專利名稱：用于在改良安卡拉痘苗病毒中進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子的制作方法
專利說(shuō)明用于在改良安卡拉痘苗病毒中進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子 本發(fā)明涉及啟動(dòng)子，尤其是用于在改良安卡拉痘苗病毒(Modifiedvaccinia virus Ankara，MVA)之類的痘苗病毒中表達(dá)基因和/或編碼序列的啟動(dòng)子。本發(fā)明還涉及包含該啟動(dòng)子的表達(dá)盒，含有所述表達(dá)盒的載體，以及藥物組合物和疫苗。

背景技術(shù)：
重組痘病毒廣泛用于在被感染的細(xì)胞中表達(dá)外來(lái)基因。目前還有人測(cè)試重組痘病毒是否可以作為非常有希望的疫苗用于誘導(dǎo)抗該痘病毒載體表達(dá)的外來(lái)抗原的免疫應(yīng)答。最常見(jiàn)的痘病毒是禽痘病毒屬的病毒(avipoxviruses)和痘苗病毒(vaccinia viruses)，后者尤其例如改良安卡拉痘苗病毒(MVA)。MVA與痘苗病毒相關(guān)，是痘病毒科正粘病毒屬的一員。MVA是通過(guò)將痘苗病毒的安卡拉毒株在雞胚成纖維細(xì)胞上連續(xù)傳516代(CVA)而得到的(綜述可參見(jiàn)Mayr，A.，等Infection 3，6-14[1975])。如此長(zhǎng)期傳代得到一種MVA病毒，其基因組序列中缺失了大約31kb，因此它被描述為對(duì)宿主細(xì)胞具有高度選擇性，僅限于鳥(niǎo)類細(xì)胞(Meyer，H.等，J.Gen.Virol.72，1031-1038[1991])。所得MVA在多種動(dòng)物模型中明顯缺乏毒力(Mayr，A.& Danner，K.[1978]Dev.Biol.Stand.41225-34)。此外，臨床試驗(yàn)中還檢驗(yàn)了該MVA毒株作為疫苗經(jīng)免疫接種而對(duì)抗人類天花的效果(Mayr等，Zbl.Bakt.Hyg.I，Abt.Org.B 167，375-390[1987]，Stickl等，Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392[1974])。
US 5,736,368和US 6,051,410公開(kāi)了表達(dá)HIV抗原和蛋白的重組痘苗病毒株Wyeth。US 5,747,324公開(kāi)了表達(dá)慢病毒基因的重組痘苗病毒株NYCBH。EP 0 243 029公開(kāi)了表達(dá)人逆轉(zhuǎn)錄病毒基因的重組痘苗病毒株Western Reserve。WO 02/42480公開(kāi)了特別安全且減毒的MVA株。重組MVA可以參見(jiàn)，例如WO 98/13500和WO 03/048184。
本領(lǐng)域已知僅有一些啟動(dòng)子能在痘病毒中表達(dá)外來(lái)基因，如30K和40K啟動(dòng)子(參見(jiàn)，例如US 5,747,324)，人工合成的強(qiáng)效早/晚期啟動(dòng)子(參見(jiàn)，例如Sutter et al.，Vaccine(1994)12，1032-40)，P7.5啟動(dòng)子(參見(jiàn)，例如Endoet al.，J.Gen.Virol.(1991)72，699-703)以及衍生自牛痘病毒(cowpox virus)A型包涵體(ATI)基因的啟動(dòng)子(Li et al.，J.Gen.Virol.(1998)79，613)。所有這些啟動(dòng)子都已用在重組痘苗病毒中來(lái)表達(dá)外來(lái)基因，結(jié)果表明，它們都表達(dá)這些基因，從而產(chǎn)生由這些外來(lái)基因編碼的蛋白。由于僅有一些啟動(dòng)子可以用于在痘苗病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)基因，因此總體上需要另外的痘苗病毒啟動(dòng)子。此外，所有迄今已知的啟動(dòng)子都是強(qiáng)效晚期啟動(dòng)子，即可以用于在痘苗病毒載體發(fā)生復(fù)制之后來(lái)表達(dá)基因。而在一些應(yīng)用中，希望有能在剛剛發(fā)生細(xì)胞感染后就表達(dá)基因的啟動(dòng)子，即需要痘苗病毒早期啟動(dòng)子。
不僅如此，如上所述，MVA由于其改進(jìn)的安全性而在外來(lái)基因表達(dá)方面具有很好的前景。但迄今已知的所有用于在MVA中表達(dá)外來(lái)基因的啟動(dòng)子都來(lái)源于其它痘苗病毒或者是合成的、用于在其它痘苗病毒中進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子。因此，還需要最適于在MVA中表達(dá)的啟動(dòng)子。
發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及衍生自改良安卡拉痘苗病毒(MVA)的啟動(dòng)子。MVA啟動(dòng)子至今尚未為本領(lǐng)域所知。
具體地，本發(fā)明涉及包含選自下列的核苷酸序列或由選自下列的核苷酸序列組成的啟動(dòng)子 (i)SEQ ID NO1-6任一所示核苷酸序列 5′TCTGCAATATTGTTATCGTAATTGGAAAAATAGTGTTCGAGTGAGTTGGATTATGTGAGTATTGGATTGTATATTTTATTTTATATTTTATATTTTGTAGTAAGAATAGAATGCTAATGTCAAGTTTATTCCAATAGATGTCTTATTAAAAAACATATATAATAAATAACA 3`(SEQ ID NO1) 5’GATAAAAATTTAAAGTGTAAATATAACTATTATTTTATAGTTGTAATAAAAAGGGAAATTTGATTGTATACTTTCGGTTCTTTAAAAGAAACTGACTTGATAAAA 3′(SEQ ID NO2) 5′GCATTTCATCTTTCTCCAATACTAATCAAATTGTTAAATAAATAATGGATAGTATAAATAGTTATTAGTGATAAAATAGTAAAAATAATTATTAGAATAAGAGTGTAGTATCATAGATAACTCTCTTCTATAAAA 3′(SEQ ID NO3) 5′GATCTATAAAGGTAGACCTAATCGTCTCGGATGACCATATATTTATTTTCAGTTTTATTATACGCATAAATAGTAAAAAATATGTTAGGTTTACAAAA 3′(SEQ ID NO4) 5′GGTAAACTTTAAGACATGTGTGTTATACTAAGATGGTTGGCTTATTCCATAGTAGCTTGTGGAATTTATAAACTTATGATAGTAAAACTAGTACCCAATATGTAAAGATGAAAAAGTAAATTACTATTAACGCCGTCGGTATTCGTTCATCCATTCAGTT 3′(SEQ ID NO5) 5′ATTTCTCGGTAGCACATCAAATGATGTTACCACTTTTCTTAGCATGCTTAACTTGACTAAATATTCATAACTAATTTTTATTAATGATACAAAAACGAAATAAAACTGCATATTATACACTGGTTAACGCCCTTATAGGCTCTAACCATTTTCAAG 3′(SEQ ID NO6) (ii)SEQ IDNo.1-6任一序列的亞序列 (iii)與序列(i)或(ii)相比具有一或多個(gè)核苷酸取代、缺失和/或插入的序列。
SEQ ID NO1-6都是MVA基因組的天然組成部分，分別位于閱讀框A42R，J6R，F(xiàn)6R，I2R，C7L和B9R的上游。
本發(fā)明的啟動(dòng)子優(yōu)選作為痘苗病毒啟動(dòng)子或者作為被痘苗病毒感染的細(xì)胞中的啟動(dòng)子來(lái)發(fā)揮作用。所述痘苗病毒優(yōu)選MVA，尤其是下文中具體指出的MVA毒株之一。“作為痘苗病毒啟動(dòng)子來(lái)發(fā)揮作用”是指，在用痘苗病毒感染細(xì)胞后，該啟動(dòng)子能指導(dǎo)與該啟動(dòng)子可操作相連的基因在痘苗病毒中表達(dá)。所述細(xì)胞優(yōu)選允許痘苗病毒的晚期和/或早期表達(dá)的細(xì)胞?！霸诒欢幻绮《靖腥镜募?xì)胞中發(fā)揮作用的啟動(dòng)子”還包括以下情況啟動(dòng)子并非痘苗病毒基因組的一部分的情況，例如啟動(dòng)子是質(zhì)粒的一部分或非-痘苗病毒的病毒基因組的一部分的情況；在這種情況中，本發(fā)明的啟動(dòng)子在含有該啟動(dòng)子的細(xì)胞同時(shí)也含有痘苗病毒基因組(例如，該細(xì)胞被痘苗病毒感染)時(shí)具有活性。在這些情況中，病毒RNA聚合酶識(shí)別本發(fā)明的啟動(dòng)子，活化與該啟動(dòng)子相連的基因/編碼序列的表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明，可以使用SEQ ID NO1-6任一所示啟動(dòng)子。實(shí)際用于指導(dǎo)基因/編碼序列表達(dá)的啟動(dòng)子可以由SEQ ID NO1-6任一組成，或者實(shí)際使用的啟動(dòng)子可以是包含SEQ ID NO1-6任一序列的更大的結(jié)構(gòu)?；蛘?，本發(fā)明的范圍內(nèi)包括使用這些啟動(dòng)子的衍生物，它們可以是SEQ.ID NO1-6任一的亞序列。“SEQ.ID NO1-6任一的亞序列”是指，比SEQ.ID NO1-6任一序列更短、但仍可以作為啟動(dòng)子(尤其是作為在痘苗病毒或被痘苗病毒感染的細(xì)胞中的啟動(dòng)子)來(lái)發(fā)揮作用的片段。同樣地，痘苗病毒優(yōu)選MVA，諸如下文中具體指明的那些毒株。SEQ ID NO1-6任一的典型亞序列具有SEQ ID NO1-6任一序列的至少15個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少20個(gè)核苷酸，還更優(yōu)選至少25個(gè)核苷酸，最優(yōu)選至少30個(gè)核苷酸。
SEQ ID NO1的優(yōu)選亞序列是SEQ ID NO7。SEQ ID NO2的優(yōu)選亞序列是SEQ ID NO8。SEQ ID NO3的優(yōu)選亞序列和/或衍生物是SEQ ID NO9和SEQ ID NO10。SEQ ID NO4的優(yōu)選亞序列是SEQ ID NO11和SEQ IDNO12。序列SEQ ID NO6-12可參見(jiàn)實(shí)施例章節(jié)。
對(duì)于包含SEQ ID NO1-6任一所示核苷酸序列或其亞序列、或者由SEQID NO1-6任一所示核苷酸序列或其亞序列組成的啟動(dòng)子而言，其衍生物，尤其是SEQ ID NO7-12任一核苷酸序列的衍生物，可以是與SEQ ID NO1-6任一序列或其亞序列相比具有一或多個(gè)核苷酸取代、缺失、和/或插入的序列，尤其是與SEQ ID NO7-12任一核苷酸序列相比具有一或多個(gè)核苷酸取代、缺失、和/或插入的序列。本發(fā)明的衍生物仍然可以作為啟動(dòng)子(尤其是痘苗病毒啟動(dòng)子)而在痘苗病毒中或在被痘苗病毒感染的細(xì)胞中發(fā)揮作用，更優(yōu)選作為MVA啟動(dòng)子而在MVA中或在被MVA感染的細(xì)胞中發(fā)揮作用。具有一或多個(gè)核苷酸取代的序列是指，與SEQ ID NO1-6任一所示核苷酸序列或其亞序列、尤其與SEQ ID NO7-12任一核苷酸序列相比，有一或多個(gè)核苷酸被不同核苷酸取代的序列。具有一或多個(gè)核苷酸插入的序列是指，與SEQ IDNO1-6任一所示核苷酸序列或其亞序列、尤其與SEQ ID NO7-12任一核苷酸序列相比，在一或多個(gè)位置插入了一或多個(gè)核苷酸的序列。具有一或多個(gè)核苷酸缺失的序列是指，與SEQ ID NO1-6任一所示核苷酸序列或其亞序列、尤其與SEQ ID NO7-12任一核苷酸序列相比，缺失了一或多個(gè)核苷酸的序列。在本發(fā)明的衍生物中，缺失、取代和插入可以出現(xiàn)在同一序列中。
本發(fā)明亞序列的衍生物的一個(gè)實(shí)例是SEQ ID NO10，它是SEQ ID NO3的亞序列，與SEQ ID NO3相比，它額外具有一個(gè)核苷酸改變。
優(yōu)選所述衍生物與SEQ ID NO1-6任一序列或其亞序列、尤其與SEQ IDNO7-12任一序列相比，具有至少40％，更優(yōu)選至少60％，還更優(yōu)選至少80％，最優(yōu)選至少90％的同源性。根據(jù)最優(yōu)選的實(shí)施方案，SEQ ID NO7-12任一序列中有不超過(guò)10個(gè)核苷酸，還更優(yōu)選不超過(guò)5個(gè)核苷酸被取代、缺失和/或插入。
有很多的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員預(yù)測(cè)，SEQ ID NO1-12任一序列的哪些衍生物或亞序列仍具有作為痘苗病毒啟動(dòng)子、尤其是作為在MVA中發(fā)揮作用的啟動(dòng)子的生物學(xué)活性。例如，可參見(jiàn)Chakrarbarti等，Biotechniques(1997)23，1094-1097和Davison and Moss，J.Mol.Biol.(1989)210，771-784。而且，一種片段是否仍具有作為痘苗病毒啟動(dòng)子、尤其是作為MVA啟動(dòng)子的活性，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易地進(jìn)行評(píng)估。具體地，序列衍生物可以克隆在質(zhì)粒構(gòu)建體中報(bào)告基因的上游。將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到已被MVA感染的真核細(xì)胞或者CEF或BHK等細(xì)胞系中。測(cè)定所述報(bào)告基因的表達(dá)，并與SEQ ID NO1-6任一所示啟動(dòng)子控制的該報(bào)告基因的表達(dá)進(jìn)行比較。本發(fā)明的衍生物是在該測(cè)試系統(tǒng)中具有SEQ ID NO1-6任一啟動(dòng)子序列的至少10％，優(yōu)選至少30％，更優(yōu)選至少50％，還更優(yōu)選至少70％，最優(yōu)選至少90％啟動(dòng)子活性的衍生物。SEQ ID NO1-12任一的具有較高啟動(dòng)子活性的衍生物也包括本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的啟動(dòng)子特別適于在MVA中表達(dá)編碼序列。
SEQ ID NO1所示啟動(dòng)子具有非常高的活性，尤其是作為晚期啟動(dòng)子，但它也可以作為早期啟動(dòng)子。相應(yīng)的亞序列，例如SEQ ID NO7所示序列也具有這些特點(diǎn)，只不過(guò)它尤其適于作為晚期啟動(dòng)子。
SEQ ID NO2所示啟動(dòng)子也具有非常高的活性，尤其是作為晚期啟動(dòng)子時(shí)。它也可以用作早期啟動(dòng)子。相應(yīng)的亞序列，例如SEQ ID NO8所示序列也具有這些特點(diǎn)，只不過(guò)它尤其適于作為晚期啟動(dòng)子。
SEQ ID NO3所示啟動(dòng)子尤其可用作早期啟動(dòng)子，并且它是所測(cè)試的所有啟動(dòng)子中早期啟動(dòng)子活性最高的。不過(guò)，它也可以用作晚期啟動(dòng)子。相應(yīng)的亞序列，例如SEQ ID NO9和10所示序列也是如此。在這些亞序列中，SEQ ID NO9尤其可以用作早期啟動(dòng)子，SEQ ID NO10尤其可以用作晚期啟動(dòng)子。
SEQ ID NO4所示啟動(dòng)子尤其可用于早期和晚期表達(dá)與之相連的編碼序列，因?yàn)樵搯?dòng)子在早期和晚期條件下具有非常高的活性。相應(yīng)的亞序列，例如SEQ ID NO11和12所示序列也是如此。在這些亞序列中，SEQ ID NO11尤其可以用作早期啟動(dòng)子，SEQ ID NO12尤其可以用作晚期啟動(dòng)子。
SEQ ID NO5和6所示啟動(dòng)子尤其可用于極少量表達(dá)與之相連的編碼序列。有些情況是需要極少量表達(dá)的，例如所連接的編碼序列編碼毒性基因產(chǎn)物和/或希望誘導(dǎo)較高親合力免疫應(yīng)答的情況。
術(shù)語(yǔ)“早期啟動(dòng)子”是指，在痘苗病毒或被痘苗病毒感染的細(xì)胞中，在病毒DNA復(fù)制之前發(fā)揮活性的啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知如何檢查一種啟動(dòng)子是否早期啟動(dòng)子的方法。具體地，可將目標(biāo)啟動(dòng)子插入報(bào)告基因上游。將含有該啟動(dòng)子和報(bào)告基因的構(gòu)建體導(dǎo)入已被痘苗病毒感染的細(xì)胞中。為了評(píng)估早期啟動(dòng)子活性，將細(xì)胞與AraC等抑制DNA復(fù)制的物質(zhì)一起保溫。DNA復(fù)制是晚期啟動(dòng)子活性的必備條件。故，在該測(cè)試系統(tǒng)中測(cè)出的任何啟動(dòng)子活性歸因于作為早期啟動(dòng)子來(lái)發(fā)揮作用的元件。因此，術(shù)語(yǔ)“晚期啟動(dòng)子”是指在DNA復(fù)制發(fā)生之后發(fā)揮作用的任何啟動(dòng)子。這種晚期活性也可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)測(cè)量。為簡(jiǎn)便目的，術(shù)語(yǔ)“晚期啟動(dòng)子”在本中請(qǐng)中用于指，在未添加阻斷DNA復(fù)制的物質(zhì)的情況下測(cè)定的啟動(dòng)子活性。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有編碼序列和本發(fā)明啟動(dòng)子的表達(dá)盒，其中所述編碼序列的表達(dá)受所述啟動(dòng)子控制。表達(dá)盒優(yōu)選不是痘苗病毒基因組中天然存在的表達(dá)盒。故，當(dāng)本發(fā)明啟動(dòng)子是痘苗病毒基因組中天然存在的啟動(dòng)子時(shí)，與該啟動(dòng)子相連的序列優(yōu)選不同于痘苗病毒基因組中與該啟動(dòng)子天然相連的序列。換而言之，當(dāng)本發(fā)明啟動(dòng)子與天然啟動(dòng)子相同時(shí)，受該啟動(dòng)子控制而表達(dá)的編碼序列、和/或位于該啟動(dòng)子和該編碼序列之間的序列不同于與該啟動(dòng)子天然相連的相應(yīng)序列。術(shù)語(yǔ)“不同于”在此上下文中是指，在所述序列中有至少一個(gè)核苷酸不同的序列。優(yōu)選它是有至少一個(gè)核苷酸不同的編碼序列。在其它情況下，所述表達(dá)盒中編碼序列與天然連接該啟動(dòng)子的序列之間的同源性不足90％，不足80％，不足70％，不足60％，不足50％，不足40％或甚至不足20％。最優(yōu)選，受本發(fā)明啟動(dòng)子控制的編碼序列編碼的肽/蛋白與該編碼序列編碼的天然蛋白有至少一個(gè)氨基酸不同。例如，所述表達(dá)盒并不是含有在痘苗病毒中指導(dǎo)天然C7L基因表達(dá)的天然C7L啟動(dòng)子的表達(dá)盒，例如，所述表達(dá)盒并不是WO2004/015118中公開(kāi)的含有C7L啟動(dòng)子和C7L編碼序列的表達(dá)盒。
另一方面，當(dāng)待表達(dá)的序列是痘苗病毒的天然序列時(shí)，用于表達(dá)該序列的啟動(dòng)子不同于在天然環(huán)境中指導(dǎo)該編碼序列表達(dá)的啟動(dòng)子。根據(jù)這一方面，這種啟動(dòng)子的核苷酸序列與痘苗病毒天然啟動(dòng)子的序列有至少一個(gè)核苷酸不同。根據(jù)其它方面，本發(fā)明控制痘苗病毒序列表達(dá)的啟動(dòng)子與天然連接這種痘苗病毒序列的啟動(dòng)子之間的同源性不足90％，不足80％，不足70％，不足60％，不足50％或甚至不足40％。
優(yōu)選編碼序列編碼至少一種抗原表位或抗原、治療性肽或蛋白、反義RNA或核酶。當(dāng)編碼序列編碼抗原表位或抗原時(shí)，可將表達(dá)盒導(dǎo)入生物(例如哺乳動(dòng)物，包括人)的細(xì)胞中，用于表達(dá)所述抗原。所述抗原/表位的呈遞可以在這種生物中激發(fā)免疫應(yīng)答，使該生物對(duì)衍生該抗原/表位的物質(zhì)致敏。更具體地，所述表位/抗原可以是較大的氨基酸序列(如多表位、肽或蛋白)的一部分。優(yōu)選編碼序列編碼痘苗病毒基因組中并不編碼的至少一種抗原表位或抗原、治療性肽或蛋白、反義RNA或核酶。
所述多表位、肽或蛋白的實(shí)例可以是以下來(lái)源的多表位、肽或蛋白(i)病毒，尤其是除了痘苗病毒以外的病毒，如HIV，HTLV，皰疹病毒，登革熱病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，風(fēng)疹病毒，肝炎病毒等，(ii)細(xì)菌，(iii)真菌，(iv)腫瘤相關(guān)多肽/蛋白，如腫瘤相關(guān)抗原。
或者，編碼序列可以編碼治療性化合物，如白細(xì)胞介素，干擾素，核酶或酶。
在更廣泛的意義上，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明啟動(dòng)子和/或本發(fā)明表達(dá)盒的任何核酸序列。所述核酸可以是RNA，例如當(dāng)所述啟動(dòng)子是逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的一部分時(shí)。更優(yōu)選所述核酸是DNA。DNA可以是任何類型的DNA，如線性、環(huán)狀、單鏈或雙鏈DNA。
根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明的啟動(dòng)子和/或表達(dá)盒可以是載體的一部分。術(shù)語(yǔ)“載體”是指本領(lǐng)域已知的任何載體。載體可以是質(zhì)粒載體，如pBR322或pUC系列的載體。更優(yōu)選載體是病毒載體。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語(yǔ)“病毒載體”是指含有病毒基因組的感染性病毒。在這種情況下，本發(fā)明的DNA是相應(yīng)病毒載體的病毒基因組的一部分。將重組病毒基因組包裝后，所得的重組載體可以用于感染細(xì)胞和細(xì)胞系，尤其是感染活體動(dòng)物，包括人。可用于本發(fā)明的典型的病毒載體有，腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或基于腺伴隨病毒2(AAV2)的載體。最優(yōu)選痘病毒載體。痘病毒優(yōu)選金絲雀痘病毒(canarypox virus)，禽痘病毒(fowlpoxvirus)或痘苗病毒。
更優(yōu)選的是改良安卡拉痘苗病毒(MVA)(Sutter，G.et al.[1994]，Vaccine121032-40；Antoine，G.et al.[1998]，Virology 244365-396)。術(shù)語(yǔ)“MVA”用在本申請(qǐng)中是指現(xiàn)有技術(shù)已知的任何MVA病毒株。MVA病毒株的一個(gè)典型實(shí)例是VR-1508，它保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA20108，US。可用于本發(fā)明的MVA病毒株的其它實(shí)例有，MVA 572和575，它們保藏在歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(European Collection of AnimalCell Cultures，ECACC)，Salisbury(UK)，保藏號(hào)為分別為ECACC V94012707和ECACC V00120707，另外還有MVA-BN，其保藏號(hào)為ECACC V00083008。
最優(yōu)選的MVA病毒株是MVA-BN或其衍生物。MVA-BN的特點(diǎn)，能評(píng)價(jià)MVA病毒株是否MVA-BN或其衍生物的生物學(xué)試驗(yàn)以及獲得MVA-BN或其衍生物的方法可以參見(jiàn)WO 02/42480。該申請(qǐng)的內(nèi)容包括在本申請(qǐng)中作為參考。具體地，對(duì)本發(fā)明痘苗病毒特性的定義可以參考WO02/42480，諸如MVA的特性，以及MVA-BN衍生物的特性和定義。該文獻(xiàn)還公開(kāi)了如何繁殖MVA以及其它痘苗病毒。簡(jiǎn)言之，用這種病毒感染真核細(xì)胞。所述真核細(xì)胞是易被相應(yīng)痘病毒感染、并允許感染性病毒復(fù)制增殖的細(xì)胞。對(duì)于MVA而言，這類細(xì)胞的實(shí)例有雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)和BHK細(xì)胞(Drexler I.，Heller K.，Wahren B.，Erfle V.and Sutter G.“Highly attenuatedrnodified vaccinia Ankara replicates in baby hamster kidney cells，a potentialhost for virus propagation，but not in various human transformed and primarycells”J.Gen.Virol.(1998)，79，347-352)。CEF細(xì)胞可以在本領(lǐng)域已知的條件下培養(yǎng)。優(yōu)選CEF細(xì)胞在靜止的燒瓶或搖瓶中不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。保溫優(yōu)選在37℃±2℃進(jìn)行48-96小時(shí)。為了進(jìn)行感染，優(yōu)選MVA用量為0.05-1 TCID50的感染復(fù)數(shù)(MOI)，并且保溫優(yōu)選在37℃±2℃進(jìn)行48-72小時(shí)。
本領(lǐng)域已知如何將本發(fā)明的表達(dá)盒或啟動(dòng)子插入病毒基因組，尤其是插入痘苗病毒基因組，最優(yōu)選插入MVA基因組。例如，可以將本發(fā)明的表達(dá)盒或啟動(dòng)子或其衍生物通過(guò)同源重組插入MVA基因組。為此，將核酸轉(zhuǎn)染到CEF或BHK細(xì)胞等容許細(xì)胞系中，在所述核酸中，本發(fā)明的表達(dá)盒或啟動(dòng)子或其衍生物的側(cè)翼是與MVA基因組中希望插入本發(fā)明表達(dá)盒或啟動(dòng)子或其衍生物的區(qū)域同源的核苷酸鏈。用MVA感染所述細(xì)胞，在被感染的細(xì)胞中，所述核酸與病毒基因組之間發(fā)生同源重組。也可以首先用MVA感染細(xì)胞，然后將所述核酸轉(zhuǎn)染到被感染的細(xì)胞中。同樣在所述細(xì)胞中發(fā)生重組。然后用本領(lǐng)域已知的方法選出重組MVA。對(duì)重組MVA的構(gòu)建不限于這種具體的方法。本領(lǐng)域已知的任何方法都可以用于此目的。
本發(fā)明的表達(dá)盒或啟動(dòng)子可以插入載體、尤其是病毒基因組的任何適當(dāng)部分。在痘苗病毒的情況中，可以插入病毒基因組的非必需部分，或插入病毒基因組的基因間區(qū)域。術(shù)語(yǔ)“基因間區(qū)域”優(yōu)選是病毒基因組中位于兩個(gè)鄰接基因之間的不含有編碼序列的那些部分。當(dāng)載體是MVA時(shí)，可以插入該病毒基因組的天然缺失位點(diǎn)?！疤烊蝗笔稽c(diǎn)”是指病毒基因組中相對(duì)于痘苗病毒Copenhagen株的基因組而言已經(jīng)缺失的那些部分。但插入位點(diǎn)不限于痘苗病毒基因組和MVA基因組中的這些優(yōu)選插入位點(diǎn)，因?yàn)樵诒景l(fā)明范圍內(nèi)，只要能獲得在至少一種細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)如雞胚成纖維細(xì)胞(CEF細(xì)胞)中能夠擴(kuò)增和繁殖的重組體，可以將表達(dá)盒插入病毒基因組的任何位點(diǎn)。
本發(fā)明的啟動(dòng)子可以用于表達(dá)已經(jīng)是載體(例如MVA基因組)的一部分的基因。這樣的基因可以是病毒基因組的天然部分，或者是已經(jīng)插入載體中的外來(lái)基因。在這些情況中，將本發(fā)明的啟動(dòng)子插入載體中這種基因的上游，使基因表達(dá)受該啟動(dòng)子控制。含有本發(fā)明表達(dá)盒的MVA載體也可以如下制備將A42R，J6R，F(xiàn)6R，I2R，C7L或B9R任一種開(kāi)放讀框替換為編碼序列，而所述編碼序列的表達(dá)受天然控制上述任一種開(kāi)放讀框表達(dá)的啟動(dòng)子的控制。例如，可以將A42R編碼序列或其部分替換為待表達(dá)的編碼序列。在所得構(gòu)建體中，所述編碼序列受本發(fā)明啟動(dòng)子控制，即受SEQ ID NO1和SEQID NO7所示啟動(dòng)子序列控制。這些表達(dá)盒也落在本發(fā)明范圍內(nèi)。
根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及作為疫苗或藥物的本發(fā)明載體。在更廣泛的意義上，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明表達(dá)盒、DNA或載體的疫苗或藥物組合物。本領(lǐng)域已知對(duì)動(dòng)物或人體給藥疫苗或藥物組合物的方法。在DNA和質(zhì)粒載體的情況中，所述DNA和載體可以簡(jiǎn)單地通過(guò)注射來(lái)給藥。當(dāng)載體是病毒載體，如痘苗病毒載體，尤其MVA載體時(shí)，可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員所知對(duì)動(dòng)物或人體給藥，例如通過(guò)靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、皮內(nèi)或皮下方式給藥。病毒給藥量詳見(jiàn)下文。
藥物組合物或疫苗除了包括本發(fā)明的啟動(dòng)子、表達(dá)盒或載體以外，通常包括一或多種可藥用和/或經(jīng)核準(zhǔn)的(approved)載體，添加劑，抗生素，保存劑，輔助劑，稀釋劑和/或穩(wěn)定劑。這類輔助物質(zhì)可以是水，鹽水，甘油，乙醇，增濕劑或乳化劑，pH緩沖物質(zhì)，等等。適當(dāng)?shù)妮d體通常是分子量較大、代謝較慢的分子，如蛋白、多糖、多聚乳酸，多聚乙醇酸，多聚氨基酸，氨基酸共聚物，脂質(zhì)聚集物，等等。
為了制備藥物組合物或疫苗，可以將本發(fā)明的DNA、表達(dá)盒或載體(尤其是重組痘苗病毒如重組MVA)轉(zhuǎn)變?yōu)樯砜山邮艿男问健?duì)于痘苗病毒，尤其是MVA而言，這可以依據(jù)制備天花預(yù)防性接種所用的痘病毒疫苗的經(jīng)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行(參見(jiàn)Stickl，H.et al.[1974]Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392)。例如，將純化的病毒以5×108TCID50/ml的滴度配制在約10mM Tris，140mMNaCl pH7.4中，-80℃保存。為了制備疫苗注射劑(vaccine shot)，例如將101-109的本發(fā)明重組病毒顆粒，在有2％蛋白胨和1％人白蛋白存在的情況下，凍干在安瓿(優(yōu)選玻璃安瓿)內(nèi)的磷酸鹽緩沖液(PBS)中?；蛘?，可通過(guò)將病毒在配制劑中逐步凍干的方式來(lái)制備疫苗注射劑。這種配制劑可包含適于體內(nèi)給藥的額外添加劑，如甘露醇，葡聚糖，糖，甘氨酸，乳糖，或聚乙烯吡硌烷酮，或其它添加劑，如抗氧化劑或惰性氣體，穩(wěn)定劑或重組蛋白(如人血清白蛋白)。適于凍干的含有病毒的典型配制劑包含10mM Tris-緩沖液，140mM NaCl，18.9g/l葡聚糖(MW 36000-40000)，45g/l蔗糖，0.108g/l L-谷氨酸單鉀鹽一水合物pH7.4。然后將玻璃安瓿密封，在介于4℃和室溫之間的溫度中保存數(shù)月。但是，只要不必使用，優(yōu)選將安瓿保存在-20℃以下的溫度中。
為了進(jìn)行免疫接種或治療，可將凍干品溶于0.1-0.5ml含水溶液(優(yōu)選水、生理鹽水或Tris緩沖液)中，經(jīng)過(guò)系統(tǒng)途徑或局部途徑給藥，即通過(guò)胃腸道外途徑、肌肉途徑或本領(lǐng)域已知的任何其它給藥途徑來(lái)給藥。給藥方式、給藥劑量以及給藥次數(shù)可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)已知的方式最優(yōu)化。
故根據(jù)相關(guān)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及在包括人在內(nèi)的活動(dòng)物體中影響(優(yōu)選誘導(dǎo))免疫應(yīng)答的方法，該方法包括對(duì)待處理的動(dòng)物或人給予本發(fā)明的表達(dá)盒、DNA、載體、藥物組合物或疫苗。當(dāng)疫苗是痘苗病毒、尤其是MVA時(shí)，人用疫苗注射劑的通常用量包含至少102，優(yōu)選至少104，更優(yōu)選至少106，還更優(yōu)選107或108TCID50(組織培養(yǎng)感染劑量)的所述病毒。
當(dāng)疫苗是重組MVA，尤其重組MVA-BN及其衍生物時(shí)，所述病毒可以用于初次-加強(qiáng)式給藥。因此，本發(fā)明還涉及一種方法，其中載體是MVA、尤其MVA-BN及其衍生物，且所述載體或包含該載體的組合物或疫苗在第一次接種(“初次接種”)和在第二次接種(“加強(qiáng)接種”)中以治療有效量對(duì)有需要的動(dòng)物(包括人)給藥。
本發(fā)明還涉及將編碼序列導(dǎo)入靶細(xì)胞的方法，包括將本發(fā)明的載體、表達(dá)盒或DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞。當(dāng)載體是痘苗病毒、尤其是MVA如MVA-BN時(shí)，靶細(xì)胞可以是能使所述病毒在其中復(fù)制的細(xì)胞如CEF或BHK細(xì)胞，或者是被MVA感染、但不能使該病毒在其中復(fù)制的那些細(xì)胞(對(duì)MVA-BN而言，例如是所有類型的人細(xì)胞)。
本發(fā)明還涉及制備肽、蛋白和/或病毒的方法，包括用本發(fā)明病毒載體感染宿主細(xì)胞，接著在適當(dāng)條件下培養(yǎng)已感染的宿主細(xì)胞，然后分離和/或富集由所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生的肽和/或蛋白和/或病毒。當(dāng)希望產(chǎn)生、即擴(kuò)增本發(fā)明的病毒時(shí)，所述細(xì)胞必需是能使病毒在其中復(fù)制的細(xì)胞。適于痘苗病毒，尤其MVA的細(xì)胞是CEF或BHK細(xì)胞。當(dāng)希望產(chǎn)生由本發(fā)明病毒載體編碼的肽/蛋白時(shí)，所述細(xì)胞可以是被該病毒載體感染、并允許該病毒編碼的蛋白/肽表達(dá)的任何細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及制備肽、蛋白和/或病毒的方法，包括用本發(fā)明的表達(dá)盒、DNA或質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，接著用痘苗病毒感染所述宿主細(xì)胞。已感染的宿主細(xì)胞在適當(dāng)條件下培養(yǎng)。此后的步驟包括分離和/或富集由所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生的肽和/或蛋白和/或病毒。用痘苗病毒感染細(xì)胞的步驟可以在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的步驟之前或之后進(jìn)行。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明啟動(dòng)子、DNA、表達(dá)盒或載體的細(xì)胞。尤其是，本發(fā)明涉及被本發(fā)明病毒載體感染的細(xì)胞。



圖1由不同啟動(dòng)子表達(dá)后的GUS活性 細(xì)胞用MVA-BN感染，并用合適的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。48小時(shí)后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行抽提，經(jīng)酶反應(yīng)產(chǎn)生黃色，在415nm測(cè)定消光(extinction)，從而確定GUS活性。Zex＝陰性對(duì)照(被MVA-BN感染的細(xì)胞)。
圖2早期以及早期/晚期表達(dá)后的GUS活性 細(xì)胞用MVA-BN感染，并用合適的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。24小時(shí)后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行抽提，經(jīng)酶反應(yīng)產(chǎn)生黃色，在415nm測(cè)定消光，從而確定GUS活性。Zex＝陰性對(duì)照(被MVA-BN感染的細(xì)胞)。在所述酶反應(yīng)中，不具有AraC(早期+晚期)表達(dá)的樣品必需保溫5小時(shí)，有AraC(早期表達(dá))的樣品必需保溫過(guò)夜以便出現(xiàn)顏色反應(yīng)。
圖3由不同啟動(dòng)子表達(dá)后的GUS活性 細(xì)胞用MVA-BN感染，并用合適的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。24小時(shí)后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行抽提，經(jīng)酶反應(yīng)產(chǎn)生黃色，在415nm測(cè)定消光，從而確定GUS活性。對(duì)照＝陰性對(duì)照(被MVA-BN感染的細(xì)胞)。
實(shí)施例 以下實(shí)施例將進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，所提供的實(shí)施例無(wú)意限制本發(fā)明技術(shù)的應(yīng)用。
實(shí)施例1分析啟動(dòng)子對(duì)MVA-BN基因組中編碼序列的表達(dá) 1.1試驗(yàn)?zāi)康? 本試驗(yàn)的目的是鑒定適于在MVA基因組中表達(dá)編碼序列的啟動(dòng)子，所述編碼序列優(yōu)選是與天然MVA基因組異源的序列。尤其是在將兩個(gè)或更多個(gè)基因插入單個(gè)插入位點(diǎn)的情況中，使用不同啟動(dòng)子表達(dá)各個(gè)基因較有利，這樣可以減少重組事件的發(fā)生，從而避免其中一種外來(lái)基因的缺失。而且，啟動(dòng)子最好長(zhǎng)度不一，以便有可能根據(jù)啟動(dòng)子的長(zhǎng)度，在重組MVA-BN中表達(dá)不同量的外來(lái)基因。一共分離了11種假定的啟動(dòng)子。將這些假定的啟動(dòng)子序列克隆至質(zhì)粒骨架(pBSKS+)中。為了分析這些啟動(dòng)子的潛在活性，將它們與GUS(大腸桿菌β-葡糖醛酸酶)報(bào)告基因融合。BHK(幼年倉(cāng)鼠腎)細(xì)胞用MVA-BN感染，并用含有與GUS基因融合的假定啟動(dòng)子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。如果該啟動(dòng)子是有功能的，則GUS被表達(dá)，可以通過(guò)GUS酶反應(yīng)定量。將已知特性的痘苗病毒啟動(dòng)子p7.5和Ps與GUS融合進(jìn)行平行分析，以此作為陽(yáng)性對(duì)照和參考。通過(guò)測(cè)量GUS表達(dá)，篩選這些假定啟動(dòng)子的活性、強(qiáng)度和早期/晚期表達(dá)。早期/晚期表達(dá)通過(guò)向培養(yǎng)基中添加AraC(阿糖胞苷)進(jìn)行檢測(cè)。顯示出功能的啟動(dòng)子Ps和p7.5，本領(lǐng)域已知的7.5L和ATI啟動(dòng)子，以及新近鑒定的天然參與MVA ORF A42L，B9R，C7L，F(xiàn)6R，I2R，J6R的表達(dá)控制的啟動(dòng)子序列，都優(yōu)選可以用于在重組MVA構(gòu)建體(recMVA-BN)中表達(dá)外來(lái)基因。
1.2材料 細(xì)胞BHK細(xì)胞 病毒MVA-BN標(biāo)準(zhǔn)粗制原液(7.5×107TCID50) DNApAB-GUS(Ps啟動(dòng)子+GUS) pBNX71(pBluescript+痘苗病毒pr7.5+GUS) pBNX73(pBluescript+牛痘病毒(Cowpox virus)ATI啟動(dòng)子+GUS) pBN81(pBluescript+修飾的H5R啟動(dòng)子+GUS1) pBN61(pBluescript+MVA B1R啟動(dòng)子+GUS) pBN62(pBluescript+MVA B2R啟動(dòng)子+GUS) pBN63(pBluescript+MVA B3R啟動(dòng)子+GUS) pBN60(pBluescript+MVA A30R啟動(dòng)子+GUS) pBN82(pBluescript+痘苗病毒7.5L啟動(dòng)子+GUS) pBN83(pBluescript+MVA C7L啟動(dòng)子(SEQ ID NO5+GUS) pBNX49(pBluescript+MVA A42R啟動(dòng)子(SEQ ID NO1)+GUS) pBNX69(pBluescript+MVA I2R啟動(dòng)子(SEQ ID NO4)+GUS) pBNX72(pBluescript+MVA K5L啟動(dòng)子+GUS) pBNX83(pBluescript+MVA F6R啟動(dòng)子(SEQ ID NO3)+GUS) pBNX84(pBluescript+MVA B9R啟動(dòng)子(SEQ ID NO6+GUS) pBNX85(pBluescript+MVA J6R啟動(dòng)子(SEQ ID NO2)+GUS) 轉(zhuǎn)染試劑盒Effectene transfection kit(Qiagen) 培養(yǎng)基和添加劑DMEM(Gibco BRL)，含10％FCS(Gibco BRL) 化學(xué)品和緩沖液裂解緩沖液(PBS+0.1％Triton+1mM蛋白酶抑制劑) AraC(Sigma，目錄號(hào)C1768) GUS底物1mM(對(duì)硝基苯-β-(D)-葡糖苷酸；Sigma，目錄號(hào)N1627) 終止液2.5M(2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇；Sigma，目錄號(hào)A 9754) 1.3方法 接種細(xì)胞 在6孔板的每一孔中接種5×105BHK細(xì)胞的轉(zhuǎn)染液，細(xì)胞在DMEM/10％FCS、37℃和5％CO2中維持過(guò)夜。
感染/轉(zhuǎn)染 細(xì)胞用MVA-BN(moi 0.1)-0.5ml DMEM/10％FCS/孔感染，在搖床上室溫保溫1h。按照廠家方案進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將2μg質(zhì)粒稀釋在緩沖液EB中(100μl總體積)。添加3.2μl增強(qiáng)液，混合，室溫保溫5min。接著添加10μl Effectene試劑，將懸浮液混合，室溫保溫10min。將病毒-懸浮液從細(xì)胞中取出，添加1.6ml DMEM/10％FCS。向DNA Effectene混合物中添加0.6mlDMEM/10％FCS，再滴加在細(xì)胞上，同時(shí)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)板。然后根據(jù)試驗(yàn)將細(xì)胞保溫7，24或48小時(shí)。為了分析早期/晚期表達(dá)，在感染和轉(zhuǎn)染期間向培養(yǎng)基中添加AraC(40μg/ml)。
收獲細(xì)胞 除去培養(yǎng)基，給細(xì)胞添加0.5ml裂解液。室溫(RT)搖動(dòng)15min后，將細(xì)胞刮到裂解液中，轉(zhuǎn)移到1.5ml反應(yīng)管中，猛烈渦旋。將已裂解的細(xì)胞4℃ 500rcf離心1min。將澄清的上清轉(zhuǎn)移到新鮮小瓶中，-20℃貯存?zhèn)溆谩?br> 測(cè)定GUS活性 10μl細(xì)胞提取液(＝從2×104細(xì)胞獲得的蛋白)添加到1ml預(yù)保溫的底物溶液(37℃)中，37℃保溫直至出現(xiàn)黃色。接著迅速將樣品至于冰上，添加0.4ml終止液。測(cè)定415nm的消光，按照GUS活性與0.05-2.0區(qū)間的消光值的線性關(guān)系換算為GUS活性。用底物溶液作參考，用已被MVA-BN感染的細(xì)胞的提取液作陰性對(duì)照。
1.4試驗(yàn)和結(jié)果 試驗(yàn)1測(cè)定假定的啟動(dòng)子的功能 在第一個(gè)試驗(yàn)中，分析所有包含與GUS基因融合的假定的MVA啟動(dòng)子或已知特性的啟動(dòng)子的質(zhì)粒。細(xì)胞用MVA-BN(moi 0.1)感染，并用相應(yīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。48小時(shí)后收獲細(xì)胞，裂解細(xì)胞，并測(cè)定GUS活性。該試驗(yàn)?zāi)康氖谴_定啟動(dòng)子是否有功能。結(jié)果見(jiàn)圖1。
陰性對(duì)照(被MVA-BN感染的細(xì)胞的提取物)明顯顯示無(wú)GUS活性(Zex；消光值0.001)。已知特性的合成性強(qiáng)效Ps啟動(dòng)子顯示非常有效(Ps；消光值0.87)，48小時(shí)的表達(dá)后可以檢測(cè)到高水平的GUS。已知的痘苗病毒天然pr7.5啟動(dòng)子也顯示很高的活性(p7.5；消光值0.41)。pr7.5的晚期部分(7.5L；消光值0.25)顯示明顯可以檢測(cè)到的活性。牛痘病毒ATI啟動(dòng)子明顯顯示對(duì)于由MVA-BN表達(dá)外來(lái)基因非常有效(ATI；消光值0.76)。至于MVA-BN基因組的假定啟動(dòng)子區(qū)域，結(jié)果顯示，A42R(A42；消光值0.48)，B9R(B9；消光值0.06)，C7L(C7；消光值0.055)，F(xiàn)6R(F6；消光值0.208)，I2R(I2；消光值0.130)和J6R(J6；消光值0.290)都是有功能的啟動(dòng)子。在這項(xiàng)初步試驗(yàn)中明顯顯示有活性的那些啟動(dòng)子(消光值＞0.05)將進(jìn)一步進(jìn)行詳細(xì)鑒定(試驗(yàn)2)。
試驗(yàn)2定性啟動(dòng)子的表達(dá) 鑒定在試驗(yàn)1中顯示活性的那些啟動(dòng)子的表達(dá)模式。為此，將已被MVA-BN感染并被相應(yīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與AraC一起保溫。AraC抑制DNA復(fù)制，而DNA復(fù)制是MVA復(fù)制周期中晚期基因表達(dá)所必需的先決條件。平行進(jìn)行相同試驗(yàn)，但不添加AraC。24小時(shí)后收獲被感染并被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，一式三份地測(cè)定GUS活性。圖2顯示了每份樣品的平均消光值。
在不含AraC(-AraC)的情況下保溫24小時(shí)后，所有啟動(dòng)子都可以明顯檢測(cè)到總體GUS表達(dá)(早期+晚期)(圖2右欄)。新鑒定的啟動(dòng)子的強(qiáng)度按照降序排列為 I2R(I2)＞A42R(A42)＞F6R(F6)＞J6R(J6)＞B9R(B9)＝C7L(C7)。
結(jié)果表明，啟動(dòng)子B9、C7和J6在MVA的生命周期中主要參與晚期表達(dá)，在與抑制晚期表達(dá)的AraC一起保溫的條件下(+AraC)，其GUS表達(dá)水平與陰性對(duì)照(Zex)的相當(dāng)。盡管C7L啟動(dòng)子看起來(lái)較弱，但數(shù)個(gè)跡象表明，它在早期表達(dá)期間發(fā)揮重要作用。
結(jié)果還清楚表明，啟動(dòng)子A42R、I2R和F6R有非常有效的早期表達(dá)。測(cè)定早期表達(dá)時(shí)，樣品必需保溫過(guò)夜，以便出現(xiàn)可以檢測(cè)到的顏色反應(yīng)。這些結(jié)果不能與早期+晚期表達(dá)的值(圖2-AraC)進(jìn)行直接比較，因?yàn)樗鼈儍H保溫5小時(shí)。對(duì)于顯示早期表達(dá)的那些啟動(dòng)子，在表達(dá)7小時(shí)后，再進(jìn)行分析，24小時(shí)后的結(jié)果可以確認(rèn)(數(shù)據(jù)未顯示)。
1.5結(jié)論 上述結(jié)果清楚表明，可以獲得不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子，并且現(xiàn)已有一組不同的啟動(dòng)子，它們因保溫時(shí)間長(zhǎng)短不同以及MVA-BN復(fù)制可能性不同而顯示不同的表達(dá)模式。當(dāng)優(yōu)選早期+晚期表達(dá)時(shí)，優(yōu)選使用啟動(dòng)子A42R、I2R和F6R。當(dāng)必需避免早期表達(dá)時(shí)(例如外來(lái)基因包含早期表達(dá)的終止信號(hào)TTTTTNT時(shí))，優(yōu)選使用B9R、J6R或C7L。
實(shí)施例2分析衍生自SEQ ID NO1-4的最小啟動(dòng)子元件 在實(shí)施例1中，鑒定出數(shù)種特別適于在MVA基因組中表達(dá)外來(lái)基因的序列。為了檢查更短的片段是否也能實(shí)現(xiàn)相同目的，進(jìn)行另外的試驗(yàn)。經(jīng)PCR分離SEQ ID NO 1-4的更短片段，將它們克隆到質(zhì)粒骨架(pBSKS+)中。一共測(cè)試了6種假定的最小啟動(dòng)子。為了分析這些啟動(dòng)子的潛在活性，將它們與GUS報(bào)告基因融合。BHK細(xì)胞用MVA-BN感染，并用含有與GUS基因融合的假定啟動(dòng)子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。通過(guò)測(cè)量GUS表達(dá)，篩選這些假定啟動(dòng)子的活性和表達(dá)強(qiáng)度(見(jiàn)實(shí)施例1)。將已知特性的痘苗病毒啟動(dòng)子Ps與GUS融合進(jìn)行平行分析，以此作為陽(yáng)性對(duì)照和參考。約30bp的最小啟動(dòng)子元件可以用于在重組MVA構(gòu)建體(recMVA-BN)中表達(dá)外來(lái)基因、且無(wú)起始同源序列與另外克隆的啟動(dòng)子之間同源重組的危險(xiǎn)。
2.1材料和方法 如無(wú)另外說(shuō)明，實(shí)施例2中使用的材料和方法與實(shí)施例1的相同。PCR按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行。
2.2試驗(yàn)和結(jié)果 通過(guò)PCR將啟動(dòng)子與GUS基因融合 通過(guò)PCR反應(yīng)使以下最小啟動(dòng)子序列與GUS基因融合 SEQ ID NO7(“A42短晚期(short late)”) TCTTATTAAAAAACATATATAATAAATAACA SEQ ID NO8(“J6R短晚期”) GATAAAAATTTAAAGTGTAAATTAACTAT SEQ ID NO9(“F6R短早期(short early)) AGAGTGTAGTATCATAGATAACTCTCTTCTATAAAAT SEQ ID NO10(“F6R短晚期”) ATTGTTAAATAAATAATGGATAGTATAAAT SEQ ID NO11(“I2R短早期”) AGTAAAAAATATGTTAGGTTTACAAAA SEQ ID NO12(“I2R短晚期”) ATTTATTTTCAGTTTTATTATACGCATAAAT 將所有與GUS基因融合的最小假定啟動(dòng)子克隆到pBSKS+中并測(cè)序。
測(cè)定假定的最小啟動(dòng)子的功能 為了分析假定的最小啟動(dòng)子元件的功能，BHK細(xì)胞用MVA-BN(moi1.0)感染，并用相應(yīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。24小時(shí)后收獲細(xì)胞，將細(xì)胞裂解，測(cè)定GUS活性(圖3)。
陰性對(duì)照(來(lái)自已被MVA-BN感染的細(xì)胞的提取物)明顯顯示無(wú)GUS活性(對(duì)照；平均消光值0.00167)。已知特性的合成性強(qiáng)效Ps啟動(dòng)子顯示非常有效(Ps；平均消光值2.05267)，24小時(shí)的表達(dá)后可以檢測(cè)到高水平的GUS。至于假定的MVA-BN基因組最小啟動(dòng)子元件，結(jié)果顯示，F(xiàn)6R短早期、F6R短晚期、I2R短早期、I2R短晚期、A42R短晚期和J6R短晚期都是有功能的啟動(dòng)子。
一共分離了6種功能性最小啟動(dòng)子元件。其中，2種適于較弱的早期轉(zhuǎn)錄(I2R短早期平均消光值0.06933；F6R短早期平均消光值0.189)，4種適于不同水平的晚期表達(dá)(F6R短晚期平均消光值0.09833；I2R短晚期平均消光值0.391；J6R短晚期平均消光值0.80167 and A42R短晚期平均消光值2.07)。
2.3結(jié)論 上述結(jié)果清楚表明，可以分離到不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子，并且現(xiàn)已有一組不同的啟動(dòng)子。當(dāng)優(yōu)選早期表達(dá)時(shí)，優(yōu)選使用最小啟動(dòng)子F6R短早期或I2R短早期。當(dāng)優(yōu)選晚期表達(dá)且必需避免早期表達(dá)時(shí)(例如外來(lái)基因包含早期表達(dá)的終止信號(hào)TTTTTNT時(shí))，優(yōu)選使用最小啟動(dòng)子元件F6R短晚期、I2R短晚期、J6R短晚期和A42R短晚期。
關(guān)于微生物保藏的說(shuō)明 (細(xì)則13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月) 關(guān)于微生物保藏的說(shuō)明 (細(xì)則13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月) 關(guān)于微生物保藏的說(shuō)明 (細(xì)則13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月) 關(guān)于微生物保藏的說(shuō)明 (細(xì)則13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月) 公共健康實(shí)驗(yàn)室服務(wù)部 應(yīng)用微生物學(xué)和研究中心 本文件在此證明，根據(jù)1977年的布達(dá)佩斯條約，病毒株(保藏號(hào)V94012707)已于1994年01月27日被歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心接受為專利保藏。Dr.Alan Doyle，Curator. 布達(dá)佩斯條約關(guān)于用于專利程序的國(guó)際認(rèn)可的微生物保藏 國(guó)際局表格 收件人 Prof Dr Dr h.c.mult保藏證明 Anton Mayr由本頁(yè)底部所指明的國(guó)際保藏 Bockmeyrstrasse 9單位根據(jù)細(xì)則7.1對(duì)初始保藏 80992Munchen 物出具 Germany 保藏人的姓名和地址
1當(dāng)適用于細(xì)則6.4(d)時(shí)，所述的日期為國(guó)際保藏單位的資格被認(rèn)定的日期。
BP/4表(只此一頁(yè))布達(dá)佩斯條約關(guān)于用于專利程序的國(guó)際認(rèn)可的微生物保藏 國(guó)際局表格 收件人 存活證明 ProfDr Dr h.c.mult Anton Mayr 由下一頁(yè)所指明的國(guó)際保藏單 Bockmeyrstrasse 9 位根據(jù)細(xì)則10.2出具 80992Munchen Germany 應(yīng)接到此存活證明的單位的名稱和地址
1指的是初始保藏日，或者，當(dāng)進(jìn)行了新的保藏或保藏的轉(zhuǎn)換時(shí)，指的是最相關(guān)的日期(新保藏的日期或是轉(zhuǎn)保藏的日期)。
2對(duì)于那些法規(guī)10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情況，指的是最近的存活性檢驗(yàn)。
3用打叉表示選定。
BP/4表(第1頁(yè)) 4如果要求該信息并且如果檢驗(yàn)為陰性，則填寫(xiě)此項(xiàng)。
關(guān)于微生物保藏的說(shuō)明 (細(xì)則13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月) 應(yīng)用微生物學(xué)和研究中心 以及 歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心 本文件在此證明，根據(jù)1977年的布達(dá)佩斯條約，病毒株(保藏號(hào)V00120707)已于2000年12月7日被歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心接受為專利保藏。Dr.P J Packer質(zhì)量經(jīng)理，ECACC 附錄3 第14頁(yè) 布達(dá)佩斯條約關(guān)于用于專利程序的國(guó)際認(rèn)可的微生物保藏國(guó)際局表格 收件人 BAVARIAN NORDIC RESEARCH INSTITUTE GMBH FRAUNHOFERSTRASSE 18B D-82152 MARTINSRIED GERMANY 保藏人的姓名和地址
1當(dāng)適用于細(xì)則6.4(d)時(shí)，所述的日期為國(guó)際保藏單位的資格被認(rèn)定的日期。
BP/4表(只此一頁(yè))附錄3第24頁(yè) 布達(dá)佩斯條約關(guān)于用于專利程序的國(guó)際認(rèn)可的微生物保藏 國(guó)際局表格 收件人存活證明 BAVARIA NNORDIC RESEARCH由下一頁(yè)所指明的國(guó)際保藏單 INSTITUTE GMBH 位根據(jù)細(xì)則10.2出具 FRAUNHOFERSTRASSE 18B D-82152 MARTINSRIED GERMANY 應(yīng)接到此存活證明的單位的名稱和地址
1指的是初始保藏日，或者，當(dāng)進(jìn)行了新的保藏或保藏的轉(zhuǎn)換時(shí)，指的是最相關(guān)的日期(新保藏的日期或是轉(zhuǎn)保藏的日期)。
2對(duì)于那些法規(guī)10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情況，指的是最近的存活性檢驗(yàn)。
3用打叉表示選定。
BP/4表(第1頁(yè)) 附錄3 第25頁(yè) 4如果要求該信息并且如果檢驗(yàn)為陰性，則填寫(xiě)此項(xiàng)。分析試驗(yàn)的證書(shū) 產(chǎn)物描述 MVA-575 保藏號(hào)00120707 試驗(yàn)描述確定病毒的致細(xì)胞病變滴度TCID50。(SOP ECACC/055)細(xì)胞 接受標(biāo)準(zhǔn)/說(shuō)明/標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照應(yīng)顯示沒(méi)有致細(xì)胞病變效應(yīng)的跡象。將檢驗(yàn)樣品進(jìn)行系列稀釋，然后添加到含有指示細(xì)胞系的孔中，每一稀釋度有4個(gè)孔。致細(xì)胞病變效應(yīng)指示病毒的存在。病毒滴度用下式計(jì)算，其中x是從標(biāo)準(zhǔn)TCID50表得到的值，它是每一稀釋度展示少于4個(gè)陽(yáng)性孔的那些孔的分布結(jié)果，y是4個(gè)孔都為陽(yáng)性的最高稀釋度。
日期 19/01/01 結(jié)果 指示細(xì)胞系 BHK 21克隆13 陰性對(duì)照 無(wú)CPE 檢驗(yàn)樣品 CPE 少于4個(gè)陽(yáng)性孔的分布 4，4，0 X0.50 Y10-5 總體結(jié)果存在病毒 試驗(yàn)描述對(duì)在支原體豬血清瓊脂和支原體馬血清肉湯中分離的支原體進(jìn)行檢測(cè)。
SOP QC/MYCO/01/02 接受標(biāo)準(zhǔn)/說(shuō)明所有陽(yáng)性對(duì)照(肺炎支原體(M.pneumoniae)和口腔支原體(M.orale))必須顯示支原體跡象，為在瓊脂板上形成典型的集落。將培養(yǎng)物在支原體豬血清瓊脂板上進(jìn)一步培養(yǎng)，以便評(píng)估由典型集落的形成指示的支原體跡象。所有陰性對(duì)照必須無(wú)微生物生長(zhǎng)跡象。
陽(yáng)性檢驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)是，在瓊脂板上形成典型集落所指示的支原體跡象。陰性結(jié)果將顯示無(wú)此跡象。
試驗(yàn)號(hào)21702 日期12/02/01 結(jié)果陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性 陰性對(duì)照陰性 檢驗(yàn)結(jié)果陰性 總體結(jié)果通過(guò) 批準(zhǔn)人＿＿＿＿＿ECACC質(zhì)量主管 日期＿＿＿＿＿ 分析試驗(yàn)的證書(shū) 產(chǎn)物描述 MVA-575 保藏號(hào)00120707 試驗(yàn)描述使用Vero指示細(xì)胞系和Hoechst 33258熒光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)支原體SOP QC/MYCO/07/05 接受標(biāo)準(zhǔn)/說(shuō)明陰性對(duì)照中，Vero細(xì)胞可以清楚地觀察到熒光核而細(xì)胞質(zhì)無(wú)熒光。陽(yáng)性對(duì)照(口腔支原體(M.orale))中必須顯示支原體的跡象，即熒光核以及額外的支原體DNA的核熒光。陽(yáng)性檢驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)為額外的支原體DNA核熒光。陰性結(jié)果顯示無(wú)細(xì)胞質(zhì)熒光。
試驗(yàn)號(hào)21702 日期12/02/01 結(jié)果 陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性 陰性對(duì)照陰性 檢驗(yàn)結(jié)果陰性 總體結(jié)果通過(guò) 試驗(yàn)描述對(duì)在Tryptone Soya Broth(TSB)上和在流質(zhì)巰基乙酸培養(yǎng)基(FTGM)中分離的細(xì)菌和真菌進(jìn)行檢測(cè)。SOP QC/BF/01/02 接受標(biāo)準(zhǔn)/說(shuō)明所有陽(yáng)性對(duì)照(枯草牙孢桿菌(Bacillis subtilus)，生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)和白色念珠菌(Candida albicans))顯示微生物生長(zhǎng)跡象(混濁)，而陰性對(duì)照不顯示微生物生長(zhǎng)跡象(清亮)。
陽(yáng)性檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)是，在任一種試驗(yàn)培養(yǎng)基中混濁。陰性檢驗(yàn)結(jié)果必須是在所有培養(yǎng)基中清亮。
試驗(yàn)號(hào)21702 日期12/02/01 結(jié)果 陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性 陰性對(duì)照陰性 檢驗(yàn)結(jié)果陰性 總體結(jié)果通過(guò) 批準(zhǔn)人＿＿＿＿＿ECACC質(zhì)量主管 日期＿＿＿＿＿＿ 僅供ECACC填寫(xiě) ECACC 保藏號(hào) 保藏人編碼 專利保藏登錄表格—病毒 保藏人信息 保藏人/公司/機(jī)構(gòu)名稱 Bavarian Nordic Research Institute GmbH (這將是證明書(shū)上出現(xiàn)的名稱) 聯(lián)系人名稱 Dr.Paul M.Howley，Dr.Petre Pielken 保藏人地址 Fraunhoferstraβe 18b，D-82152 Martinsried，Germany 電話++49 89 8565 0030 傳真++49 89 8565 1333 必須附帶的生物危害聲明 該保藏根據(jù)1977年布達(dá)佩斯條約的條款進(jìn)行。我同意遵守關(guān)于向ECACC保藏細(xì)胞系的條件和規(guī)則。

寄送發(fā)票的地址(如果與上述不同) Accounts Department Bavarian Nordic Research Institute GmbH Fraunhoferstraβe 18b，D-82152 Martinsried，Germany 病毒信息 全稱 改良安卡拉痘苗病毒 簡(jiǎn)稱 MVA 安瓿瓶標(biāo)識(shí)＿＿＿＿＿＿＿＿ 菌株 第575號(hào) 血清型＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 正常宿主 無(wú) 保藏的病毒的滴度＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 病毒增殖 宿主細(xì)胞(首選)雞胚成纖維細(xì)胞(CEF) 可選宿主細(xì)胞＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的詳細(xì)資料(例如培養(yǎng)基、溫度、接種密度、生長(zhǎng)因子等) 雞胚成纖維細(xì)胞于37℃、5％CO2在添加了10％FCS的RPMI培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。不需生長(zhǎng)因子。
病毒生長(zhǎng)的詳細(xì)資料(例如宿主細(xì)胞匯合、共培養(yǎng)、moi、效應(yīng)、耗時(shí)) 在接近細(xì)胞匯合(約90％)時(shí)以MOI0，1 TCID50/細(xì)胞匯合感染CEF細(xì)胞在37℃、5％CO2中的感染時(shí)間平均為3天 病毒儲(chǔ)藏 儲(chǔ)藏的材料(例如上清液、被感染的細(xì)胞的提取物、被感染的活細(xì)胞等) 溫度和條件被感染的細(xì)胞的提取物，-80℃ 病毒分析 方法(如果需要可寫(xiě)明)不形成噬菌斑。在CEF單層上形成CPE灶。用TCID50法滴定。
參考文獻(xiàn)(如果有) Ingo Drexler et al.2000，Methods in Molecular Medicine vol 35Gene Therapy，Methods and Protocol.s Ed.W.Walther andU.Stein.Human Press 其他相關(guān)信息 在低pH時(shí)病毒釋放活力。用無(wú)菌IMM Tris-HCl pH9緩沖液稀釋病毒。
CAMR 歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，應(yīng)用微生物學(xué)和研究中心 Salisbury，Wiltshir SP4 OJG，UK 電話+44 1980 612512 傳真+44 1980 611315 Emailecacc@camr.org.uk網(wǎng)址ecacc.camr.org.uk 僅供ECACC填寫(xiě) ECACC保藏號(hào) 保藏人編碼 生物危害聲明 (所有保藏物都需包含在本聲明) 保藏物類別 細(xì)胞培養(yǎng)物□ 植物培養(yǎng)物□ 病毒重組DNA□ DNA探針□ 細(xì)菌□ 上述保藏物是否表現(xiàn)感染性、毒性或過(guò)敏性危害？ 是□ 否
如果是，請(qǐng)給出詳細(xì)說(shuō)明及相關(guān)的危害類別(例如ACDP類別)并向ECACC PRIOR發(fā)傳真以便航運(yùn)細(xì)胞。
MVA被ZKBS歸類為生物安全1級(jí)(S1) 檔案號(hào)6790-10-14 日期1997年5月 上述保藏物是否包含可遺傳操作的物質(zhì)？ 是□ 否
如果是，請(qǐng)寫(xiě)出普通的描述并回答下列問(wèn)題 a.該物質(zhì)是 DNA□ RNA□ b.該物質(zhì)是否存在于宿主生物中？ 是□ 否□ c.該遺傳物質(zhì)是否容易轉(zhuǎn)移給環(huán)境生物？ 是□ 否□ d.該遺傳物質(zhì)是否易被表達(dá)為蛋白質(zhì)？ 是□ 否□ e.這一物質(zhì)按照ACGM規(guī)定屬于什么類別？ 即，i防范級(jí)別＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ ii.GMO類型＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 對(duì)于問(wèn)題b-d為肯定回答時(shí)請(qǐng)給出詳細(xì)說(shuō)明 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 對(duì)于將在ECACC進(jìn)行保藏的物質(zhì)，請(qǐng)?zhí)峁┡c評(píng)估其安全操作條件有關(guān)的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
姓名打印 Dr.Petra Pielken 請(qǐng)注意，本身是動(dòng)物病原體或包含動(dòng)物病原體的保藏物需要EC的入境許可。請(qǐng)留出8周時(shí)間，以便盡快遞交ECACC許可證申請(qǐng)所要求的信息。
CAMR 歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，應(yīng)用微生物學(xué)和研究中心 Salisbury，Wiltshir SP4 OJG，UK 電話+44 1980 612512 傳真+44 1980 611315 Emailecacc@camr.org.uk 網(wǎng)址ecacc.camr.org.uk 關(guān)于微生物保藏的說(shuō)明 (細(xì)則13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月) 應(yīng)用微生物學(xué)和研究中心 以及 歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心 本文件在此證明，根據(jù)1977年的布達(dá)佩斯條約，病毒株(保藏號(hào)V00083008)已于2000年8月30日被歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心接受為專利保藏。Dr.P J Packer質(zhì)量經(jīng)理，ECACC BP/4表格(第1頁(yè))附錄3第25頁(yè) 4如果要求該信息并且如果檢驗(yàn)為陰性，則填寫(xiě)此項(xiàng)。 附錄3 第24頁(yè) 布達(dá)佩斯條約關(guān)于用于專利程序的國(guó)際認(rèn)可的微生物保藏 國(guó)際局表格 收件人存活證明 BAVARIAN NORDIC RESEARCH由下一頁(yè)所指明的國(guó)際保 INSTITUTE GMBH 藏單位根據(jù)細(xì)則10.2出具 FRAUNHOFERSTRASSE 18B D-82152 MARTINSRIED Germany 應(yīng)接到此存活證明的 單位的名稱和地址
1指的是初始保藏日，或者，當(dāng)進(jìn)行了新的保藏或保藏的轉(zhuǎn)換時(shí)，指的是最相關(guān)的日期(新保藏的日期或是轉(zhuǎn)保藏的日期)。
2對(duì)于那些法規(guī)10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情況，指的是最近的存活性檢驗(yàn)。
3用打叉表示選定。
附錄3 第14頁(yè) 布達(dá)佩斯條約關(guān)于用于專利程序的國(guó)際認(rèn)可的微生物保藏 國(guó)際局表格 收件人 BAVARIAN NORDIC RESEARCH INSTITUTE GMBH FRAUNHOFERSTRASSE 18B D-82152 MARTINSRIED GERMANY 保藏人的姓名和地址
1當(dāng)適用于細(xì)則6.4(d)時(shí)，所述的日期為國(guó)際保藏單位的資格被認(rèn)定的日期。
BP/4表(只此一頁(yè)) 分析試驗(yàn)的證書(shū) 產(chǎn)物描述 MVA-BN 保藏號(hào)00083008 試驗(yàn)描述對(duì)在支原體豬血清瓊脂和支原體馬血清肉湯中分離的支原體進(jìn)行檢測(cè)。 SOP QC/MYCO/01/02 接受標(biāo)準(zhǔn)/說(shuō)明所有陽(yáng)性對(duì)照(肺炎支原體(M.pneumoniae)和口腔支原體(M.orale))必須顯示支原體跡象，為在瓊脂板上形成典型的集落。將培養(yǎng)物在支原體豬血清瓊脂板上進(jìn)一步培養(yǎng)，以便評(píng)估由典型集落的形成指示的支原體跡象。所有陰性對(duì)照必須無(wú)微生物生長(zhǎng)跡象。
陽(yáng)性檢驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)是，在瓊脂板上形成典型集落所指示的支原體跡象。陰性結(jié)果將顯示無(wú)此跡象。
試驗(yàn)號(hào)21487 日期27/11/00 結(jié)果陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性 陰性對(duì)照陰性 檢驗(yàn)結(jié)果陰性 總體結(jié)果通過(guò) 試驗(yàn)描述使用Vero指示細(xì)胞系和Hoechst 33258熒光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)支原體 SOP QC/MYCO/07/05 接受標(biāo)準(zhǔn)/說(shuō)明陰性對(duì)照中，Vero細(xì)胞可以清楚地觀察到熒光核而細(xì)胞質(zhì)無(wú)熒光。陽(yáng)性對(duì)照(口腔支原體(M.orale))中必須顯示支原體的跡象，即熒光核以及外加的支原體DNA的核熒光。陽(yáng)性檢驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)為外加的支原體DNA核熒光。陰性結(jié)果顯示無(wú)細(xì)胞質(zhì)熒光。
試驗(yàn)號(hào)21487 日期27/11/00 結(jié)果 陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性 陰性對(duì)照陰性 檢驗(yàn)結(jié)果陰性 總體結(jié)果通過(guò) 批準(zhǔn)人＿＿＿＿ECACC質(zhì)量主管 日期＿＿＿＿＿ 分析試驗(yàn)的證書(shū) 產(chǎn)物描述 MVA-BN 保藏號(hào)00083008 試驗(yàn)描述對(duì)在Tryptone Soya Broth(TSB)上和在流質(zhì)巰基乙酸培養(yǎng)基(FTGM)中分離的細(xì)菌和真菌進(jìn)行檢測(cè)。SOP QC/BF/01/02 接受標(biāo)準(zhǔn)/說(shuō)明所有陽(yáng)性對(duì)照(枯草牙孢桿菌(Bacillis subtilus)，生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)和白色念珠菌(Candida albicans))顯示微生物生長(zhǎng)跡象(混濁)，而陰性對(duì)照不顯示微生物生長(zhǎng)跡象(清亮)。
陽(yáng)性檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)是，在任一種試驗(yàn)培養(yǎng)基中混濁。陰性檢驗(yàn)結(jié)果必須是在所有培養(yǎng)基中清亮。
試驗(yàn)號(hào)21487 日期27/11/00 結(jié)果 陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性 陰性對(duì)照陰性 檢驗(yàn)結(jié)果陰性 總體結(jié)果通過(guò) 試驗(yàn)描述確定病毒的致細(xì)胞病變滴度TCID50。(SOP ECACC/055)細(xì)胞 接受標(biāo)準(zhǔn)/說(shuō)明/標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照應(yīng)顯示沒(méi)有致細(xì)胞病變效應(yīng)的跡象。將檢驗(yàn)樣品進(jìn)行系列稀釋，然后添加到含有指示細(xì)胞系的孔中，每一稀釋度有4個(gè)孔。致細(xì)胞病變效應(yīng)指示病毒的存在。病毒滴度用下式計(jì)算，其中x是從標(biāo)準(zhǔn)TCID50表得到的值，它是每一稀釋度展示少于4個(gè)陽(yáng)性孔的那些孔的分布結(jié)果，y是4個(gè)孔都為陽(yáng)性的最高稀釋度。
日期 01/12/00 結(jié)果 指示細(xì)胞系BHK 21(克隆13) 陰性對(duì)照 無(wú)CPE 檢驗(yàn)樣品 CPE 少于4個(gè)陽(yáng)性孔的分布 4，4，4，3，0 X 1.25 Y 10-3 總體結(jié)果存在病毒 批準(zhǔn)人＿＿＿＿ECACC質(zhì)量主管 日期＿＿＿＿僅供ECACC填寫(xiě) ECACC 保藏號(hào)保藏人編碼 專利保藏登錄表格—病毒 保藏人信息 保藏人/公司/機(jī)構(gòu)名稱 Bavarian Nordic Research Institute GmbH (這將是證明書(shū)上出現(xiàn)的名稱) 聯(lián)系人名稱 Dr.Paul M.Howley，Dr.Petre Pielken 保藏人地址 Fraunhoferstraβe 18b，D-82152 Martinsried，Germany 電話 ++49 89 8565 0030 傳真++49 89 8565 1333 必須附帶的生物危害聲明 該保藏根據(jù)1977年布達(dá)佩斯條約的條款進(jìn)行。我同意遵守關(guān)于向ECACC保藏細(xì)胞系的條件和規(guī)則。

寄送發(fā)票的地址(如果與上述不同) Accounts Department，Bavarian Nordic Research Institute GmbH Fraunhoferstraβe 18b，D-82152 Martinsried，Germany 病毒信息 全稱 改良安卡拉痘苗病毒 簡(jiǎn)稱 MVA-BN安瓿瓶標(biāo)識(shí)Lot 010500 菌株 vral#3；32；51；76；82；85；84；88；98；99；106；109 正常宿主 無(wú) 保藏的病毒的滴度＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 病毒增殖 宿主細(xì)胞(首選) 雞胚成纖維細(xì)胞(CEF) 可選宿主細(xì)胞＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的詳細(xì)資料(例如培養(yǎng)基、溫度、接種密度、生長(zhǎng)因子等) 雞胚成纖維細(xì)胞干37℃、5％CO2在添加了10％FCS的RPMI培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。不需生長(zhǎng)因子。
病毒生長(zhǎng)的詳細(xì)資料(例如宿主細(xì)胞匯合、共培養(yǎng)、moi、效應(yīng)、耗時(shí)) 在接近細(xì)胞匯合(約90％)時(shí)以MOI0，1TCID50/細(xì)胞匯合感染CEF細(xì)胞；在37℃、5％CO2中的感染時(shí)間平均為3天 病毒儲(chǔ)藏 儲(chǔ)藏的物質(zhì)(例如上清液、被感染的細(xì)胞的提取物、被感染的活細(xì)胞等) 溫度和條件 被感染的細(xì)胞的提取物，-80℃ 病毒分析 方法(如果需要可寫(xiě)明)不形成噬菌斑。在CEF單層上形成CPE灶。用TCID50法滴定。
參考文獻(xiàn)(如果有) Ingo Drexler et al.2000，Methods in Molecular Me dicine vol 35Gene Therapy，Methods and Protocol.s Ed.W.Walther andU.Stein.Human Press 其他相關(guān)信息 在低pH時(shí)病毒釋放活力。用無(wú)菌IMM Tris-HCl pH9緩沖液稀釋病毒。
CAMR 歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，應(yīng)用微生物學(xué)和研究中心 Salisbury，Wiltshir SP4 OJG，UK 電話+44 1980 612512 傳真+44 1980 611315 Emailecacc@camr.org.uk網(wǎng)址ecacc.camr.org.uk僅供ECACC填寫(xiě)ECACC 保藏號(hào)保藏人編碼 生物危害聲明 (所有保藏物都需包含在本聲明) 保藏物類別 細(xì)胞培養(yǎng)物□ 植物培養(yǎng)物□ 病毒重組DNA□ DNA探針□細(xì)菌□ 上述保藏物是否表現(xiàn)感染性、毒性或過(guò)敏性危害？ 是□ 否
如果是，請(qǐng)給出詳細(xì)說(shuō)明及相關(guān)的危害類別(例如ACDP類別)并向ECACC PRIOR發(fā)傳真以便航運(yùn)細(xì)胞。
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 上述保藏物是否包含可遺傳操作的物質(zhì)？ 是□ 否
如果是，請(qǐng)寫(xiě)出普通的描述并回答下列問(wèn)題 a.該物質(zhì)是 DNA□ RNA□ b.該物質(zhì)是否存在于宿主生物中？是□ 否□ c.該遺傳物質(zhì)是否容易轉(zhuǎn)移給環(huán)境生物？ 是□ 否□ d.該遺傳物質(zhì)是否易被表達(dá)為蛋白質(zhì)？是□ 否□ e.這一物質(zhì)按照ACGM規(guī)定屬于什么類別？ 即，i防范級(jí)別＿＿＿＿＿＿＿＿＿ ii.GMO類型＿＿＿＿＿＿＿＿ 對(duì)于問(wèn)題b-d為肯定回答時(shí)請(qǐng)給出詳細(xì)說(shuō)明 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ ＿＿＿＿ 對(duì)于將在ECACC進(jìn)行保藏的物質(zhì)，請(qǐng)?zhí)峁┡c評(píng)估其安全操作條件有關(guān)的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明 在人體和動(dòng)物體內(nèi)高度減毒不能復(fù)制
姓名打印 Dr.Petra Pielken 請(qǐng)注意，本身是動(dòng)物病原體或包含動(dòng)物病原體的保藏物需要EC的入境許可。請(qǐng)留出8周時(shí)間，以便盡快遞交ECACC許可證申請(qǐng)所要求的信息。
CAMR 歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，應(yīng)用微生物學(xué)和研究中心 Salisbury，Wiltshir SP4 OJG，UK 電話+44 1980 612512 傳真+44 1980 611315 Emailecacc@camr.org.uk網(wǎng)址ecacc.camr.org.uk
序列表
<110>巴法里安諾迪克有限公司(Bavarian Nordic A/S)
<120>用于在改良安卡拉痘苗病毒中進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子
<130>BN54PCT
<150>DK PA200301730
<151>2003-11-24
<150>EP04000943.3
<151>2004-01-17
<160>12
<170>Patent In version 3.3
<210>1
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<212>DNA
<213>改良安卡拉痘苗病毒
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tctgcaatat tgttatcgta attggaaaaa tagtgttcga gtgagttgga ttatgtgagt60
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atttattttc agttttatta tacgcataaa t 3權(quán)利要求
1.啟動(dòng)子，含有選自下組的核苷酸序列，或由所述序列組成
(i)核苷酸序列SEQ ID NO1-6之一，
(ii)SEQ IDNo.1-6之一的亞序列，和
(iii)相對(duì)于(i)或(ii)所述序列具有一或多個(gè)核苷酸取代、缺失和/或插入的序列，
其中所述啟動(dòng)子可以作為痘苗病毒啟動(dòng)子發(fā)揮作用和/或可以在被痘苗病毒感染的細(xì)胞中發(fā)揮作用。
2.權(quán)利要求1的啟動(dòng)子，其中所述亞序列選自SEQ ID7-12。
3.表達(dá)盒，包含編碼序列和權(quán)利要求1或2的啟動(dòng)子，所述編碼序列的表達(dá)受所述啟動(dòng)子控制，且所述表達(dá)盒并非痘苗病毒基因組中天然的表達(dá)盒。
4.權(quán)利要求3的表達(dá)盒，其中所述編碼序列編碼治療性蛋白或肽，抗原，抗原表位，反義RNA或核酶。
5.DNA，含有權(quán)利要求1或2的啟動(dòng)子或者含有權(quán)利要求3或4的表達(dá)盒。
6.載體，含有權(quán)利要求1或2的啟動(dòng)子或者含有權(quán)利要求3或4的表達(dá)盒。
7.權(quán)利要求6的載體，選自質(zhì)粒載體和病毒載體。
8.權(quán)利要求7的載體，所述病毒載體是痘苗病毒。
9.權(quán)利要求8的載體，所述痘苗病毒是改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，優(yōu)選在歐州細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)以保藏號(hào)V00083008保藏的病毒株MVA-BN或其衍生物，以保藏號(hào)ECACC VA94012707保藏的病毒株MVA572，或以保藏號(hào)ECACC V00120707保藏的病毒株MVA 575。
10.權(quán)利要求9的載體，其中權(quán)利要求1或2的啟動(dòng)子或者權(quán)利要求3或4的表達(dá)盒插入在MVA基因組的天然缺失位點(diǎn)中。
11.權(quán)利要求9的載體，其中權(quán)利要求1或2的啟動(dòng)子或者權(quán)利要求3或4的表達(dá)盒插入在病毒基因組的非必需部分或者基因間區(qū)域中。
12.權(quán)利要求6-11之一的載體，作為疫苗或藥物。
13.疫苗或藥物組合物，含有權(quán)利要求3或4的表達(dá)盒，權(quán)利要求5的DNA，或權(quán)利要求6-11之一的載體。
14.權(quán)利要求13的疫苗或藥物組合物，包含至少102TCID50(組織培養(yǎng)感染劑量)的權(quán)利要求8-11之一所述病毒載體。
15.權(quán)利要求14的疫苗或藥物組合物，所述病毒載體在第一次接種(“初次接種”)和第二次接種(“加強(qiáng)接種”)中以治療有效量施用。
16.權(quán)利要求3或4的表達(dá)盒，權(quán)利要求5的DNA，或權(quán)利要求6-11之一的載體在制備疫苗或藥物中的用途。
17.將編碼序列引入靶細(xì)胞的方法，包括將權(quán)利要求6-11之一的載體，權(quán)利要求3或4的表達(dá)盒，或權(quán)利要求5的DNA引入所述靶細(xì)胞。
18.制備肽、蛋白和/或病毒的方法，包括用權(quán)利要求7-11之一的病毒載體感染宿主細(xì)胞，在合適的條件下培養(yǎng)被感染的宿主細(xì)胞，以及分離和/或富集所述宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的肽和/或蛋白和/或病毒。
19.制備肽、蛋白和/或病毒的方法，包括用權(quán)利要求3或4的表達(dá)盒、權(quán)利要求5的DNA、或權(quán)利要求7的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用痘苗病毒感染所述細(xì)胞，在合適的條件下培養(yǎng)被感染的宿主細(xì)胞，以及分離和/或富集由所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生的肽和/或蛋白和/或病毒，其中用痘苗病毒感染細(xì)胞的步驟可以在細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟之前或之后進(jìn)行。
20.細(xì)胞，含有權(quán)利要求1或2的啟動(dòng)子，權(quán)利要求3或4的表達(dá)盒，權(quán)利要求5的DNA，或權(quán)利要求7-11之一的病毒載體。
21.權(quán)利要求1或2的啟動(dòng)子用于表達(dá)編碼序列的用途，其中所述編碼序列并非在痘苗病毒中與所述啟動(dòng)子天然連接的序列。
22.制備權(quán)利要求6-11之一的載體的方法，包括將權(quán)利要求3或4的表達(dá)盒插入該載體基因組中的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及啟動(dòng)子，尤其是用于在痘苗病毒如改良安卡拉痘苗病毒(MVA)中表達(dá)基因和/或編碼序列的啟動(dòng)子。本發(fā)明還涉及包含該啟動(dòng)子的表達(dá)盒，含有該表達(dá)盒的載體，以及藥物組合物和疫苗。
文檔編號(hào)C07K14/07GK1898390SQ200480034748
公開(kāi)日2007年1月17日 申請(qǐng)日期2004年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月24日
發(fā)明者桑賈·萊勒 申請(qǐng)人:巴法里安諾迪克有限公司