專利名稱：凍干劑型艾滋病重組痘病毒安卡拉株載體疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制品技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及利用重組MVA病毒作為表達(dá)載體的冷凍干燥劑型疫苗的制備。
背景技術(shù)：
艾滋病(HIV)被認(rèn)為是世界上直接威脅人類健康的第一大傳染病。95％以上的HIV感染者發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。迄今為止，宣傳教育及對(duì)高危行為的干預(yù)僅起到減緩傳播速度的作用，而無(wú)法終止其流行。高效抗病毒療法對(duì)大多數(shù)感染者來(lái)說(shuō)價(jià)格昂貴并且過(guò)于復(fù)雜，此外，還不能達(dá)到徹底清除體內(nèi)病毒的目的。在這種情況下，只有艾滋病疫苗才能真正有效地預(yù)防和控制艾滋病。特別是需要接種到安全的、免疫原性強(qiáng)的、高效的艾滋病疫苗。
近年來(lái)，活載體疫苗的研究受到越來(lái)越多的重視?；钶d體疫苗是將編碼病毒蛋白的基因插入活的病毒載體，通過(guò)病毒使外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)，由此刺激機(jī)體產(chǎn)生更廣的特異的免疫應(yīng)答，這可能是最有希望用于預(yù)防人類AIDS的疫苗之一。其主要優(yōu)點(diǎn)是能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
人們?nèi)遮呉恢抡J(rèn)為有效的HIV疫苗不是單一疫苗模式，多種不同疫苗混合應(yīng)用有可能達(dá)到任何單一形式的疫苗難以達(dá)到的理想效果。許多研究者提出Prime-Boost策略，既用一種疫苗初始免疫，再用另一種疫苗加強(qiáng)免疫。通常是DNA疫苗和活載體疫苗或蛋白類疫苗聯(lián)合應(yīng)用類似艾滋病治療中的聯(lián)合用藥。因此，研制出單一使用及能與VLPs疫苗或DNA疫苗聯(lián)合使用的HIV活載體疫苗應(yīng)是HIV疫苗研究的重要領(lǐng)域。常用來(lái)作載體的病毒有，委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、痘苗病毒、金絲雀痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒及腺病毒等。最有希望的結(jié)果是以痘病毒作為載體的疫苗。
修飾的痘病毒安卡拉(Ankara)株(即Modified Vaccinia Virus Ankara，縮寫(xiě)為MVA)為人體內(nèi)復(fù)制缺陷型痘病毒，是線性雙鏈DNA病毒。德國(guó)教授Anton Mayr領(lǐng)導(dǎo)的研究小組將從Ankara地區(qū)分離得到的痘病毒CVA株，在雞胚成纖維細(xì)胞中傳代致弱。當(dāng)傳到516代時(shí)，這株致弱毒株被命名為MVA(Modified Vaccinia Ankara)。MVA免疫原性好，同時(shí)在近600次的傳代過(guò)程中，MVA丟失了9％的基因組DNA，MVA對(duì)細(xì)胞的毒性也極大地降低。MVA的繁殖對(duì)細(xì)胞基質(zhì)具有極大的依賴性，它只能在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)和BHK細(xì)胞中有效復(fù)制，而不能在人類等哺乳細(xì)胞中繁殖。所以MVA雖然在人體內(nèi)能感染人體細(xì)胞，表達(dá)出MVA病毒蛋白及其攜帶的外源基因蛋白，但是卻不能形成完整病毒顆粒。這一特點(diǎn)為MVA成為安全，高效的表達(dá)載體奠定了良好的基礎(chǔ)。
因此，MVA作為病毒載體，具備許多優(yōu)點(diǎn)。如(1)外源基因容量大，MVA不但能夠表達(dá)大的外源基因，而且能夠同時(shí)容納，表達(dá)多個(gè)外源基因，從而可以同時(shí)刺激產(chǎn)生針對(duì)多種抗原的免疫反應(yīng)或表達(dá)免疫輔助因子，誘導(dǎo)產(chǎn)生高效保護(hù)反應(yīng)；(2)表達(dá)水平高；(3)感染多種細(xì)胞，使抗原有效地提呈到不同的組織；(4)同時(shí)MVA還具有獨(dú)特的安全性。
因而MVA成為目前最廣泛用于人類疫苗和基因治療研究的病毒載體之一。以MVA為載體構(gòu)建重組疫苗，表達(dá)重要的基因產(chǎn)物，均是目前醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、獸醫(yī)學(xué)等研究的熱門(mén)課題。
但是，MVA病毒對(duì)反復(fù)凍融敏感，容易失活。目前的MVA載體疫苗為液體劑型，在使用過(guò)程中的關(guān)鍵問(wèn)題是由于熱穩(wěn)定性較差，從生產(chǎn)場(chǎng)地到使用現(xiàn)場(chǎng)均要求疫苗嚴(yán)格的冷鏈，于-20℃以下冷凍貯藏和運(yùn)輸，并要避免反復(fù)凍融。如果保存和運(yùn)輸不能嚴(yán)格冷鏈，致使疫苗的病毒滴度下降，影響接種效果，還會(huì)增加生產(chǎn)及使用部門(mén)的費(fèi)用，給疫苗的大規(guī)模推廣應(yīng)用及保證疫苗的接種效果帶來(lái)困難。
生物技術(shù)藥物的基本劑型是凍干劑型。凍干活疫苗由于能較好地克服液體疫苗穩(wěn)定性較差的問(wèn)題，應(yīng)用前景會(huì)更為廣闊。迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚未有能夠大規(guī)模應(yīng)用于人體的凍干劑型的艾滋病(HIV)重組MVA病毒載體疫苗。以MVA作為表達(dá)載體的其它形式的重組病毒載體疫苗也未見(jiàn)有凍干制劑的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于提供一種安全、高效、穩(wěn)定性好、有效期長(zhǎng)的艾滋病重組MVA病毒載體疫苗新劑型——即含有冷凍干燥保護(hù)劑的凍干劑型的HIV重組MVA病毒載體疫苗的制備方法。
本發(fā)明的冷凍干燥HIV重組MVA病毒載體疫苗(簡(jiǎn)稱HIV-MVA疫苗)，包括HIV重組MVA病毒和保護(hù)劑及其平衡鹽溶液。
冷凍干燥劑型HIV-MVA疫苗，其中保護(hù)劑的成分及它們?cè)诮M合物懸液中的終濃度(W/V)是海藻糖2～4％、甘露醇1～3％、右旋糖苷2％、肌醇0.5～1％。
右旋糖苷可以是高，中，低分子的右旋糖苷，如右旋糖苷70，40，20；優(yōu)選低分子的右旋糖苷20。
海藻糖、甘露醇、右旋糖苷均優(yōu)選醫(yī)用規(guī)格制品。
冷凍干燥劑型HIV-MVA疫苗，其中所用的平衡鹽溶液使用磷酸鹽溶液(PB)或磷酸鹽生理氯化鈉溶液(PBS)，PH值為7.0～7.7。優(yōu)選可耐高溫滅菌的磷酸鹽溶液。
凍干劑型艾滋病重組痘病毒安卡拉株載體疫苗的制備方法，有混料和真空冷凍干燥兩個(gè)過(guò)程；所說(shuō)的混料過(guò)程是，在平衡鹽溶液中加入保護(hù)劑，按每100ml平衡鹽溶液加入5～10g保護(hù)劑的比例溶解后過(guò)濾，再按每0.1ml溶液中含107～1010病毒量的比例加入艾滋病重組痘病毒安卡拉株病毒的濃縮液，得到疫苗液灌裝，保護(hù)劑組成按質(zhì)量比為海藻糖∶甘露醇∶右旋糖苷∶肌醇＝2～4∶1～3∶2∶0.5～1；所說(shuō)的冷凍干燥過(guò)程是，將疫苗液于-35℃～-40℃低溫條件下，預(yù)冷凍3～4小時(shí)，然后在擱板溫度-30℃～-32℃，真空度為9～12Pa下，干燥10～12小時(shí)，待制品完全成型后，使擱板溫度逐漸升至28℃，真空度為9～12Pa下再干燥4～5小時(shí)。
所得到的冷凍干燥劑型HIV-MVA疫苗產(chǎn)品，外觀良好，呈白色疏松體，殘余水分小于或等于3％(g/g)，活的HIV重組MVA病毒的滴度不低于7LgPFU/ml。
本發(fā)明的凍干劑型艾滋病重組痘病毒安卡拉株載體疫苗的制備方法還適用于其它利用MVA作為表達(dá)載體的冷凍干燥劑型疫苗的制備。例如，2002年就已進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)的腫瘤疫苗MVA-Mucl-Il2、狂犬病毒基因重組MVA疫苗、乙型肝炎病毒基因HBsAg重組MVA疫苗等。
本發(fā)明的重組MVA病毒在凍干狀態(tài)下得到更好的保護(hù)，疫苗穩(wěn)定性能好，費(fèi)用低，容易進(jìn)行生產(chǎn)和使用。4～8℃有效期為18個(gè)月以上，在4～8℃保存兩年后，仍能保持凍干后的外觀；克服了液體疫苗低溫凍結(jié)保存及運(yùn)輸過(guò)程中嚴(yán)格冷鏈，有效期短的缺點(diǎn)。本發(fā)明的方法還適用于其它利用重組MVA病毒作為表達(dá)載體的冷凍干燥劑型疫苗的制備，具有一定的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益和實(shí)施價(jià)值。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1
冷凍干燥劑型HIV-MVA疫苗的制備方法是在100毫升PH值在7.0～7.7的磷酸鹽溶液(PB)中，加入海藻糖3克，甘露醇2克，右旋糖苷2克，肌醇0.8克。充分溶解后，用孔徑0.22um濾膜過(guò)濾除菌，再將HIV重組MVA病毒濃縮液按每人份接種病毒量108比例加入到上述含有冷凍干燥劑的溶液中進(jìn)行灌裝，每支安瓶分裝0.1毫升后，開(kāi)始進(jìn)行真空冷凍干燥。將疫苗液于-35℃低溫條件下，預(yù)冷凍3.5小時(shí)，然后在擱板溫度-31℃，真空度為10Pa下，第一階段干燥10～12小時(shí)。待制品完全成型后，使擱板溫度逐漸升至28℃，真空度為10Pa下再二次干燥4.5小時(shí)。干燥結(jié)束即制成冷凍干燥劑型HIV-MVA疫苗。
右旋糖苷優(yōu)選低分子的右旋糖苷20。
實(shí)施例2將實(shí)施例1中的磷酸鹽溶液(PB)用PH值在7.0～7.7的磷酸鹽生理氯化鈉溶液替代，效果與實(shí)施例1相同。
將實(shí)施例1中的預(yù)冷凍溫度改為-40℃；或?qū)⒄婵斩雀臑?2Pa，所得產(chǎn)品與實(shí)施例1相同。
將實(shí)施例1中的保護(hù)劑中海藻糖和甘露醇的用量在100毫升的磷酸鹽溶液(PB)中多或少使用1g，不影響制成冷凍干燥劑型HIV-MVA疫苗的效果。
實(shí)施例3將含有疫苗凍干保護(hù)劑的HIV-MVA疫苗，按每人份分裝量0.1ml，內(nèi)含病毒量6.0LgPFU～7.0LgPFU，一部分于4℃保存，用來(lái)檢測(cè)疫苗凍干前的感染性滴度；另一部分疫苗用來(lái)進(jìn)行冷凍干燥。四個(gè)不同批號(hào)的含有疫苗凍干保護(hù)劑的HIV-MVA疫苗經(jīng)冷凍干燥后，再檢測(cè)疫苗的感染性滴度，與凍干前的感染性滴度相比較。
表1疫苗凍干前后的滴度比較

感染性滴度檢測(cè)表明凍干后感染性滴度比凍干前平均下降值僅在0.12個(gè)LgPFU/ml左右。
實(shí)施例4同一批號(hào)的，凍干的HIV-MVA疫苗和未經(jīng)凍干的液體對(duì)照苗，存放在同一4℃～8℃冰箱內(nèi)，定期隨機(jī)取樣檢測(cè)疫苗的感染性滴度。
表2 HIV-MVA疫苗4℃～8℃保存感染性滴度測(cè)定

結(jié)果說(shuō)明，冷凍干燥劑型HIV-MVA疫苗具有良好的穩(wěn)定性，在4℃條件下存放17個(gè)月，疫苗感染性滴度下降約0.5LgPFU/ml。而未經(jīng)冷凍干燥的液體對(duì)照苗存放2個(gè)月后感染性滴度就明顯下降，下降值約達(dá)到1.3LgPFU/ml。
實(shí)施例5表3 HIV-MVA疫苗37℃加速穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

37℃放置7天后，凍干苗滴度下降平均不超過(guò)0.5LgPFU/ml；而無(wú)保護(hù)劑的對(duì)照液體疫苗，放置一周后滴度下降接近一個(gè)LgPFU/ml；37℃放置21天后，凍干苗滴度總下降值平均不超過(guò)一個(gè)LgPFU/ml。
而液體疫苗的感染性滴度總下降值在3.5個(gè)LgPFU/ml左右。
權(quán)利要求
1.一種凍干劑型艾滋病重組痘病毒安卡拉株載體疫苗，組成有艾滋病重組痘病毒安卡拉株病毒，其特征是，組成還有保護(hù)劑和平衡鹽溶液；所說(shuō)的保護(hù)劑及它們?cè)诮M合物懸液中的終濃度是海藻糖2～4％(W/V)和甘露醇1～3％(W/V)和右旋糖苷2％(W/V)和肌醇0.5～1％(W/V)；所說(shuō)的平衡鹽溶液是磷酸鹽溶液或磷酸鹽生理氯化鈉溶液，PH值為7.0～7.7。
2.按照權(quán)利要求1所述的凍干劑型艾滋病重組痘病毒安卡拉株載體疫苗，其特征是，外觀呈白色疏松體，殘余水分小于或等于3％(g/g)。
3.一種凍干劑型艾滋病重組痘病毒安卡拉株載體疫苗的制備方法，凍干劑型艾滋病重組痘病毒安卡拉株載體疫苗的組成有艾滋病重組痘病毒安卡拉株病毒和保護(hù)劑和平衡鹽溶液；所說(shuō)的保護(hù)劑是海藻糖和甘露醇和右旋糖苷和肌醇；所說(shuō)的平衡鹽溶液是磷酸鹽溶液或磷酸鹽生理氯化鈉溶液；制備有混料和真空冷凍干燥兩個(gè)過(guò)程；所說(shuō)的混料過(guò)程是，在平衡鹽溶液中加入保護(hù)劑，按每100ml平衡鹽溶液加入5～10g保護(hù)劑的比例溶解后過(guò)濾，保護(hù)劑組成按質(zhì)量比為海藻糖∶甘露醇∶右旋糖苷∶肌醇＝2～4∶1～3∶2∶0.5～1，再按每0.1ml溶液中含107～1010病毒量的比例加入艾滋病重組痘病毒安卡拉株病毒的濃縮液，得到疫苗液灌裝；所說(shuō)的冷凍干燥過(guò)程是，將疫苗液于-35℃～-40℃低溫條件下，預(yù)冷凍3～4小時(shí)，然后在擱板溫度-30℃～-32℃，真空度為9～12Pa下，干燥10～12小時(shí)，待制品完全成型后，使擱板溫度逐漸升至28℃，真空度為9～12Pa下再干燥4～5小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明的凍干劑型艾滋病重組痘病毒安卡拉株載體疫苗及其制備方法屬于生物制品技術(shù)領(lǐng)域。是在液體劑型HIV重組MVA病毒載體疫苗中加入由海藻糖、甘露醇、右旋糖苷和肌醇等按比例配伍而成的保護(hù)劑，充分混勻，在真空冷凍干燥條件下制備成凍干劑型。本發(fā)明疫苗穩(wěn)定性能好，費(fèi)用低，容易進(jìn)行生產(chǎn)和使用。產(chǎn)品在4～8℃保存兩年后，仍能保持凍干后的外觀，并克服了液體疫苗低溫凍結(jié)保存及運(yùn)輸過(guò)程中嚴(yán)格冷鏈，有效期短的缺點(diǎn)。本發(fā)明還適用于其它利用重組MVA病毒作為表達(dá)載體的冷凍干燥劑型疫苗的制備，具有一定的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益和實(shí)施價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K39/21GK1695737SQ200510016800
公開(kāi)日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2005年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月20日
發(fā)明者孔維, 張一折, 姜春來(lái), 吳永革, 于湘暉 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)