGCCTGAAGA

FADV-34R CAGACTAAGGGAAAGTTGGAGAA

FADV-35F GAAATGCTTCCTCCTTCACG

FADV-35R AAGTTTATAGGGATCTCGGGTTA

FADV-36F AACCCGAGATCCCTATAAACTT

FADV-36R TAGTGCCTGTCCATTTGCC

FADV-37F TGGCAAATGGACAGGCACT

FADV-37R TTGATTCGGTGGAGGTCGT

FADV-38F CCCACTACCGCTACCACCAC

FADV-38R ATCACGCTGACGCTCCTCC

FADV-39F AGCATGAATCAACTCGGTGTC

FADV-39R CATCATCTTATATAACCGCGTCT。

1.2.2 病毒基因組的提取

取1ml收獲的雞胚尿囊液12,000r/min(4℃)離心10min，除去雜質(zhì)，收集上清。參照北京全式金EsayPure Viral DNA/RNA Kit說(shuō)明書(shū)提取病毒基因組，最后每200μl尿囊液的病毒DNA用20μlDEPC水溶解。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系如下：基因組3μl，10×Trans Buffer 5μl，dNTP 3μl，TransTaq DNA Polymerase 1μl，上、下游引物各2μl，補(bǔ)H₂O至50μl。按以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃變性5min后進(jìn)行94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min的35個(gè)循壞，最后72℃延伸10min，保存于16℃。PCR產(chǎn)物用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序分析

將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂凝膠回收后，連接pMD-18T載體，篩選2個(gè)陽(yáng)性克隆送武漢奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)遺傳進(jìn)化分析后，確定本發(fā)明的分離株為安卡拉病毒C種基因4型(進(jìn)化分析圖)。將該毒株命名為I群禽腺病毒株FAdv-HB，于2017年1月3日送交中國(guó).武漢.武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號(hào)為：CCTCC NO：V201703。

2 FAdV-HB株的特性

2.1 血凝特性試驗(yàn)

紅細(xì)胞凝集特性：無(wú)菌采集SPF雞、雞以及大鼠的血液5ml，制備雞紅細(xì)胞和雞紅細(xì)胞以及鼠紅細(xì)胞，4℃?zhèn)溆?。用常?guī)方法檢測(cè)分離的病毒株是否具有凝集這些紅細(xì)胞的特性。結(jié)果：分離毒株對(duì)這些紅細(xì)胞均無(wú)凝集特性。

2.2 理化特性檢驗(yàn)

分離毒株FAdV-HB株的理化特性：根據(jù)《動(dòng)物病毒學(xué)》介紹的方法，將病毒液分別用5-溴尿嘧啶-2’-脫氧核苷(BUDR)、氯仿、乙醚、鹽酸(pH3.0)、氫氧化鈉(pH10.0)以及溫度(60℃，1h)處理后，另設(shè)PBS處理的病毒液為對(duì)照組，接種雞胚(0.2ml/胚)，觀察雞胚病變，并4d后取尿囊液和組織PCR檢測(cè)。若雞胚無(wú)明顯病變，且PCR檢測(cè)為陰性則為陰性，否則為陽(yáng)性。結(jié)果：分離毒株經(jīng)BUDR、氫氧化鈉(pH10.0)和溫度(60℃，1h)處理后，PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性，表明分離毒株的核酸類(lèi)型為DNA，病毒不耐堿、不耐熱，60℃處理1h后即可被滅活；而經(jīng)氯仿、乙醚、鹽酸(pH3.0)以及PBS處理后，PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，表明病毒沒(méi)有脂質(zhì)囊膜，對(duì)乙醚和氯仿有抵抗力，耐酸。

2.3 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

按“中華人民共和國(guó)獸藥典”第三部(中國(guó)獸藥典委員會(huì)編，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010版，以下簡(jiǎn)稱(chēng)“中國(guó)獸藥典”)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)用含0.01％硫柳汞的PBS制備1％瓊脂平板，并在其上按六角形方法打孔，孔徑為5mm，孔距為3mm。加樣時(shí)，中央孔滴加抗原，周?chē)椎渭又苽涞陌部ɡ《緲?biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清以及制備的標(biāo)準(zhǔn)陰性血清?？乖c陽(yáng)性血清的滴加量均以孔滿為度。加樣后，將瓊脂平板置15～30℃反應(yīng)48～72小時(shí)判定。抗原與制備的安卡拉病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清形成明顯的沉淀線，與制備的安卡拉病毒標(biāo)準(zhǔn)陰性血清未形成沉淀線。

2.4 回歸試驗(yàn)

選擇5周齡安卡拉病毒抗體陰性雛雞共10只對(duì)分離FAdV-HB株進(jìn)行回歸試驗(yàn)。選取5只雞大腿內(nèi)側(cè)肌肉接種病毒，每只0.2ml(2.5×10^-4TCID₅₀/ml)，選取5只雞做為空白對(duì)照組，注射等量的PBS。將感染試驗(yàn)雞和空白對(duì)照雞分別置于不同雞欄飼養(yǎng)，每天觀察各組雞的采食飲水、精神狀態(tài)等，感染后第15日剖殺所有雞，觀察各個(gè)臟器的病理變化，無(wú)菌采集病料，對(duì)病料進(jìn)行處理后提取病毒基因組進(jìn)行PCR鑒定。

根據(jù)安卡拉病Hexon基因保守序列設(shè)計(jì)出一對(duì)鑒定引物，擴(kuò)增片段為564bp，引物序列如下：

F：5’-TGCTCGTTG TGGATGGTGAA-3’

R：5’-CTC CGTGTTGGGCT GGTC-3’；

PCR反應(yīng)體系如下：基因組2μl，10×Trans Buffer 2.5μl，TransTaq DNA Polymerase 0.5μl，上、下游引物各1μl，補(bǔ)H2O至25μl。反應(yīng)程序如下：95℃變性5min后進(jìn)行94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s的35個(gè)循壞，最后72℃延伸10min，保存于16℃。PCR產(chǎn)物用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

感染后逐日觀察，記錄雞的臨床表現(xiàn)。第3天開(kāi)始部分感染雞逐漸出現(xiàn)臨床癥狀，主要表現(xiàn)為采食量下降，精神沉郁，站立不穩(wěn)；病雞逐漸臥地不起，不再采食，突然倒地死亡，死亡多發(fā)生在夜間；第4天和第5天為死亡的高峰期，從第6天開(kāi)始病雞群逐漸恢復(fù)精神和食欲，不再死亡。對(duì)照組雞食欲及精神狀況表現(xiàn)正常，未有死亡。對(duì)死亡的雞進(jìn)行剖檢可觀察到：心包腔積有清亮或淡黃色的水樣，肝臟表面有局灶性壞死。第10天剖檢所有未死亡的感染試驗(yàn)雞和空白對(duì)照雞，感染實(shí)驗(yàn)組部分雞同樣可觀察到心包腔積有清亮或淡黃色的水樣，肝臟表面有局灶性壞死，而剖檢對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)臟器病理變化。對(duì)所有試驗(yàn)雞的臟器經(jīng)過(guò)勻漿處理后，凍融三次，根據(jù)安卡拉病毒Hexon基因設(shè)計(jì)鑒定引物，并對(duì)組織進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出來(lái)564bp大小的目的片段，說(shuō)明感染的病毒在雞體內(nèi)得到了復(fù)制，是引起雞發(fā)病的致病原。

2.5 毒種傳代試驗(yàn)

將分離到的安卡拉病毒株按常規(guī)方法在雞肝癌細(xì)胞(LMH)上進(jìn)行傳代，當(dāng)傳到第10代時(shí)，病毒的含量可達(dá)到10^7.5TCID₅₀/ml。將LMH第10代的病毒液記為H1代，一直傳到H6代，并測(cè)定每一代病毒的含量，均可達(dá)到10^7.0TCID₅₀/ml。

2.6 純凈性試驗(yàn)

2.6.1 無(wú)菌檢驗(yàn) 將上述步驟2.5得到的H6代毒種按照“中國(guó)獸藥典”規(guī)定的方法進(jìn)行，利用硫乙酸鹽培養(yǎng)基(檢查T(mén).G，參見(jiàn)中國(guó)獸藥典第三部)、酪胨瓊脂斜面(簡(jiǎn)稱(chēng)G.A，參見(jiàn)中國(guó)獸藥典第三部)和葡萄糖蛋白胨湯(簡(jiǎn)稱(chēng)G.P，參見(jiàn)中國(guó)獸藥典第三部)進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。

2.6.2 支原體檢驗(yàn) 將安卡拉病毒的H6代毒種接種改良Frey氏培養(yǎng)基(參見(jiàn)中國(guó)獸藥典第三部)，按“中國(guó)獸藥典”規(guī)定方法進(jìn)行檢驗(yàn)。

2.6.3 外源病毒檢測(cè) 安卡拉病毒基礎(chǔ)種子批病毒液，進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)c安卡拉病毒高免陽(yáng)性血清進(jìn)行中和，中和后的病毒液按現(xiàn)行中國(guó)獸藥典規(guī)定的方法進(jìn)行外源病毒檢測(cè)。

雞胚檢查法和細(xì)胞檢查法檢測(cè)禽流感病毒和新城疫病毒顯示安卡拉病毒基礎(chǔ)種子批血凝試驗(yàn)為陰性，也未出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，表明該H6代次毒未受到禽流感病毒和新城疫病毒的污染；ELISA法檢測(cè)禽淋巴白血病病毒顯示安卡拉病毒基礎(chǔ)種子批S/P值小于0.2，表明該H6代次未受到禽淋巴白血病病毒的污染。結(jié)果表明安卡拉病毒基礎(chǔ)種子批無(wú)細(xì)菌、支原體、外源病毒污染。結(jié)果見(jiàn)表1，表明本發(fā)明所涉及的病毒是純凈的。

2.6.4 FAdV-HB株病毒含量測(cè)定 將LMH細(xì)胞用0.25％的胰酶消化，用含有10％胎牛血清的F12培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打下來(lái)，取合適的細(xì)胞量鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl，置37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞形成單層后，用含有2％胎牛血清的F12細(xì)胞維持液在滅菌離心管中將病毒液作10^-1～10^-10連續(xù)10倍的稀釋?zhuān)瑢⑾♂尯玫牟《疽航臃N到96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排共8孔，每孔接種100μl；同時(shí)設(shè)立不接毒的正常細(xì)胞對(duì)照，37℃培養(yǎng)3～4d，在倒置顯微鏡下觀察結(jié)果，按Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)感染量(TCID₅₀)。

距離比例＝(高于50％病變率的百分?jǐn)?shù)-50％)/(高于50％病變率的百分?jǐn)?shù)-低于50％病變率的百分?jǐn)?shù))

lgTCID₅₀＝距離比例×稀釋度對(duì)數(shù)之間的差+高于50％病變率的稀釋度的對(duì)數(shù)。

表1 安卡拉病毒HB株H6代毒種純凈、病毒含量檢測(cè)結(jié)果

2.6.5 免疫原性試驗(yàn)取第H6代的病毒液，滅活前病毒含量應(yīng)≥10^7.0TCID₅₀/ml，滅活后按本規(guī)程制成疫苗。將20只3日齡白來(lái)航雞(SPF雞)隨機(jī)分成兩組，每組10只。免疫組頸部皮下接種該疫苗0.3ml/只，免疫四周后采血分離血清，并用ELISA方法檢測(cè)每只雞的抗體水平。采血分離血清后接種FAdV-HB株0.2ml(病毒含量為2.5×10^-4.5TCID₅₀)并觀察發(fā)病及死亡情況。在感染第10日剖殺所有雞，觀察記錄心臟及肝臟組織病理變化，根據(jù)發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。空白組同樣方法注射等量PBS。結(jié)果顯示免疫組10/10都能得到保護(hù)，而對(duì)照組有8/10發(fā)病。表明該代基礎(chǔ)種子病毒免疫原性良好，具有較好的保護(hù)效果。

發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)：

(1)雞群出現(xiàn)精神沉郁、食欲減退，行動(dòng)蹣跚、臥地不起等癥狀

(2)攻毒后10天內(nèi)死亡。

(3)對(duì)攻毒后10天，未死的雞進(jìn)行剖檢，出現(xiàn)心包積液或肝臟出血。

以上三項(xiàng)出現(xiàn)任意一項(xiàng)判為發(fā)病。

攻毒試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2所述。

表2 安卡拉病毒HB毒株代免疫原性測(cè)定結(jié)果

注：“-”表示沒(méi)有發(fā)病，“+”表示發(fā)病

2.6.6 特異性試驗(yàn)

經(jīng)安卡拉病毒特異性血清中和后，F(xiàn)AdV-HB株H6代病毒液接種已長(zhǎng)滿80％的雞肝癌細(xì)胞(LMH)，72小時(shí)后細(xì)胞未出現(xiàn)病變，未經(jīng)安卡拉病毒特異性血清中和的病毒液接種的細(xì)胞出現(xiàn)病變。表明病毒完全被安卡拉病毒特異性血清中和。分別經(jīng)禽流感(H9)病毒特異性血清、新城疫病毒特異性血清、禽白血病病毒特異性血清中和后，F(xiàn)AdV-HB株H6代病毒液接種已長(zhǎng)滿80％的LMH細(xì)胞，72小時(shí)后細(xì)胞出現(xiàn)病變，表明病毒不能被安卡拉病毒特異性血清中和，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 特異性試驗(yàn)

2.6.7 對(duì)雞的毒力試驗(yàn)

將已知病毒含量的H6代病毒液每0.2ml/只，(病毒含量為2.5×10^-4.5TCID₅₀)，腿部肌肉接種3周齡雛雞10只，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組10只。觀察感染后的試驗(yàn)組合對(duì)照組的死亡情況，并在感染10日后剖殺所有試驗(yàn)雞，觀察記錄心臟及肝臟病理變化，根據(jù)制定的發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，感染組發(fā)病數(shù)達(dá)到9/10，空白對(duì)照組發(fā)病數(shù)為0/10。結(jié)果表明FAdV-HB株H6代基礎(chǔ)種子病毒液有較強(qiáng)的毒力。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 H6代病毒液對(duì)雞的毒力試驗(yàn)結(jié)果

注：“-”表示沒(méi)有發(fā)病，“+”表示發(fā)病

3 安卡拉病毒病滅活疫苗的制備

3.1 制苗用病毒液的制備

3.1.1 傳代

制苗材料的選擇：選擇用雞肝癌細(xì)胞(LMH)作為制苗材料。

細(xì)胞傳代：將細(xì)胞從液氮罐中取出，37℃水浴使其融化，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層時(shí)，加入0.25％EDTA的胰酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代擴(kuò)大細(xì)胞。

選取長(zhǎng)勢(shì)良好的細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至80％時(shí)，棄掉原培養(yǎng)基，加入生產(chǎn)用毒種，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞病變達(dá)到80％以上時(shí)，收獲細(xì)胞，-80度冰箱反復(fù)凍融3次備用。

3.1.2 病毒含量的測(cè)定 參照2.4.4測(cè)定病毒的含量，每毫升的病毒含量應(yīng)≥10^7.0TCID₅₀。

3.2 滅活 向檢測(cè)合格的病毒液中加入甲醛溶液，使甲醛溶液的終濃度為0.2％，邊加邊搖，使其充分混合，然后置37℃條件下滅活，從抗原液溫度升至37℃開(kāi)始計(jì)時(shí)，滅活24小時(shí)。滅活完畢后，對(duì)滅活后的病毒液取樣，進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)及滅活檢驗(yàn)，取樣后置2～8℃保存，應(yīng)不超過(guò)30日。

3.3 半成品檢驗(yàn)

3.3.1 無(wú)菌檢驗(yàn) 取滅活的病毒液按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。

3.3.2 滅活檢驗(yàn)

取滅活的病毒接種6日齡SPF雞胚，每枚0.2ml，置相對(duì)濕度60％-65％、溫度37℃條件下孵育。24h內(nèi)死亡雞胚不計(jì)，收獲尿囊液。提取病毒基因組，PCR鑒定，應(yīng)沒(méi)有預(yù)期條帶。同時(shí)設(shè)有同批未經(jīng)滅活的病毒液作為對(duì)照，應(yīng)出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶。并盲傳1代，PCR鑒定如沒(méi)有預(yù)期條帶，即為滅活完全。

3.4 油乳劑滅活苗的制備

3.4.1 油相制備 取油94份(以毫升為單位)，加入硬脂酸鋁2份(以克為單位)，邊加熱邊攪拌，直到透明為止，再加入6份司本80(以毫升為單位)，充分混勻，高壓滅菌后冷卻至室溫備用。

3.4.2 水相制備 取檢驗(yàn)合格的滅活病毒液，使每羽份終產(chǎn)品中抗原含量≥1.7×10^7.0EID₅₀。按每100份病毒液加入4份滅菌的吐溫80，直到吐溫80徹底溶解。

3.4.3 乳化 將1份油相注入乳化罐內(nèi)，慢速攪拌同時(shí)緩緩加入1份水相，加完后，中速混合，然后高速乳化。在乳化終止前加入1％硫柳汞液，使其終濃度為0.01％。

3.4.4 分裝 將乳化好的疫苗定量分裝，加蓋密封。貼標(biāo)簽，置2～8℃保存。

4 成品檢驗(yàn)

4.1 性狀

外觀 乳白色乳狀液。

劑型 為油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第一滴呈云霧狀擴(kuò)散外，以后各滴均不應(yīng)擴(kuò)散。

穩(wěn)定性 取10ml疫苗裝于試管內(nèi)，以3500r/min離心15分鐘，應(yīng)不出現(xiàn)破乳現(xiàn)象，但允許出現(xiàn)輕微分層，管底析出水相層深度不超過(guò)0.5ml為合格。

粘度 用1ml吸管(下口內(nèi)徑為1.2mm,上口內(nèi)徑為2.7mm)，吸取25℃左右的疫苗lml，令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需時(shí)間，應(yīng)不超過(guò)8秒。

4.2 無(wú)菌檢驗(yàn) 按《中國(guó)獸藥典》附錄15頁(yè)進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。

4.3 安全檢驗(yàn) 頸部皮下免疫1-3日齡安卡拉病毒抗體陰性雞(S/P＜0.5)10只，每只0.3ml，觀察14日，結(jié)果顯示無(wú)不良反應(yīng)，且全部健活。

4.4 效力檢驗(yàn) 可采用血清學(xué)方法和免疫保護(hù)性試驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。

血清學(xué)方法選取1-3日齡安卡拉病毒抗體陰性雞(S/P＜0.5)10只，每只頸部皮下接種疫苗0.3ml。14日后，連同相同條件下飼養(yǎng)的非免疫對(duì)照雞10只，分別采血分離血清，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清抗體，10只免疫雞的抗體均為陽(yáng)性(S/P≥0.5)，10只非免疫對(duì)照雞的抗體均為陰性(S/P＜0.5)。

免疫保護(hù)性試驗(yàn) 選1-3日齡安卡拉病毒抗體陰性雞(S/P＜0.5)10只，每只肌肉注射疫苗0.3ml。免疫14日后，連同非免疫對(duì)照雞10只用FAdV-HB株進(jìn)行腿部部肌肉接種，每只0.2ml(病毒含量為2.5×10^-4.5TCID₅₀)，感染后第10日剖殺所有雞觀察心臟及肝臟病理變化，統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。免疫雞應(yīng)至少8只保護(hù)，對(duì)照組應(yīng)至少8只發(fā)病。

發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)：

(1)出現(xiàn)精神不振、行動(dòng)蹣跚、臥地不起、羽毛雜亂等

(2)攻毒后10天內(nèi)死亡。

(3)對(duì)攻毒后10天，未死的雞進(jìn)行剖檢，出現(xiàn)心包積液或肝臟出血。

以上三項(xiàng)出現(xiàn)任意一項(xiàng)判為發(fā)病。

實(shí)施例2 安卡拉病毒病活疫苗的安全性試驗(yàn)

1 疫苗與試驗(yàn)動(dòng)物

用本發(fā)明人試制的安卡拉滅活疫苗，批號(hào)分別為0101、0102、0103。供試用的雞品種為白來(lái)航，由山東濟(jì)南斯派福瑞禽業(yè)科技有限公司提供。

2 疫苗的安全性試驗(yàn)

本實(shí)施例檢測(cè)了以上3批實(shí)驗(yàn)室疫苗的安全性，對(duì)白來(lái)航雛雞進(jìn)行免疫，用于檢測(cè)該批實(shí)驗(yàn)室疫苗對(duì)白來(lái)航雛雞的安全性，包括疫苗對(duì)白來(lái)航雛雞一次單劑量接種的安全性、單劑量重復(fù)接種的安全性和一次超劑量接種的安全性。

2.1 對(duì)白來(lái)航雛雞一次單劑量接種的安全性

將三批疫苗以單劑量分別接種1-3日齡雛雞(白來(lái)航)后，雛雞采食、臨床癥狀等均表現(xiàn)正常，未見(jiàn)異常變化，疫苗免疫后14日接種部位也未見(jiàn)異常變化，說(shuō)明該疫苗對(duì)白來(lái)航雛雞單劑量接種安全性好。(表5)

表5 三批疫苗單劑量接種白來(lái)航雛雞的安全性檢測(cè)

2.2 對(duì)白來(lái)航雛雞單劑量重復(fù)接種的安全性

將三批疫苗以單劑量分別接種1-3日齡白來(lái)航雛雞后，間隔14日后每只再以單劑量重復(fù)接種0.3ml疫苗，繼續(xù)觀察14日，觀察雞群的臨床癥狀及采食，結(jié)果顯示白來(lái)航雛雞在單劑量重復(fù)接種疫苗后采食、臨床癥狀等均表現(xiàn)正常，未見(jiàn)異常變化，疫苗免疫后28日接種部位也未見(jiàn)異常變化，說(shuō)明該疫苗對(duì)白來(lái)航雛雞單劑量重復(fù)接種安全性好。(表6)

表6 三批疫苗單劑量重復(fù)接種白來(lái)航雛雞的安全性檢測(cè)

2.3 對(duì)白來(lái)航雛雞一次超劑量接種的安全性

將三批疫苗以超劑量分別接種1-3日齡白來(lái)航雛雞后，雛雞采食、臨床癥狀等均表現(xiàn)正常，未見(jiàn)異常變化，疫苗免疫后14日接種部位也未見(jiàn)異常變化，說(shuō)明該疫苗對(duì)雛雞一次超劑量接種安全性好。(表7)

表7 三批疫苗一次超劑量劑量接種白來(lái)航雛雞的安全性檢測(cè)

實(shí)施例3 安卡拉滅活疫苗的疫苗效力試驗(yàn)

1 安卡拉滅活疫苗與試驗(yàn)動(dòng)物

用本發(fā)明人試制的3批安卡拉滅活疫苗，批號(hào)分別為0101、0102、0103。安卡拉病毒抗體陰性的1-3日齡健康雛雞為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，由濟(jì)南斯派福瑞禽業(yè)科技有限公司提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

將40只1-3日齡健康雛雞隨機(jī)分為4組，每組10只，實(shí)驗(yàn)室制備的三批疫苗(批號(hào)為0101、0102、0103)每批免疫1組，每只腿部肌肉注射疫苗0.3ml。剩下1組為相同條件下的非免疫對(duì)照。

3 免疫保護(hù)性試驗(yàn)

3.1 抗體水平檢測(cè)

免疫14日后對(duì)30只免疫抗體監(jiān)測(cè)組雞群連同非免疫對(duì)照雞10只進(jìn)行翅靜脈采血，待血清析出后3000rpm離心5min分離血清，血清-20℃保存或立即用I型禽腺病毒ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)抗體水平。

結(jié)果顯示三批疫苗免疫雞的抗體水平(S/P值)都能達(dá)到0.5以上，其中0101批疫苗免疫雞平均抗體(S/P值)為2.209，0102批疫苗免疫雞平均抗體(S/P值)為2.187，0103批疫苗免疫雞平均抗體(S/P值)為2.172，表明三批疫苗都能產(chǎn)生較高的抗體水平，且三批疫苗免疫雞產(chǎn)生的抗體水平基本一致，無(wú)顯著批間差異(P>0.05)。(結(jié)果見(jiàn)表8)

3.2 免疫保護(hù)力試驗(yàn)

免疫14日采血后，三個(gè)免疫組連同對(duì)照組共40只雞，于腿部肌肉接種FAdV雞胚適應(yīng)毒株0.2ml(病毒含量為2.5×10^-4.5TCID₅₀)。感染10日后剖殺所有雞并觀察記錄心臟及肝臟的組織病理變化，根據(jù)制定的發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。非免疫對(duì)照組雞會(huì)出現(xiàn)采食量下降，精神沉郁，站立不穩(wěn)；病雞逐漸臥地不起，不再采食等臨床癥狀，10日后剖殺雞會(huì)出現(xiàn)安卡拉的典型病理變化，如心包腔積有清亮或淡黃色的水樣，肝臟表面有局灶性壞死(見(jiàn)圖5)。根據(jù)制定的發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)各組雞的發(fā)病情況以及疫苗的保護(hù)力。

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示0101批次的疫苗能使8/10的試驗(yàn)雞得到保護(hù)，0102批次的疫苗能使9/10的試驗(yàn)雞得到保護(hù)，0103批次的疫苗能使8/10的試驗(yàn)雞得到保護(hù)，而非免疫對(duì)照組8/10發(fā)病。結(jié)果表明三個(gè)批次的疫苗都能產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)效果(結(jié)果見(jiàn)表8)。

發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)：

(1)出現(xiàn)精神不振、行動(dòng)蹣跚、臥地不起、羽毛雜亂等

(2)攻毒后10天內(nèi)死亡。

(3)對(duì)攻毒后10天，未死的雞進(jìn)行剖解觀察病變，若出現(xiàn)心包積液或肝臟出血。以上三項(xiàng)出現(xiàn)任意一項(xiàng)判為發(fā)病。

表8 三批疫苗免疫35日后ELISA抗體水平及攻毒保護(hù)情況

注：“-”表示沒(méi)有發(fā)病，“+”表示發(fā)病

其它未詳細(xì)說(shuō)明的部分均為現(xiàn)有技術(shù)。盡管上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做出了詳盡的描述，但它僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，人們還可以根據(jù)本實(shí)施例在不經(jīng)創(chuàng)造性前提下獲得其他實(shí)施例，這些實(shí)施例都屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。