專利名稱：使用Sec－系統(tǒng)分泌的改進(jìn)的表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)制造領(lǐng)域并且是一種改進(jìn)的通過使用Sec導(dǎo)向肽和熒光假單胞菌Sec分泌系統(tǒng)制造適當(dāng)加工的外源蛋白的方法。
背景技術(shù)：
美國食品藥品管理局(U.S.Food and Drug Administration)(FDA)已經(jīng)批準(zhǔn)了超過150種重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和肽作為生物技術(shù)合成藥和疫苗以及另外370種用于臨床試驗(yàn)。與通過化學(xué)合成產(chǎn)生的小分子治療劑不同，蛋白質(zhì)和肽在活細(xì)胞內(nèi)最有效地產(chǎn)生。然而，在細(xì)菌中制造重組蛋白的現(xiàn)有方法通常產(chǎn)生不當(dāng)折疊、聚集或失活的蛋白質(zhì)，并且許多類型的蛋白質(zhì)要求二次修飾，這使用已知方法難以實(shí)現(xiàn)。
已知方法的一個(gè)主要問題在于在細(xì)胞質(zhì)中形成由聚集蛋白構(gòu)成的包含體，這在過量蛋白質(zhì)在細(xì)胞中積聚時(shí)產(chǎn)生。重組蛋白制造中的另一問題是形成表達(dá)蛋白的恰當(dāng)?shù)亩壓腿壗Y(jié)構(gòu)。一個(gè)障礙是細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)積極抑制了二硫鍵形成(其通常構(gòu)成恰當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)折疊的基礎(chǔ))(Derman等(1993)Science 2621744-7)。因此，在細(xì)菌中進(jìn)行制造時(shí)，許多重組蛋白，特別是真核來源的重組蛋白不當(dāng)折疊和失活。
為提高重組系統(tǒng)中恰當(dāng)折疊的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，已經(jīng)進(jìn)行了許多嘗試。例如，研究者改變了發(fā)酵條件(Schein(1989)Bio/Technology，71141-1149)，改變啟動(dòng)子強(qiáng)度或使用過度表達(dá)的伴侶蛋白(Hockney(1994)Trends Biotechnol.12456-463)，這些有助于防止包含體的形成。
分泌提高恰當(dāng)折疊的蛋白質(zhì)產(chǎn)量的另一方法是從細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中分泌蛋白質(zhì)。在革蘭氏陰性細(xì)菌中，細(xì)胞質(zhì)分泌的蛋白質(zhì)可以在周質(zhì)空間中豎立(end up)、連接到外膜上，或在細(xì)胞外液體中。如果從細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中分泌出蛋白質(zhì)，則通常不會形成由聚集蛋白構(gòu)成的包含體。分泌到周質(zhì)空間中還具有公知的促進(jìn)恰當(dāng)?shù)亩蜴I形成的作用(Bardwell等(1994)Phosphate Microorg.270-5；Manoil(2000)Methods in Enz.32635-47)。重組蛋白的分泌是有利的，因?yàn)檫@會產(chǎn)生更有效的蛋白質(zhì)分離；可以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)的恰當(dāng)折疊和二硫鍵形成，從而導(dǎo)致活性形式的蛋白質(zhì)百分率的增加；可以減少包含體的形成并降低對宿主細(xì)胞的毒性；并且可以提高可溶形式的重組蛋白的百分率。相關(guān)蛋白質(zhì)分泌進(jìn)入培養(yǎng)基的能力也可能促進(jìn)蛋白質(zhì)制造的連續(xù)而非分批培養(yǎng)。
革蘭氏陰性細(xì)菌已經(jīng)演化出許多用于使蛋白質(zhì)穿過其雙重膜的有效輸出的系統(tǒng)(參看

圖1)。這些分泌途徑包括，例如用于一步穿過內(nèi)在質(zhì)及外膜易位的ABC(I型)路徑、Path/Fla(III型)路徑和Path/Vir(IV型)路徑；用于穿過質(zhì)膜易位的Sec(II型)、Tat、MscL和Holins路徑；和用于兩步穿過內(nèi)在質(zhì)和外膜易位的Sec-加-fimbrial usher孔蛋白(FUP)、Sec-加-自動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)子(AT)、Sec-加-兩partner分泌(TPS)、Sec-加-主末端分支(MTB)和Tat-加-MTB路徑。并非所有細(xì)菌都具有所有這些分泌路徑。
三種蛋白質(zhì)系統(tǒng)(I、III和IV型)在單個(gè)能量結(jié)合步驟中同時(shí)穿過兩膜分泌蛋白質(zhì)。四種系統(tǒng)(Sec、Tat、MscL和Holins)僅穿過內(nèi)膜分泌，另外四個(gè)系統(tǒng)(MTB、FUP、AT和TPS)僅穿過外膜分泌。
帶有信號序列的肽的最常見分泌形式包括Sec系統(tǒng)。Sec系統(tǒng)負(fù)責(zé)使帶有N-末端信號肽的蛋白質(zhì)穿過細(xì)胞質(zhì)膜輸出(參看Agarraberesand Dice(2001)Biochim Biophys Acta.15131-24；Muller等(2001)Prog Nucleic Acid Res Mol Biol.66107-157)。在原核生物和真核生物中普遍發(fā)現(xiàn)Sec族蛋白復(fù)合物。細(xì)菌Sec系統(tǒng)包括轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、伴侶蛋白(SecB)或信號識別粒子(SRP)和信號肽酶(SPase I和SPase II)。大腸桿菌(E.coli)中的Sec轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物包括三種整合內(nèi)膜蛋白，SecY、SecE和SecG，和細(xì)胞質(zhì)ATPase、SecA。SecA吸收SecY/E/G復(fù)合物以形成活性易位通道。伴侶蛋白SecB結(jié)合到新生多肽鏈上以防止其折疊并將其導(dǎo)向SecA中。直線多肽鏈隨后通過SecYEG通道轉(zhuǎn)移，并在信號肽裂解之后，蛋白質(zhì)在周質(zhì)中折疊。三種輔助蛋白(SecD、SecF和YajC)形成了不是分泌所必須的但卻在許多條件(特別是在低溫)下最高10倍地刺激分泌的復(fù)合物。
轉(zhuǎn)移到周質(zhì)中(也就是通過II型分泌系統(tǒng))的蛋白質(zhì)還可以在進(jìn)一步的步驟中被輸出到細(xì)胞外介質(zhì)中。其機(jī)制通常是通過自動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)子、兩partner分泌系統(tǒng)、主末端分支系統(tǒng)或fimbrial usher孔蛋白。
在革蘭氏陰性細(xì)菌中的十二種已知分泌系統(tǒng)中，八種采用了據(jù)發(fā)現(xiàn)作為表達(dá)蛋白的一部分的導(dǎo)向信號肽。這些信號肽與分泌系統(tǒng)的蛋白質(zhì)互相作用，從而使細(xì)胞正確地將蛋白質(zhì)引向其合適的目的地。這八種信號肽基分泌系統(tǒng)中的五種涉及Sec-系統(tǒng)。這五種被認(rèn)為參與了Sec-依賴(Sec-dependent)的細(xì)胞質(zhì)膜易位，而且在其中起作用的它們的信號肽可以被稱作Sec依賴的分泌信號。產(chǎn)生恰當(dāng)分泌信號的要點(diǎn)之一是確保信號被恰當(dāng)?shù)乇磉_(dá)并從表達(dá)蛋白中裂解。
Sec-依賴的蛋白質(zhì)輸出的一個(gè)標(biāo)志是在輸出的蛋白質(zhì)中存在短(大約30個(gè)氨基酸)的主要疏水的氨基末端信號序列。該信號序列輔助蛋白質(zhì)輸出并且在輸出的蛋白質(zhì)到達(dá)周質(zhì)時(shí)被周質(zhì)信號肽酶切除。典型的N-末端Sec-信號肽含有帶有至少一個(gè)精氨酸或賴氨酸殘基的N-區(qū)，然后是含有一段疏水殘基的區(qū)，以及含有信號肽酶裂解位點(diǎn)的C-區(qū)。
已經(jīng)研發(fā)出如下細(xì)菌蛋白制造系統(tǒng)——在該系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)基因蛋白結(jié)構(gòu)通過基因工程設(shè)計(jì)成既包含相關(guān)蛋白質(zhì)又包含試圖將該蛋白質(zhì)導(dǎo)出細(xì)胞質(zhì)的分泌信號的融合蛋白。
已經(jīng)研發(fā)出將蛋白質(zhì)從細(xì)胞分泌到上清液中的方法。例如，Georgious的美國專利5,348,867集中于細(xì)胞表面上的肽表達(dá)。授予Korea Advanced Institute of Science and Technology的美國專利6,329,172描述了在熒光假單胞菌中的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子和通過使用這種與相關(guān)蛋白共表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)子將蛋白分泌到細(xì)胞外的方法。授予NovoNordisk的PCT公開WO 96/17943集中于通過從周質(zhì)中滲漏來從細(xì)胞中進(jìn)行蛋白質(zhì)的細(xì)胞外表達(dá)，其使用了與相關(guān)蛋白質(zhì)相連的A.lyticus蛋白酶I和某些桿菌蛋白酶的序列的一部分以將它們導(dǎo)向周質(zhì)。授予Boehringer Ingelheim，Int.的PCT公開WO 02/40696和美國申請公開2003/0013150描述了使用細(xì)菌信號肽OmpA的蛋白質(zhì)的細(xì)胞外表達(dá)。這些公開論述了OmpA單獨(dú)與SecE相互作用或與包含氨基酸序列SEGN的蛋白質(zhì)或肽結(jié)合相互作用。
提高表達(dá)的其它方法涉及將蛋白質(zhì)導(dǎo)向周質(zhì)。一些研究集中于非-Sec型分泌(參看，例如，授予Trustees of the University of Pennsylvania的PCT公開WO 03/079007；美國公開2003/0180937，授予Weiner andTurner的美國公開2003/0064435；和授予Research Foundaion of theState University of New York的PCT公開WO 00/59537)。然而，多數(shù)研究都集中于使用Sec-型分泌系統(tǒng)的外源蛋白分泌。
已經(jīng)描述了許多用于表達(dá)重組肽或蛋白質(zhì)的分泌信號。例如，授予Celtrix Pharmaceuticals，Inc.的美國專利5,914,254描述了使用來自白細(xì)胞介素-1-類蛋白質(zhì)的融合partners和前導(dǎo)序列提高蛋白質(zhì)的溶度和活性。
授予Genentech的美國專利4,963,495描述了使用原核信號序列(如大腸桿菌腸毒素的序列)的真核蛋白(特別是人類生長激素)表達(dá)。授予Genentech的歐洲專利0 177 343描述了周質(zhì)HGH的表達(dá)，這可以通過使用P.aeruginosa腸毒素A信號序列來實(shí)現(xiàn)。
授予Biogen的美國專利5,082,783描述了來自最多具有中間強(qiáng)度的啟動(dòng)子(例如肌動(dòng)蛋白)或有效地與DNA信號序列相連的異-1-細(xì)胞色素c啟動(dòng)子(例如來自酵母的Mfα1信號序列)的蛋白質(zhì)(例如生長調(diào)節(jié)素C、組織纖溶酶原激活物或腫瘤壞死因子)的表達(dá)。
Pastan等的PCT公開WO 89/10971描述了使用OmpA信號序列在大腸桿菌中的假單胞菌外毒素表達(dá)，并且顯示了周質(zhì)和培養(yǎng)基中部分蛋白質(zhì)的差異表達(dá)。
授予Novo Nordisk的美國專利6,156,552描述了使用信號序列在大腸桿菌或脂酶不足的門多薩假單胞菌中的修飾假單胞菌脂酶的表達(dá)。信號序列可以是大腸桿菌phoA信號序列。授予Novozyme的美國專利6,495,357、6,509,181、6,524,827、6,528,298、6,558,939、6,608,018和6,617,143也描述了用信號序列表達(dá)的脂酶、纖維素酶、淀粉酶和其它酶(包括假單胞菌屬來源的酶)的制造，該信號序列優(yōu)選原產(chǎn)于表達(dá)酶但也可以來自例如根毛素屬、是來自啤酒酵母屬的α-因子的基因或來自桿菌屬的淀粉酶或蛋白酶基因。
授予Xoma的美國專利5,595,898、5,698,435和6,204,023描述了使用果膠酸裂解酶信號肽的嵌合抗體片段的制造。這些專利揭示了果膠酸裂解酶是包括熒光假單胞菌的各種有機(jī)體中已知的，盡管沒有提供這些序列的例證。
授予Genentech的美國專利6,258,560描述了使用細(xì)菌信號序列在大腸桿菌中的DNA消化蛋白表達(dá)，該細(xì)菌信號序列被描述成優(yōu)選原產(chǎn)于蛋白質(zhì)但也可以選自堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或熱穩(wěn)定的腸霉素、前導(dǎo)序列。該專利還指出，該蛋白質(zhì)也可以在假單胞菌(Pseuomonads)中表達(dá)，盡管沒有給出任何例證。
授予Habermann和Ertl和Aventis的PCT公開WO 01/21662、WO02/068660和美國申請公開2003/0044906描述了從大腸桿菌中分泌水蛭素(hirudin)衍生物。所述信號序列之一是來自熒光假單胞菌的OprF蛋白質(zhì)的序列。在‘662公開中確定的應(yīng)用是在De(1995)FEMS Micr.Let.127263-272中描述的序列NTLGLAIGSLIAATSFGVLA。在該公開中沒有描述在假單胞菌屬中使用表達(dá)質(zhì)粒，并且與大腸桿菌中的對照表達(dá)相比，使用該方法的水蛭素表達(dá)的增加僅是少量(marginal)的。
授予Unilever Patent Holdings B.V.的美國專利5,641,671涉及用穩(wěn)定化蛋白質(zhì)并優(yōu)選用脂酶基因內(nèi)生的信號序列從P.glumae中進(jìn)行假單胞菌脂酶的表達(dá)。
授予Atkinson等的歐洲專利EP 0 121 352描述了在載體中使用來自假單胞菌屬RS-16羧肽酶的無前導(dǎo)序列的半胱氨酸以增強(qiáng)蛋白質(zhì)的周質(zhì)表達(dá)。該專利揭示了在信號序列中的半胱氨酸殘基可以促進(jìn)與細(xì)胞膜的相互作用并阻礙分泌。所公開的信號序列是MRPSIHRTAIAAVLATAFVAGT。
依賴信號序列將蛋白質(zhì)導(dǎo)出細(xì)胞質(zhì)的的方法通常產(chǎn)生不當(dāng)加工的蛋白質(zhì)。對于氨基末端分泌信號(例如通過Sec系統(tǒng)引起分泌的那些分泌信號)尤為如此。通過該系統(tǒng)加工過的蛋白質(zhì)通?；蛘弑Ａ粢徊糠址置谛盘?，需要一種通常不當(dāng)裂解的連接元素，或者在末端被截短。
從上述技術(shù)中可以明顯看出，已經(jīng)開發(fā)出許多將蛋白質(zhì)導(dǎo)向宿主細(xì)胞周質(zhì)的方法。然而，已知方法不能產(chǎn)生恰當(dāng)加工的活性重組蛋白的始終如一的高收率，其可以提純用于治療?，F(xiàn)有方法中的一個(gè)主要限制是在不適當(dāng)?shù)募?xì)胞系統(tǒng)中用不好的分泌信號序列進(jìn)行的蛋白質(zhì)表達(dá)。
因此，在該領(lǐng)域中仍然需要能夠分泌和恰當(dāng)加工重組多肽的改進(jìn)的大規(guī)模表達(dá)系統(tǒng)以制造恰當(dāng)加工形式的轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)。理想系統(tǒng)產(chǎn)生大量的可溶蛋白質(zhì)并可以將該蛋白質(zhì)導(dǎo)向周質(zhì)并可能導(dǎo)向細(xì)胞外介質(zhì)中。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種在宿主細(xì)胞中提高恰當(dāng)加工的重組蛋白表達(dá)的系統(tǒng)和方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種在宿主細(xì)胞中提高活性重組蛋白表達(dá)的系統(tǒng)和方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種具有高水平的恰當(dāng)加工的重組蛋白表達(dá)的工業(yè)規(guī)模系統(tǒng)。
概述本發(fā)明提供了用于在細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生大量恰當(dāng)加工的重組蛋白的改進(jìn)的組合物和方法。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌是一種改進(jìn)的用于制造分泌蛋白質(zhì)的平臺，基于此發(fā)現(xiàn)形成本發(fā)明。特別地，與通常在其它細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中觀察到的相比，熒光假單胞菌令人驚訝地產(chǎn)生更大量的導(dǎo)向其Sec分泌系統(tǒng)的外源蛋白質(zhì)，并且更大量地將這些蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞周質(zhì)中，從而提高完全加工成的重組蛋白的回收率。本發(fā)明包括來自熒光假單胞菌有機(jī)體的新識別出的分泌信號，并且包括包含這些序列的肽、載體和表達(dá)系統(tǒng)，它們可以促進(jìn)相關(guān)的表達(dá)蛋白質(zhì)或肽導(dǎo)向到革蘭氏陰性細(xì)菌周質(zhì)或?qū)爰?xì)胞外環(huán)境中。本發(fā)明還包括熒光假單胞菌宿主細(xì)胞，當(dāng)與信號肽前導(dǎo)序列協(xié)同表達(dá)外源蛋白時(shí)，該宿主細(xì)胞可以提高恰當(dāng)加工形式的外源蛋白的產(chǎn)量。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了具有下述序列的分離肽——該序列是選自磷酸鹽結(jié)合蛋白(pbp)分泌信號、外膜孔蛋白E(OprE)分泌信號、Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白分泌信號、天青蛋白分泌信號、鐵(III)結(jié)合蛋白分泌信號和脂蛋白B分泌信號的熒光假單胞菌Sec-系統(tǒng)分泌肽或基本與其同源。
在另一具體實(shí)施方案中，提供了具有為一種肽編碼的序列的分離核酸，該肽包括下述序列——其是選自pbp、OprE、Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白、天青蛋白、鐵(III)結(jié)合蛋白和脂蛋白B分泌信號的熒光假單胞菌Sec-系統(tǒng)分泌肽或基本與其同源。在另一具體實(shí)施方案中，提供了一種核酸，該核酸可以與具有為一種肽編碼的序列的核酸雜交，該肽包括下述序列——其是選自pbp、OprE、Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白、天青蛋白、鐵(III)結(jié)合蛋白和脂蛋白B分泌信號的熒光假單胞菌Sec-系統(tǒng)分泌肽或基本與其同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，核酸在嚴(yán)格條件下雜交。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，肽序列是氨基酸序列Met Lys Leu LysArg Leu Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly Val Ala Thr Ala Asn AlaVal Ala(SEQ ID NO1)的至少氨基酸2-24的磷酸鹽結(jié)合蛋白(pbp)分泌信號肽的序列，或基本與其同源。在另一具體實(shí)施方案中，為肽編碼的核酸序列與核酸序列atg aaa ctg aaa cgt ttg atg gcg gca atg act tttgtc gct gct ggc gtt gcg acc gcc aac gcg gtg gcc(SEQ ID NO2)至少80％，85％，90％，95％或98％相同。在另一具體實(shí)施方案中，根據(jù)宿主機(jī)體的密碼子使用來調(diào)節(jié)SEQ ID NO2的核酸序列。
在另一具體實(shí)施方案中，肽序列是含有氨基酸序列Met Lys LysSer Thr Leu Ala Val Ala Val Thr Leu Gly Ala Ile Ala Gln Gln Ala Gly Ala(SEQ ID NO3)的至少氨基酸2-21的序列的外膜孔蛋白E(OprE)分泌信號肽的序列或基本與其同源。在另一具體實(shí)施方案中，為肽編碼的核酸序列與核酸序列atg aag aag tcc acc ttg gct gtg gct gta acg ttgggc gca atc gcc cag caa gca ggc gct(SEQ ID NO4)至少80％，85％，90％，95％或98％相同。在另一具體實(shí)施方案中，根據(jù)宿主機(jī)體的密碼子使用來調(diào)節(jié)SEQ ID NO4的核酸序列。
在另一具體實(shí)施方案中，肽序列是含有氨基酸序列Met Phe AlaLys Leu Val Ala Val Ser Leu Leu Thr Leu Ala Ser Gly Gln Leu Leu Ala(SEQ ID NO5)的至少氨基酸2-20的序列的天青蛋白分泌信號肽的序列或基本與其同源。在另一具體實(shí)施方案中，為肽編碼的核酸序列與核酸序列atg ttt gcc aaa ctc gtt gct gtt tcc ctg ctg act ctg gcg agc ggccag ttg ctt gct(SEQ ID NO6)至少60％，70％，80％，85％，90％，95％或98％相同。在另一具體實(shí)施方案中，根據(jù)宿主機(jī)體的密碼子使用來調(diào)節(jié)SEQ ID NO6的核酸序列。
在另一具體實(shí)施方案中，肽序列是含有氨基酸序列Met Gln AsnTyr Lys Lys Phe Leu Leu Ala Ala Ala Val Ser Met Ala Phe Ser Ala Thr AlaMet Ala(SEQ ID NO7)的至少氨基酸2-23的序列的Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白(LAObp或KRObp)分泌信號肽的序列或基本與其同源。在另一具體實(shí)施方案中，為肽編碼的核酸序列與核酸序列atg cag aac tat aaaaaa ttc ctt ctg gcc gcg gcc gtc tcg atg gcg ttc agc gcc acg gcc atg gca(SEQID NO8)至少60％，70％，80％，85％，90％，95％或98％相同。在另一具體實(shí)施方案中，根據(jù)宿主機(jī)體的密碼子使用來調(diào)節(jié)SEQ ID NO8的核酸序列。
在一具體實(shí)施方案中，肽序列是含有氨基酸序列Met Met Ile ArgAsp Asn Arg Leu Lys Thr Ser Leu Leu Arg Gly Leu Thr Leu Thr Leu LeuSer Leu Thr Leu Leu Ser Pro Ala Ala His Ser(SEQ ID NO9)的至少氨基酸2-32的序列的鐵(III)結(jié)合蛋白[Fe(III)bp]分泌信號肽的序列或基本與其同源。在另一具體實(shí)施方案中，為肽編碼的核酸序列與核酸序列atg atg atc cgt gac aac cga ctc aag aca tcc ctt ctg cgc ggc ctg acc ctc acc ctactc agc ctg acc ctg ctc tcg ccc gcg gcc cat tct(SEQ ID NO10)至少60％，70％，80％，85％，90％，95％或98％相同。在另一具體實(shí)施方案中，根據(jù)宿主機(jī)體的密碼子使用來調(diào)節(jié)SEQ ID NO10的核酸序列。
在另一具體實(shí)施方案中，肽序列是含有氨基酸序列Met Ile Lys ArgAsn Leu Leu Val Met Gly Leu Ala Val Leu Leu Ser Ala(SEQ ID NO11)的至少氨基酸2-17的序列的脂蛋白B(LprB)分泌信號肽的序列或基本與其同源。在另一具體實(shí)施方案中，為肽編碼的核酸序列與核酸序列atg atc aaa cgc aat ctg ctg gtt atg ggc ctt gcc gtg ctg ttg agc gct(SEQ IDNO12)至少60％，70％，80％，85％，90％，95％或98％相同。在另一具體實(shí)施方案中，根據(jù)宿主機(jī)體的密碼子使用來調(diào)節(jié)SEQ ID NO12的核酸序列。
另一具體實(shí)施方案是一種表達(dá)載體，其包括帶有下述序列或與其同源的熒光假單胞菌Sec-系統(tǒng)分泌肽的核酸——該序列是可連接到啟動(dòng)子上的pbp、OprE、Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白、天青蛋白、鐵(III)結(jié)合蛋白或脂蛋白B分泌信號。在另一具體實(shí)施方案中，載體進(jìn)一步包含用于相關(guān)重組蛋白或肽的表達(dá)的編碼序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，表達(dá)載體進(jìn)一步包含與分泌信號的編碼序列相鄰或與重組蛋白或肽的編碼序列相鄰的標(biāo)記序列。
本發(fā)明還提供了包括表達(dá)載體的細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該細(xì)胞表達(dá)了與如本文所述的熒光假單胞菌Sec-系統(tǒng)分泌信號相連的重組蛋白。該細(xì)胞可以在周質(zhì)隔室中表達(dá)蛋白質(zhì)。在某些具體實(shí)施方案中，細(xì)胞還可以產(chǎn)生穿過外胞壁的細(xì)胞外重組蛋白。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，并且在某些具體實(shí)施方案中，細(xì)胞是熒光假單胞菌細(xì)胞或大腸桿菌細(xì)胞。在其它具體實(shí)施方案中，細(xì)胞是真核細(xì)胞，并且可以是酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，細(xì)胞是假單胞菌，在特定具體實(shí)施方案中，細(xì)胞是熒光假單胞菌細(xì)胞。
在另一具體實(shí)施方案中，提供了改進(jìn)的用于在宿主細(xì)胞中制備重組蛋白的方法和系統(tǒng)。改進(jìn)包括熒光假單胞菌Sec-系統(tǒng)分泌肽的表達(dá)，該熒光假單胞菌Sec-系統(tǒng)分泌肽是可與宿主細(xì)胞中的相關(guān)重組蛋白或肽相連的選自pbp、OprE、Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白、天青蛋白、鐵(III)結(jié)合蛋白或脂蛋白B分泌信號的肽或與其同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，表達(dá)在高密度細(xì)胞培養(yǎng)基中產(chǎn)生。Sec-分泌信號可以在細(xì)胞中從成熟蛋白質(zhì)裂解。在另一具體實(shí)施方案中，分泌信號未裂解并且細(xì)胞表達(dá)出與分泌信號相連的重組蛋白。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，標(biāo)記序列可與相關(guān)蛋白質(zhì)相連。
在另一具體實(shí)施方案中，提供了一種通過在熒光假單胞菌中表達(dá)出與Sec-系統(tǒng)分泌信號相連的蛋白質(zhì)來制備重組外源分泌蛋白的方法。該具體實(shí)施方案是基于下述確認(rèn)——即熒光假單胞菌被確認(rèn)為是用于分泌的蛋白質(zhì)表達(dá)的改進(jìn)的表達(dá)平臺。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，Sec-分泌信號來自熒光假單胞菌基因組，但是在另一具體實(shí)施方案中，Sec-分泌信號來自大腸桿菌基因組。在其它具體實(shí)施方案中，分泌信號原產(chǎn)于待表達(dá)的蛋白質(zhì)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞含有周質(zhì)，且Sec-系統(tǒng)肽的表達(dá)將重組蛋白導(dǎo)向細(xì)胞周質(zhì)。在附屬具體實(shí)施方案中，表達(dá)產(chǎn)生細(xì)胞外蛋白質(zhì)。該方法還可以包括從周質(zhì)或從細(xì)胞外介質(zhì)中提純重組蛋白的步驟?？梢员磉_(dá)與蛋白質(zhì)相連的Sec-信號并且可以從細(xì)胞中提純與信號相連的蛋白質(zhì)。因此，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該分離的肽是分泌信號與相關(guān)蛋白質(zhì)或肽的融合蛋白。然而，還可以在將蛋白質(zhì)導(dǎo)向周質(zhì)時(shí)從蛋白質(zhì)中裂解出分泌信號。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，改進(jìn)Sec-系統(tǒng)分泌信號與蛋白質(zhì)或肽之間的連接以提高分泌信號的裂解。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該方法可以在細(xì)胞中產(chǎn)生恰當(dāng)加工的重組蛋白。在另一具體實(shí)施方案中，Sec-系統(tǒng)肽的表達(dá)可以在細(xì)胞中產(chǎn)生活性重組蛋白。與不用Sec-分泌信號表達(dá)的蛋白質(zhì)相比，本發(fā)明的方法還可以提高重組蛋白的收率。
在另一具體實(shí)施方案中，該方法產(chǎn)生至少0.1克/升正確加工的蛋白質(zhì)。在另一具體實(shí)施方案中，該方法在細(xì)胞中產(chǎn)生0.1至1克/升正確加工的蛋白質(zhì)。在附屬具體實(shí)施方案中，所得總蛋白質(zhì)可以是至少大約2.0至大約50.0克/升。在一些具體實(shí)施方案中，所得正確加工的蛋白質(zhì)的量為所得重組蛋白總量的至少大約5％、大約10％、大約15％、大約20％、大約25％或更高。
相關(guān)蛋白質(zhì)或肽可以是治療上有效的蛋白質(zhì)或肽。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該蛋白質(zhì)或肽來自真核物類。在另一具體實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)序列來自哺乳動(dòng)物序列。在另一具體實(shí)施方案中，活性形式的蛋白質(zhì)包括至少一個(gè)二硫鍵。在又一具體實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)或肽來自激素、生長因子、細(xì)胞外受體或配體、蛋白酶、激酶、血蛋白、趨化因子或細(xì)胞因子或抗體。
附圖簡述圖1革蘭氏陰性細(xì)菌中的蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)概觀。四個(gè)系統(tǒng)(Sec、Tat、MscL和holins)僅穿過內(nèi)膜轉(zhuǎn)移。該Sec系統(tǒng)分泌的蛋白質(zhì)位于周質(zhì)中，結(jié)合到外膜內(nèi)或通過箭頭所示的四個(gè)外膜分泌系統(tǒng)之一傳輸穿過外膜。通過Tat系統(tǒng)易位的蛋白質(zhì)主要位于周質(zhì)中，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)中的一些蛋白質(zhì)通過MTB系統(tǒng)進(jìn)一步輸出。Holins和MscL僅將蛋白質(zhì)傳輸?shù)街苜|(zhì)內(nèi)。I、III和IV型系統(tǒng)在不使用任何周質(zhì)中間體的情況下穿過內(nèi)膜和外膜輸出蛋白質(zhì)，縮寫FUP，fimbrial usher孔蛋白；AT，自動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)子；TPS，兩partner分泌系統(tǒng)；MTB，主末端分支；IM，內(nèi)膜；OM外膜。
圖2熒光假單胞菌gal2分泌結(jié)構(gòu)。顯示了pDOW1122和DOW1123的質(zhì)粒圖，(A)pDOW1122包含oprF:gal2融合(B中顯示了氨基酸序列)，且pDOW1123包含pbp:gal2融合(C中顯示的氨基酸序列)。*表示預(yù)定信號肽酶裂解位點(diǎn)。
圖3Gal2的分泌表達(dá)。來自表達(dá)oprF:gal2(Pdow1122)或pbp:gal2(Pdow1123)的熒光假單胞菌的整個(gè)培養(yǎng)液樣品的SDS-PAGE分析圖(A)。將整個(gè)培養(yǎng)液的1/80稀釋液加載在10％NuPAGE凝膠上并在1XMOPS緩沖劑中電泳。圖B顯示了可溶(S)、不溶(I)和無培養(yǎng)上清細(xì)胞(SN)餾分的Western分析。在凝膠下方顯示出加載的培養(yǎng)物的量，標(biāo)準(zhǔn)化至A575＝30。
圖4大腸桿菌中pelB:gal2的表達(dá)。顯示了在pelB:gal2(Pdow1138)中表達(dá)的Gal2的western印跡分析圖。箭頭指向不溶(I)和可溶(S)餾分中加工處理和未加工處理的蛋白質(zhì)。在誘導(dǎo)后0(I0)和3小時(shí)(I3)處取樣的樣品標(biāo)準(zhǔn)化至A575＝1；將5ul加載在4-12％NuPAGE凝膠上并在1X MES緩沖劑中電泳。
圖5來自大腸桿菌和熒光假單胞菌的提純scFv的活性。使用ELISA檢驗(yàn)(A)測量從小規(guī)模(B)或大規(guī)模(C)發(fā)酵中分離出的scFv的活性?；钚砸晕舛鹊男问奖硎?；下面每條框列出了抗體和量；顯示的是三個(gè)孔(well)的平均值。
圖6抗地高辛(anti-digoxin)scFv的分泌表達(dá)。A顯示了振蕩培養(yǎng)瓶規(guī)模的在熒光假單胞菌中的分泌。B顯示了振蕩培養(yǎng)瓶規(guī)模的在大腸桿菌中的分泌。所有樣品均標(biāo)準(zhǔn)化至20OD(對于熒光假單胞菌為OD575，且對于大腸桿菌為OD600)。在MES緩沖劑中在4-12％BT凝膠上電泳樣品。S＝可溶、I＝不溶。數(shù)字是以小時(shí)計(jì)的誘導(dǎo)后時(shí)間。
圖7振蕩培養(yǎng)瓶規(guī)模的分泌的抗地高辛scFv的Western印跡。圖A顯示了熒光假單胞菌表達(dá)的蛋白質(zhì)，圖B顯示了大腸桿菌表達(dá)的蛋白質(zhì)。將樣品標(biāo)準(zhǔn)化至20OD。蛋白質(zhì)在兩種構(gòu)造中都是100％不溶。S＝可溶，I＝不溶，0、3、24、48代表誘導(dǎo)后時(shí)間。
圖8通過抗地高辛scFv的定量分析進(jìn)行構(gòu)造之間的收率比較。將10微升每種樣品(包括BSA標(biāo)準(zhǔn)物)加載到4-12％BT凝膠上并在1X MES緩沖劑中電泳。對于每種構(gòu)造，加載誘導(dǎo)后來自0、3、24、48小時(shí)的樣品。檢查熒光假單胞菌分泌的構(gòu)造pDOW1142和大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)(pDOW1152)和分泌的(pDOW1153)構(gòu)造。箭頭表示加工處理和未加工處理的分泌scFv的遷移。如下電泳BAS標(biāo)準(zhǔn)曲線1，0.1ug；3，0.60ug；5，1.529ug；8.1.85ug。
圖9提純抗地高辛scFv的活性檢驗(yàn)。X-軸上是受試樣品來自含pDOW1142、pDOW1152或pDOW1153的菌株的提純scFv；多克隆的抗地高辛抗體(陽性)；或無蛋白質(zhì)(陰性)。Y軸上是吸光度值。誤差棒代表三份樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖10在用5mM安息香酸鹽生長24小時(shí)后，誘導(dǎo)的Skp蛋白質(zhì)。使用未誘導(dǎo)的燒瓶作為對照。在誘導(dǎo)12小時(shí)后收取細(xì)胞并且將蛋白質(zhì)分離成可溶和不溶餾分。使用MES緩沖劑在4-12NuPAGE凝膠(Invitrogen，Carlsbad，CA)上分離蛋白質(zhì)?？s寫如下I，不溶；S，可溶；MW，分子量；MWM，分子量標(biāo)記。
圖11加工處理和未加工處理的Skp蛋白質(zhì)的氨基酸序列。加下劃線的序列相當(dāng)于信號序列(上方)和MALDI-PSD識別出的序列(下方)。
圖12與用pDOW1123轉(zhuǎn)化的JM109、在37℃生長并用0.01mMIPTG誘導(dǎo)成陽性對照物DC265相比較，可溶和不溶樣品的SDS-PAGE分離圖。列1-可溶DC265，列2-不溶DC265，列3-SeeBlue Plus2 ladder，列4-可溶JM109/pDOW1123，列5-不溶JM109/pDOW1123。在每個(gè)孔內(nèi)加載5微升20OD標(biāo)準(zhǔn)化樣品。在150伏電壓下在1×MES緩沖劑中電泳4-12％Bis Tris凝膠大約50分鐘，然后用Simply Blue Safe Stain著色。
圖13從用pDOW1123轉(zhuǎn)化并用0.01mM的IPTG誘導(dǎo)、在37℃生長的大腸桿菌菌株JM109中SDS-PAGE分離不溶樣品的圖。列1-3，10微升不溶樣品。列4，陽性對照物熒光假單胞菌DC265的10微升1∶20稀釋物。將12％Bis-Tris凝膠在200伏在1×MES緩沖劑中處理大約50分鐘，并用NovexColloidal Blue Stain Kit著色。
圖14來自用pDOW1123轉(zhuǎn)化、在0.01mM IPTG中誘導(dǎo)并在37℃生長的大腸桿菌菌株JM109的周質(zhì)樣品的SDS-PAGE分析圖。將12％Bis-Tris凝膠在200伏電壓下在1×MES緩沖劑中電泳大約50分鐘，并用NovexColloidal Blue Stain Kit著色。列1-DC265陽性對照物的10微升1∶20稀釋物。列2-4 10微升周質(zhì)樣品。
圖15在37℃生長的用0.01mM IPTG-誘導(dǎo)的JM109/pDOW1123培養(yǎng)物的可溶、不溶和周質(zhì)餾分的western分析圖。將樣品在12％BisTris凝膠上在MES緩沖劑中電泳并在30伏電壓下轉(zhuǎn)移到硝化纖維素中1小時(shí)，然后用抗-His HRP用探針探查。列1-陽性對照物的不溶部分的10微升1∶30稀釋物。列2-20微升可溶部分。列3-10微升不溶部分。列4-20微升周質(zhì)制品。
詳述本發(fā)明是以熒光假單胞菌中分泌信號序列的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)的。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了信號肽序列、編碼信號肽的核酸、包括編碼信號肽序列的核酸的載體和細(xì)胞，它們來自熒光假單胞菌有機(jī)體，該有機(jī)體在與該蛋白質(zhì)或肽協(xié)同表達(dá)時(shí)可以提高相關(guān)蛋白質(zhì)或肽的分泌。還提供了改進(jìn)的使用來自熒光假單胞菌的Sec-分泌信號在細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生大量正確加工的重組蛋白的方法。
本發(fā)明還確認(rèn)了熒光假單胞菌是用于多種蛋白質(zhì)制造的改進(jìn)平臺。特別地，與通常在其它細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中觀察到的相比，熒光假單胞菌以正確加工形式產(chǎn)生了更大量的導(dǎo)向Sec分泌系統(tǒng)的外源蛋白，并更大量地將這些蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞周質(zhì)中，從而提高完全加工過的重組蛋白的回收率。因此，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種通過表達(dá)與Sec分泌信號相連的目標(biāo)蛋白質(zhì)來在熒光假單胞菌中制造外源蛋白質(zhì)的方法。
之前已經(jīng)證實(shí)，某些假單胞菌與其它細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)相比，對肽和酶的商業(yè)表達(dá)提供了益處。特別地，已經(jīng)確認(rèn)熒光假單胞菌是有利的表達(dá)系統(tǒng)。熒光假單胞菌包括一組存在于土壤、水和植物表面環(huán)境中的常見的非病原腐生物。已經(jīng)使用來自熒光假單胞菌的商業(yè)酶作為去垢添加劑以降低環(huán)境污染并用于立體選擇性水解。還在農(nóng)業(yè)上使用熒光假單胞菌控制病原體。在上世紀(jì)90年代末被Dow AgroSciences完全收購的Mycogen，在80年代中期開始在熒光假單胞菌中表達(dá)重組細(xì)菌蛋白并在1985年1月22日提交其關(guān)于熒光假單胞菌中的蘇云金芽孢桿菌毒素表達(dá)的第一個(gè)專利申請(“Cellular encapsulation of biologicalpesticides”)。在1985和2004年之間，Mycogen，隨后Dow Agro Sciences以及其它公司在關(guān)于農(nóng)藥(pesticidal)、殺蟲劑和殺線蟲毒素制造以及特定毒物序列和基因操作以提高它們的表達(dá)的專利申請中投資于熒光假單胞菌的農(nóng)業(yè)應(yīng)用。
DowPharma目前在使用熒光假單胞菌制造重組蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域中擁有一些待審專利申請。屬于Dow Global Technologies的PCT申請WO 03/068926和WO 03/068948描述了使用假單胞菌，特別是熒光假單胞菌作為宿主細(xì)胞的extremoyzme過度表達(dá)系統(tǒng)。這些文獻(xiàn)大致公開了與信號肽協(xié)同進(jìn)行的extremozymes表達(dá)，但是沒有公開具體序列并且沒有確認(rèn)這些細(xì)胞對分泌是優(yōu)異的。
2003年4月22日提交的屬于Dow Global Technologies的名為“Low-Cost Production of Peptides”的PCT公開WO 03/089455描述了制造作為假單胞菌(特別是熒光假單胞菌)中的contatemeric前體的小肽(例如抗菌肽)的低成本方法。該文獻(xiàn)公開了與信號肽協(xié)同進(jìn)行的concatameric肽的表達(dá)，但是沒有公開具體序列。
屬于Dow Global Technologies的名為“Benzoate and AntranilateInducible Promoters”的PCT申請WO 04/005221提供了用于商業(yè)原核發(fā)酵系統(tǒng)的來自熒光假單胞菌的安息香酸鹽或鄰氨基安息香酸鹽可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。該文獻(xiàn)公開了包含帶有啟動(dòng)子的信號肽，但是沒有公開具體信號序列。
肽在一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了帶有下述氨基酸序列的分離肽——該序列是選自磷酸鹽結(jié)合蛋白(pbp)分泌信號、外膜孔蛋白E(OprE)分泌信號、Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白分泌信號、天青蛋白(azurin)，分泌信號、鐵(III)結(jié)合蛋白分泌信號和脂蛋白B分泌信號的熒光假單胞菌Sec-系統(tǒng)分泌肽或基本與其同源。
在另一具體實(shí)施方案中，提供了帶有下述氨基酸序列的分離肽——該序列是pbp、OprE、Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白、天青蛋白、鐵(III)結(jié)合蛋白或脂蛋白B分泌信號或基本與它們同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，分離肽是分泌信號與相關(guān)蛋白質(zhì)或肽的融合蛋白。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，肽序列是至少氨基酸Met Lys Leu LysArg Len Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly Val Ala Thr Ala Asn AlaVal Ala(SEQ ID NO1)的磷酸鹽結(jié)合蛋白(pbp)分泌信號肽的序列，或基本與其同源。在另一具體實(shí)施方案中，肽序列包含SEQ ID NO1的至少氨基酸2-24。在另一具體實(shí)施方案中，肽序列包括截短的SEQ IDNO1，其從氨基末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸，但是保留分泌信號活性。
在另一具體實(shí)施方案中，肽序列是含有至少氨基酸序列Met LysLys Ser Thr Leu Ala Val Ala Val Thr Leu Gly Ala Ile Ala Gln Gln Ala GlyAla(SEQ ID NO3)的外膜孔蛋白E(OprE)分泌信號肽的序列或基本與其同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該肽是SEQ ID NO3的至少氨基酸2-21或與其同源。在另一具體實(shí)施方案中，肽序列包括截短的SEQID NO3，其從氨基末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸，但是保留分泌信號活性。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將SEQ ID NO3的肽修飾以使位置2的Lys被Tyr取代。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將SEQ ID NO3的肽修飾以使位置5的Thr被Ser取代。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將SEQ ID NO3的肽修飾以使位置8的Val被Leu取代。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將SEQ ID NO3的肽修飾以使位置10的Val被Val和Arg取代。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將SEQ ID NO3的肽修飾以使位置14的Ala被Val取代。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將SEQ ID NO3的肽修飾以使位置15的Ile被Leu取代。
在另一具體實(shí)施方案中，肽序列是含有至少氨基酸序列Met PheAla Lys Leu Val Ala Val Ser Leu Leu Thr Leu Ala Ser Gly Gln Leu Leu Ala(SEQ ID NO5)的天青蛋白分泌信號肽的序列或基本與其同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該肽是SEQ ID NO5的至少氨基酸2-20或與其同源。在另一具體實(shí)施方案中，肽序列包括截短的SEQ ID NO5，其從氨基末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸，但是保留分泌信號活性。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將SEQ ID NO5的肽修飾以使位置2和3的Phe-Ala被Leu-Arg或Ile-Arg取代。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將SEQ ID NO5的肽修飾以使位置5的Leu被Ala取代。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將SEQ ID NO5的肽修飾以使位置6的Val被Ala取代。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將SEQ ID NO5的肽修飾以使位置6-8的Val-Ala-Val被Ile-Ser-Ala取代。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將SEQIDNO5的肽修飾以使位置11的Leu被Ile取代。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將SEQ ID NO5的肽修飾以使位置12的Thr被Ser取代。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將SEQ ID NO5的肽修飾以使位置14的Ala被Leu或Phe取代。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將SEQ ID NO5的肽修飾以使位置16的Gly被Ala取代。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將SEQ ID NO5的肽修飾以使位置17的Gln被Ser或Pro取代。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將SEQ ID NO5的肽修飾以使位置18的Leu被Val取代。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將SEQ ID NO5的肽修飾以使位置18-19的Leu-Leu被Val-Phe取代。
在另一具體實(shí)施方案中，肽序列是含有至少氨基酸序列Met GlnAsn Tyr Lys Lys Phe Leu Leu Ala Ala Ala Val Ser Met Ala Phe Ser Ala ThrAla Met Ala(SEQ ID NO7)的Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白(LAObp或KRObp)分泌信號肽的序列或基本與其同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該肽是SEQ ID NO7的氨基酸2-23或基本與其同源。在另一具體實(shí)施方案中，肽序列包括截短的SEQ ID NO7，其從氨基末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸，但是保留分泌信號活性。
在再一具體實(shí)施方案中，肽序列是含有至少氨基酸序列Met MetIle Arg Asp Asn Arg Leu Lys Thr Ser Leu Leu Arg Gly Leu Thr Leu ThrLeu Leu Ser Leu Thr Leu Leu Ser Pro Ala Ala His Ser(SEQ ID NO9)的鐵(III)結(jié)合蛋白[Fe(III)bp]分泌信號肽的序列或基本與其同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該肽是SEQ ID NO9的氨基酸2-32或基本與其同源。在另一具體實(shí)施方案中，肽序列包括截短的SEQ ID NO9，其從氨基末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸，但是保留分泌信號活性。
在另一具體實(shí)施方案中，肽序列是含有至少氨基酸序列Met IleLys Arg Asn Leu Leu Val Met Gly Leu Ala Val Leu Leu Ser Ala(SEQ IDNO11)的脂蛋白B(LprB)分泌信號肽的序列或基本與其同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該肽是SEQ ID NO11的氨基酸2-17或基本與其同源。在另一具體實(shí)施方案中，肽序列包括截短的SEQ ID NO11，其從氨基末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸，但是保留分泌信號活性。
在另一具體實(shí)施方法中，分泌信號是來自大腸桿菌蛋白質(zhì)的分泌信號。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，分泌信號是用于來自大腸桿菌的蛋白質(zhì)的內(nèi)在信號序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是伴侶蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)可以是二硫鍵形成的蛋白質(zhì)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該序列是大腸桿菌伴侶蛋白質(zhì)(例如skp蛋白質(zhì))的內(nèi)在序列。
sec路徑的信號肽通常包括下列三個(gè)區(qū)域(i)帶正電的n-區(qū)，(ii)疏水h-區(qū)和(iii)不帶電但是極性c-區(qū)。信號肽酶的裂解位點(diǎn)位于c-區(qū)。然而，在不同蛋白質(zhì)之間，信號序列保持程度和長度以及裂解位點(diǎn)位置可以不同。分泌信號序列可以是，例如，使用為識別分泌信號而設(shè)計(jì)的電腦程序(例如SignalP程序)或如Hiller等(2004)Nucleic AcidsResearch 32(Web Server issue)W375-W379所述識別出的任何序列；可在互聯(lián)網(wǎng)上在URLhttp://www.predisi.de查到。
序列同源性此處所用的術(shù)語“同源”是指i)具有與給定原始蛋白質(zhì)或肽的序列大致相似(也就是，至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或98％)的氨基酸序列并保留原始蛋白質(zhì)或肽的所需功能的蛋白質(zhì)或肽，或ii)具有與給定核酸的序列大致相似(也就是，至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或98％)的序列并保留原始核酸序列的所需功能的核酸。在本發(fā)明和公開的所有具體實(shí)施方案中，可以將任何公開的蛋白質(zhì)、肽或核酸替換成保留所需功能的同源或基本同源的蛋白質(zhì)、肽或核酸。在本發(fā)明和公開的所有具體實(shí)施方案中，當(dāng)公開了任何核酸時(shí)，應(yīng)該認(rèn)為本發(fā)明還包括與所公開的核酸雜交的所有核酸。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，同源多肽的氨基酸序列是給定原始多肽的變體，其中可以通過將最多或大約30％(包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30％)的原始多肽氨基酸殘基取代成其它氨基酸殘基來獲得該變體的序列，條件是取代后的變體保留了原始多肽的所需功能?；就吹淖凅w氨基酸與給定多肽至少大約70％同源，或70、75、80、85、90、95、98、99或100％同源。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，變體可以是原始多肽的類似取代的變體或類似變體。術(shù)語“類似取代的變體”是指相對于原始多肽，含有不同殘基(它們是“類似的”氨基酸殘基取代基，但是其中并非所有的不同之處都是“類似的”取代基)的變體。此處所用的術(shù)語“類似變體”是指其中每個(gè)不同的殘基都是“類似的”氨基酸殘基取代基時(shí)的變體。本文中使用的術(shù)語“類似的”氨基酸殘基是指下述殘基——它們是表1所示的15個(gè)保守或半保守基團(tuán)的任何一個(gè)。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，至少50％的取代基表現(xiàn)為保守氨基酸取代基，剩余取代基是半保守取代基。在其它具體實(shí)施方案中，至少60％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％的類似取代基表現(xiàn)為保守氨基酸取代基。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，至少50％的類似取代基表現(xiàn)為保守氨基酸取代基，剩余的類似取代基表現(xiàn)為半保守氨基酸取代基。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％的類似取代基表現(xiàn)為保守氨基酸取代基。在一個(gè)實(shí)施方案中，取代變體是給定原始多肽的類似變體。
核酸序列本發(fā)明還包括帶有為一種肽編碼的序列的分離核酸，該肽包括與pbp、OprE、Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白、天青蛋白、鐵(III)結(jié)合蛋白和脂蛋白B分泌信號基本同源的序列。在本發(fā)明的另一方面，提供了雜合成下述分離核酸的核酸，該分離核酸帶有為一種肽編碼的序列，該肽包括與pbp、OprE、Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白、天青蛋白、鐵(III)結(jié)合蛋白和脂蛋白B分泌信號基本同源的序列。在某些具體實(shí)施方案中，雜合核酸在極其嚴(yán)格的條件下結(jié)合。極其嚴(yán)格的條件通常是指在68℃或更高的溫度下雜合。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了為與SEQ ID NO1的至少氨基酸2-24的磷酸鹽結(jié)合蛋白(pbp)分泌信號肽的序列基本同源的肽序列編碼的核酸。在另一具體實(shí)施方案中，為肽編碼的核酸序列是atg aaa ctgaaa cgt ttg atg gcg gca atg act ttt gtc gct gct ggc gtt gcg acc gcc aac gcg gtggcc(DEQ ID NO2)。在另一具體實(shí)施方案中，該核酸序列與SEQ IDNO2的序列至少80％，85％，90％，95％或98％相同。在另一具體實(shí)施方案中，該核酸序列與SEQ ID NO2的序列至少90％，85％，80％，75％，70％，65％，60％，55％或50％相同。在另一具體實(shí)施方案中，根據(jù)宿主機(jī)體的密碼子使用來調(diào)節(jié)SEQ ID NO2的核酸序列。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了為與含有SEQ ID NO3的至少氨基酸2-21的序列的外膜孔蛋白E(OprE)分泌信號肽的序列基本同源的肽序列編碼的核酸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，肽序列是如下的SEQ IDNO3的肽或與其基本同源——其中位置2的Lys被Tyr取代；其中位置5的Thr被Ser取代；其中位置8的Val被Leu取代；其中位置10的Val被Val和Arg取代；其中位置14的Ala被Val取代；其中位置15的Ile被Leu取代。在另一具體實(shí)施方案中，為肽編碼的核酸序列是atg aag aag tcc acc ttg gct gtg gct gta acg ttg ggc gca atc gcc cag caagca ggc gct(SEQ ID NO4)。在另一具體實(shí)施方案中，該核酸序列與SEQ ID NO4的序列至少90％相同。在另一具體實(shí)施方案中，該核酸序列與SEQ ID NO4的序列至少98％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％相同。在另一具體實(shí)施方案中，根據(jù)宿主機(jī)體的密碼子使用來調(diào)節(jié)SEQ ID NO4的核酸序列。
在另一具體實(shí)施方案中，提供了為與含有SEQ ID NO5的至少氨基酸2-20的序列的天青蛋白分泌信號肽的序列基本同源的肽序列編碼的核酸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，肽序列是如下的SEQ ID NO5的肽或與其基本同源——其中位置2和3的Phe-Ala被Leu-Arg或Ile-Arg取代；其中位置5的Leu被Ala取代；其中位置6的Val被Ala取代；其中位置6-8的Val-Ala-Val被Ile-Ser-Ala取代；其中位置11的Leu被Ile取代；其中位置12的Thr被Ser取代；其中位置14的Ala被Leu或Phe取代；其中位置16的Gly被Ala取代；其中位置17的Gln被Ser或Pro取代；其中位置18的Leu被Val取代；或其中位置18-19的Leu-Leu被Val-Phe取代。在另一具體實(shí)施方案中，為肽編碼的核酸序列是atg ttt gcc aaa ctc gtt gct gtt tcc ctg ctg act ctg gcg agc ggc cag ttg cttgct(SEQ ID NO6)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該核酸序列與SEQ IDNO6的序列至少90％相同。在另一具體實(shí)施方案中，該核酸序列與SEQ ID NO6的序列至少98％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％相同。在另一具體實(shí)施方案中，根據(jù)宿主機(jī)體的密碼子使用來調(diào)節(jié)SEQ ID NO6的核酸序列。
在另一具體實(shí)施方案中，提供了為與含有SEQ ID NO7的至少氨基酸2-23的序列的Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白(LAObp或KRObp)分泌信號肽的序列基本同源的肽序列編碼的核酸。在另一具體實(shí)施方案中，為肽編碼的核酸序列是atg cag aac tat aaa aaa ttc ctt ctg gcc gcg gcc gtctcg atg gcg ttc agc gcc acg gcc atg gca(SEQ ID NO8)。在另一具體實(shí)施方案中，該核酸序列與SEQ ID NO8的序列至少90％相同。在另一具體實(shí)施方案中，該核酸序列與SEQ ID NO8的序列至少98％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％相同。在另一具體實(shí)施方案中，根據(jù)宿主機(jī)體的密碼子使用來調(diào)節(jié)SEQ ID NO8的核酸序列。
在再一具體實(shí)施方案中，提供了為與含有SEQ ID NO9的至少氨基酸2-32的序列的鐵(III)結(jié)合蛋白[Fe(III)bp]分泌信號肽的序列基本同源的肽序列編碼的核酸。在另一具體實(shí)施方案中，為肽編碼的核酸序列是atg atg atc cgt gac aac cga ctc aag aca tcc ctt ctg cgc ggc ctg acc ctcacc cta ctc agc ctg acc ctg ctc tcg ccc gcg gcc cat tct(SEQ ID NO10)。在另一具體實(shí)施方案中，該核酸序列與SEQ ID NO10的序列至少90％相同。在另一具體實(shí)施方案中，該核酸序列與SEQ ID NO10的序列至少98％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％相同。在另一具體實(shí)施方案中，根據(jù)宿主機(jī)體的密碼子使用來調(diào)節(jié)SEQ ID NO10的核酸序列。
在另一具體實(shí)施方案中，提供了為與含有SEQ IDNO11的至少氨基酸2-17的序列的脂蛋白B(LprB)分泌信號肽的序列基本同源的肽序列編碼的核酸。在另一具體實(shí)施方案中，為肽編碼的核酸序列是atg atc aaa cgc aat ctg ctg gtt atg ggc ctt gcc gtg ctg ttg agc gct(SEQ IDNO12)。在另一具體實(shí)施方案中，該核酸序列與SEQ ID NO12的序列至少90％相同。在另一具體實(shí)施方案中，該核酸序列與SEQ ID NO12的序列至少98％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％相同。在另一具體實(shí)施方案中，根據(jù)宿主機(jī)體的密碼子使用來調(diào)節(jié)SEQ ID NO12的核酸序列。
密碼子使用或密碼子選擇是本領(lǐng)域中公知的?？梢匀缦滦薷乃x編碼序列改變其遺傳密碼以配合細(xì)菌宿主細(xì)胞使用的序列，并且可以增強(qiáng)其密碼子序列以更接近宿主使用的序列。可以按照本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種方法(例如低聚核苷酸誘發(fā)突變)進(jìn)行遺傳密碼選擇和密碼子頻率增強(qiáng)。對此過程有幫助的有用的互聯(lián)網(wǎng)在線資源包括，例如(1)the Kazusa DNA Research Institute(2-6-7Kazusa-kamatari，Kisarazu、Chiba 292-0818日本)的密碼子使用數(shù)據(jù)庫并可在http://www.kazusa.or.jp/獲得；以及(2)可以從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi？mode＝c 的NCBI Taxonomy數(shù)據(jù)庫獲得的遺傳密碼表。例如，假單胞菌屬據(jù)描述使用了NCBI Taxonomy站點(diǎn)的遺傳密碼譯碼表11，并在Kazusa站點(diǎn)表現(xiàn)出http://www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/所示的表中的密碼子使用頻率。
核酸同源性本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以提供多種基本同源的核酸，它們?yōu)榛绢愃频碾牡男蛄芯幋a。在編碼序列同源性的情況下，與蛋白質(zhì)編碼核酸序列同源的編碼序列含有與此處公開的蛋白質(zhì)編碼核酸序列相比不超過30％(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30％)的會導(dǎo)致讀碼框中的變化的突變并且不含會產(chǎn)生過早終止密碼子的突變。然而，可以在改變所需表達(dá)系統(tǒng)中的密碼子使用的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)核酸序列。
按照本領(lǐng)域公知的各種方法測量核酸序列同源性?？捎玫男蛄斜葘屯葱詼y定方法的例子包括下述這些。
可以使用U.S.National Center for Biotechnology InfOrnation(NCBI)程序，MegaBLAST(目前可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/查到)進(jìn)行同源序列的比對和檢索。該程序的使用可以選擇對于氨基酸序列在70％的等同百分比設(shè)置，或?qū)τ诤塑账嵝蛄性?0％的設(shè)置，這種使用可以識別出與查詢序列(querysequence)具有70％或90％或更高同源性的序列。本領(lǐng)域已知的其它軟件也可用于同源序列(例如與本發(fā)明的含有啟動(dòng)子堿基序列或激活子-蛋白質(zhì)-編碼堿基序列的信息串至少70％或90％同源的序列)的比對和/或檢索。例如，用于比較以識別出與查詢序列至少70％或90％同源的序列的序列比對可以使用例如獲自GCG序列分析軟件包(SecquenceAnalysis Software Package，可獲自Genetics Computer Group，Universityof Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，Wis.53705)的GAP、BESTFTT、BLAST、FASTA和TFASTA程序進(jìn)行，在此過程中使用這些程序中指定的缺省參數(shù)加上70％或90％的同源性程度設(shè)置用的參數(shù)。也可以使用例如CLUSTAL程序(可以在來自Interlligenetics，Mountain View，Cal.的PC/Gene軟件包中獲得)。
這些和其它序列比對方法是本領(lǐng)域中公知的并且可以通過人工比對，通過目測，或通過序列比對算法(例如上述程序所包含的那些)。的人工或自動(dòng)運(yùn)用來進(jìn)行。各種可用的算法包括，例如，在W.R.Pearson&D.J.Lipman，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 852444-48(1988年4月)中描述的相似性檢索法；T.F.Smith&M.S.Waterman，在Adv.Appl.Math.2482-89(1981)及在J. Molec.Biol.147195-97(1981)中描述的局部同源性檢索法；在S.B.Needleman&C.D.Wunsch，J. Molec.Bial.48(3)443-53(1970年3月)中描述的同源性比對法；以及例如W.R.Pearson在Genomics 11(3)635-50(1991年11月)中；W.R.Pearson在Methods Mole.Biol.24307-31和25365-89(1994)中；以及D.G.Higgins&P.M.SharpComp.Appl’ns in Biosci.5151-53(1989)和在Gene73(1)237-44(1988年12月15日)中描述的各種方法。
在極其嚴(yán)格的雜合條件下進(jìn)行的核酸雜合也是一種可用于獲得本文所用的足夠同源的序列的技術(shù)。極其嚴(yán)格的雜合條件通常是指在至少68℃的含水條件中進(jìn)行的雜合。
載體另一具體實(shí)施方案是一種表達(dá)載體，其包括帶有下述序列的熒光假單胞菌Sec-系統(tǒng)分泌肽的核酸——該序列與可連接到啟動(dòng)子上的pbp、OprE、Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白、天青蛋白、鐵(III)結(jié)合蛋白或脂蛋白B分泌信號基本同源。可表達(dá)的編碼序列有效地連接到能夠在所選宿主細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子以及所有其它必須的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)因子上。
術(shù)語“可連接”是指下述任何構(gòu)造，即在該構(gòu)造中，轉(zhuǎn)錄和任何轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)因子相對于編碼序列以這樣的布置共價(jià)連接到編碼序列上，使得在宿主細(xì)胞中并通過宿主細(xì)胞的作用，調(diào)節(jié)因子可以指引編碼序列的表達(dá)。
載體通常包含一個(gè)或多個(gè)表型可選擇標(biāo)記和一個(gè)復(fù)制源以確保載體的維持并且如果需要，可以在宿主內(nèi)提供擴(kuò)增。適合按照本公開的內(nèi)容進(jìn)行轉(zhuǎn)化的宿主包括假單胞菌屬內(nèi)的各種物類，特別優(yōu)選的是熒光假單胞菌的宿主細(xì)胞株。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，載體進(jìn)一步包含可連接到Sec分泌信號上的用于相關(guān)重組蛋白或肽的表達(dá)的編碼序列。這些重組蛋白和肽可以從多核苷酸中表達(dá)，其中目標(biāo)多肽編碼序列可連接到前導(dǎo)序列和轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)因子上以形成功能基因，宿主細(xì)胞可從該功能基因中表達(dá)蛋白質(zhì)或肽。編碼序列可以是目標(biāo)多肽的內(nèi)在編碼序列(如果可以得到的話)，但是更優(yōu)選是經(jīng)過選擇、改進(jìn)或最優(yōu)化以用于宿主細(xì)胞的選定表達(dá)的編碼序列例如通過合成基因以反應(yīng)宿主物類的密碼子使用偏性。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，宿主物類是熒光假單胞菌，并且在既設(shè)計(jì)信號序列又設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)或肽序列時(shí)，考慮熒光假單胞菌的密碼子偏性。在一個(gè)或多個(gè)載體內(nèi)構(gòu)造基因，或?qū)⒒虿迦胍粋€(gè)或多個(gè)載體內(nèi)，然后將載體轉(zhuǎn)化成表達(dá)宿主細(xì)胞。
在載體(也稱作“表達(dá)構(gòu)造”)中可以包含其它調(diào)節(jié)因子。這些因子包括，但不限于，例如，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)序列、轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)序列、其它啟動(dòng)子、激活子、轉(zhuǎn)譯啟動(dòng)和終止信號、轉(zhuǎn)錄終止子、順反子調(diào)節(jié)子、多順反子調(diào)節(jié)子、標(biāo)記序列，例如核苷酸序列“標(biāo)記”和“標(biāo)記”肽編碼序列，這有助于表達(dá)出的多肽的識別、分離、提純或隔離。
在另一具體實(shí)施方案中，表達(dá)載體進(jìn)一步包含與分泌信號的編碼序列相鄰或與重組蛋白或肽的編碼序列相鄰的標(biāo)記序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該標(biāo)記序列使蛋白質(zhì)可以提純。標(biāo)記序列可以是親和標(biāo)記物，例如六-組氨酸親和標(biāo)記物。在另一具體實(shí)施方案中，親和標(biāo)記物可以是谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)譯酶分子。標(biāo)記物還可以是熒光分子，例如YFP或GFP，或這些熒光蛋白質(zhì)的類似物。該標(biāo)記物還可以是一部分抗體分子，或可用于提純的已知的結(jié)合partner的已知抗原或配體。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)編碼基因除了蛋白質(zhì)編碼序列外，還可以包括可與其相連的下列調(diào)節(jié)因子啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、轉(zhuǎn)錄終止子、轉(zhuǎn)譯啟動(dòng)和終止信號?？捎玫腞BSs可獲自可在本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)中用作宿主細(xì)胞的任何物類，尤其獲自選定的宿主細(xì)胞。許多特定的RBSs和多種一致認(rèn)可的RBSs是已知的，例如，D.Frishman等人，Starts of bacterial genomesestimating the reliability of computerpredictions，Gene 234(2)257-65(1999年7月8日)中；以及B.E.Suzek等人，A probabilistic method for identifying start codons in bacterialgonomes，BioinfOrnatics 17(12)1123-30(2001年12月)中描述和引用的那些。此外，可以使用天然的或合成的RBSs，例如，下列文獻(xiàn)中描述的那些EP 0207459(合成的RBSs)；O.Ikehata等人，Primary structureof nitrile hydratase deduced from the nucleotide sequence of aRhodococcus species and its expression in Escherichia coli，Eur.J.Biochem.181(3)563-70(1989)(AAGGAG的天然RBS序列)。在下列文獻(xiàn)中描述了本發(fā)明中可用的方法、載體和轉(zhuǎn)譯及轉(zhuǎn)錄因子的其它例子，例如授予Gilroy的美國專利No.5,055,294和授予Gilroy等人的美國專利No.5,128,130；授予Rammler等人的美國專利No.5,281,532；授予Barnes等人的美國專利No.4,695,455和4,861,595；授予Gray等人的美國專利No.4,755,465；以及授予Wilcox的美國專利No.5,169,760。
通過在載體或質(zhì)粒中插入增強(qiáng)序列來提高假單胞菌對本發(fā)明的蛋白質(zhì)的編碼DNA的轉(zhuǎn)錄。典型的增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，通常大小為大約10至300bp，其作用于啟動(dòng)子以提高其轉(zhuǎn)錄。例子包括各種假單胞菌增強(qiáng)子。
通常，重組表達(dá)載體包括復(fù)制源和允許假單胞菌宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的可選擇的標(biāo)記和來自高度表達(dá)基因的啟動(dòng)子以指示下游構(gòu)造序列的轉(zhuǎn)錄。這些啟動(dòng)子可來自為3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、酸性磷酸酶或熱休克蛋白質(zhì)之類的酶編碼的操縱子。用轉(zhuǎn)譯起始和終止序列并優(yōu)選用能夠指示轉(zhuǎn)譯酶分泌的前導(dǎo)序列在合適的階段組裝異質(zhì)構(gòu)造序列。任選地，異質(zhì)序列可以編碼包括損害所需特性(例如表達(dá)出的重組產(chǎn)品的穩(wěn)定或簡化的提純)的N-末端識別肽的融合酶。
載體在本領(lǐng)域中已知可用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白，并且可以使用這些載體中的任何一種以按照本發(fā)明表達(dá)基因。這些載體包括，例如，質(zhì)粒、粘粒、噬菌體表達(dá)載體。可用的質(zhì)粒載體的例子包括，但不限于，表達(dá)質(zhì)粒pBBR1MCS、pDSK519、pKT240、pML122、pPS10、RK2、RK6、pRO1600和RSF1010。此類可用載體的其它例子包括下列文獻(xiàn)中描述的那些N，Hayase，在Appl.Envir.Microbiol.60(9)3336-42(1994年9月)中；A.A.Lushnikov等人，在Basic Life Sci.30657-62(1985)中；S.Graupner&W.Wackernagel，在Biomolec.Eng.17(1)11-16(2000年10月)中；H.P.Schweizer，在Curr.Opin.Biotech.12(5)439-45(2001年10月)中；M.Bagdasarian&K.N.Timmis，在Curr.Topics.Microbiol.Immunol 9647-67(1982)中；T.Ishii等人，在FEMS Microbiol Lett.116(3)307-13(1994年3月1日)中；I.N.Olekhnovich&Y.K.FOrnichev，在Gene 140(1)63-65(1994年3月11日)中；M.Tsuda&T.Nakazawa，在Gene 136(1-2)257-62(1993年12月22日)中；C.Nieto等人，在Gene 87(1)145-49(1990年3月1日)中；J.D.Jones&N.Gutterson，在Gene 61(3)299-306(1987)中；M.Bagdasarian等人，在Gene 16(1-3)237-47(1981年12月)中；H.P.Schweizer等人，在Genet.Eng.(NY)2369-81(2001)中；P. Mukhopadhyay等人，在J.Bact.172(1)477-80(1990年1月)中；D.O.Wood等人，在J.Bact.145(3)1448-51(1981年3月)中；以及R.Holtwick等人，在Microbiology 147(Pt 2)337-44(2001年2月)中。
可以在假單胞菌屬宿主細(xì)胞中使用的表達(dá)載體的其它例子包括表2所列的來自所示復(fù)制子的那些載體。

例如，F(xiàn).Heffron等人在Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 72(9)3623-27(1975年9月)中，和K.Nagahari&K.Sakaguchi在I.Bact.133(3)1527-29(1978年3月)中描述了表達(dá)質(zhì)粒RSF1010。質(zhì)粒RSF1010及其衍生物是本發(fā)明中特別有效的載體。本領(lǐng)域中已知的、示例性的可用的RSF1010衍生物包括，例如pKT212、pKT214、pKT231和相關(guān)質(zhì)粒，以及pMYC1050和相關(guān)質(zhì)粒(參看，例如，授予Thompson等的美國專利5,527,883和5,840,554)，例如，pMYC1803。質(zhì)粒pMYC1803來自RSF1010-基質(zhì)粒pTJS260(參看授予Wilcox的美國專利5,169,760)，其從RSF1010質(zhì)粒中攜帶調(diào)節(jié)的抗四環(huán)素標(biāo)記物和復(fù)制和流通(mobilization)位點(diǎn)。其它示例性的可用載體包括授予Puhler等人的美國專利4,680,264中描述的那些。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用表達(dá)質(zhì)粒作為表達(dá)載體。在另一具體實(shí)施方案中，使用RSF1010或其衍生物作為表達(dá)載體。在再一具體實(shí)施方案中，使用pMYC1050或其衍生物或pMYC1803或其衍生物作為表達(dá)載體。
可以使用選擇標(biāo)記基因(也存在于質(zhì)粒中)將質(zhì)粒保持在宿主細(xì)胞中。這可以是抗生素抗性基因，在這種情況下可以在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的抗生素，或者是已知在本領(lǐng)域內(nèi)可用的任何其它類型的選擇標(biāo)記基因，例如原養(yǎng)恢復(fù)基因(prototrophy-restoring gene)，在這種情況下，在宿主細(xì)胞中使用對相應(yīng)的特性(例如生物催化特性，例如氨基酸生物合成或核苷酸生物合成特性，或碳源利用特性)有營養(yǎng)缺陷的質(zhì)粒。
按照本發(fā)明使用的啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子(regulated promoters)?？捎玫恼{(diào)節(jié)型啟動(dòng)子的常用例子包括來自lac啟動(dòng)子(也就是lacZ啟動(dòng)子)的那類啟動(dòng)子，尤其是授予DeBoer的美國專利4,551,433中描述的tac和trc啟動(dòng)子，以及Ptac16、Ptac17、PtacII、PlacUV5和T7lac啟動(dòng)子。在某些具體實(shí)施方案中，啟動(dòng)子來自大腸桿菌有機(jī)體。
本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)中可用的非lac型啟動(dòng)子的常用例子包括，例如，表3中列的那些。

參看，例如J.Sanchez-Romero&V.De Lorenzo(1999)GeneticEngineering of Nonpathogenic Pseudomonas Strains as Biocatalysts forIndustrial and Environmental Processes，在Manual of IndustrialMicrobiology(A.Demain&J.Davies，eds)中pp.460-74(ASM Press，Washington，D.C.)；H.Schweizer(2001)Vectors to express foreign genesand techniques to monitor gene expression for Pseudomonads，CurrentOpinion in Biotechnology，12439-445；以及R.Slater&R.Williams(2000)The Expression of Foreign DNA in Bacteria，在Molecular Biology andBiotechnology(J，Walker&R.Rapley.eds.)中pp.125-54(The Royal Societyof Chemistry，Cambridge，UK)。還可以使用含有原產(chǎn)于所選細(xì)菌宿主細(xì)胞的啟動(dòng)子的核苷酸序列的啟動(dòng)子以控制為目標(biāo)多肽編碼的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，例如假單胞菌鄰氨基安息香酸鹽或安息香酸鹽操縱子啟動(dòng)子(Pant，Pben)。還可以使用串聯(lián)(tandem)啟動(dòng)子，其中一個(gè)以上的啟動(dòng)子互相共價(jià)連接，無論它們在序列上是否相同，例如Pant-Pben串聯(lián)啟動(dòng)子(啟動(dòng)子間雜合)或Plac-Plac串聯(lián)啟動(dòng)子。
調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子采用了啟動(dòng)子調(diào)節(jié)蛋白以控制包含啟動(dòng)子作為其組成部分的基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)在此使用調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子時(shí)，相應(yīng)的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)蛋白也可以是本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)的一部分。啟動(dòng)子調(diào)節(jié)蛋白的例子包括激活蛋白，例如大腸桿菌代謝產(chǎn)物激活蛋白，MalT蛋白；AraC族轉(zhuǎn)錄激活子；阻遏蛋白，例如大腸桿菌LacI蛋白；和雙功能調(diào)節(jié)蛋白，例如大腸桿菌NagC蛋白。許多調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子/啟動(dòng)子-調(diào)節(jié)蛋白對是本領(lǐng)域已知的。
啟動(dòng)子調(diào)節(jié)蛋白與效應(yīng)化合物(也就是可逆或不可逆地與調(diào)節(jié)蛋白相連以使蛋白質(zhì)能夠釋放或結(jié)合到該基因的處于啟動(dòng)子控制下的至少一個(gè)DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的化合物)相互作用，從而允許或阻礙轉(zhuǎn)錄酶在啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄中的作用。將效應(yīng)化合物分成誘導(dǎo)物或輔阻遏物，并且這些化合物包括天生的效應(yīng)化合物和義務(wù)誘導(dǎo)化合物。許多調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子/啟動(dòng)子-調(diào)節(jié)蛋白/效應(yīng)化合物三件套是本領(lǐng)域已知的。盡管可以在整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵過程中隨處使用效應(yīng)化合物，但在使用調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子的優(yōu)選具體實(shí)施方案中，在生成了所需量或密度的宿主細(xì)胞生物量后，在培養(yǎng)物中加入合適的效應(yīng)化合物以直接或間接引起所需目標(biāo)基因的表達(dá)。
作為例子，在使用lac族啟動(dòng)子時(shí)，該系統(tǒng)中可以存在lacI基因。LacI基因(其(通常)是組成型表達(dá)的基因)對結(jié)合到這些啟動(dòng)子的lac操縱子上的Lac阻遏蛋白n(LacI蛋白)進(jìn)行編碼。因此，當(dāng)使用lac族啟動(dòng)子時(shí)，在表達(dá)系統(tǒng)中也可以包含并表達(dá)lacI基因。在lac族啟動(dòng)子成員(例如tac啟動(dòng)子)的情況下，效應(yīng)化合物是誘導(dǎo)物，優(yōu)選IPTG(異丙基-D-1-硫代半乳糖苷，也稱作“異丙基硫代半乳糖苷)之類的義務(wù)誘導(dǎo)物。
ChampionTMpET表達(dá)系統(tǒng)提供了高效的蛋白質(zhì)生產(chǎn)。由強(qiáng)T7lac啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)。該系統(tǒng)利用了噬菌體T7RNA聚合酶的高活性和特異性以大量轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因。位于啟動(dòng)子區(qū)域的lac操縱基因提供了比傳統(tǒng)T7-基載體更緊密的調(diào)節(jié)，從而改進(jìn)質(zhì)粒穩(wěn)定性和細(xì)胞存活力(Studier，F(xiàn).W.和B.A.Moffatt(1986)J Molegular Biology 189(1)113-30；Rosenberg等人，(1987)Gene 56(1)125-35)。T7表達(dá)系統(tǒng)使用了T7啟動(dòng)子和T7RNA聚合酶(T7RNAP)以大量轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因。在T7表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，因?yàn)門7RNAP比天然大腸桿菌RNAP更具有加工性并且專門用于相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。通過在宿主細(xì)胞中提供T7RNAP源來誘導(dǎo)確定基因的表達(dá)。這可以使用含有T7RNAP基因的染色體副本的BL21大腸桿菌宿主實(shí)現(xiàn)。T7RNAP基因處于可通過IPTG誘導(dǎo)的LacUV5啟動(dòng)子控制下。在誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)T7RNAP并轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因。
βBAD表達(dá)系統(tǒng)可以通過特定碳源(例如葡萄糖、甘油和阿拉伯糖)的存在進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的緊密受控的可滴定表達(dá)(Guzman等人(1995)JBacteriology 177(14)4121-30)。βBAD載體獨(dú)特地設(shè)計(jì)成對表達(dá)水平進(jìn)行精確控制。在araBAD啟動(dòng)子上開始來自pBAD載體的異質(zhì)基因表達(dá)。通過araC基因的產(chǎn)品正向和負(fù)向調(diào)節(jié)啟動(dòng)子。AraC是與L-阿拉伯糖形成復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子。在不存在L-阿拉伯糖的情況下，AraC二聚物阻礙了轉(zhuǎn)錄。為了獲得最大的轉(zhuǎn)錄活化作用，要求兩種情況(i)L-阿拉伯糖結(jié)合到AraC上以使轉(zhuǎn)錄開始，(ii)cAMP激活蛋白(CAP)-cAMP復(fù)合物結(jié)合到DNA上并促進(jìn)AraC結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)域的正確位置上。
Trc表達(dá)系統(tǒng)可以在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)來自trc啟動(dòng)子的高效的受調(diào)節(jié)的表達(dá)。已經(jīng)對大腸桿菌中的真核基因表達(dá)優(yōu)化了trc表達(dá)載體。trc啟動(dòng)子是來自色氨酸(trp)和乳糖(lac)啟動(dòng)子的強(qiáng)雜合啟動(dòng)子。通過lacO操縱基因和lacIQ基因的產(chǎn)品進(jìn)行調(diào)節(jié)(Brosius，J.(1984)Gene27(2)161-72)。
表達(dá)系統(tǒng)在一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了一種用于制造重組蛋白的改進(jìn)的表達(dá)系統(tǒng)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該系統(tǒng)包括宿主細(xì)胞和載體，該載體包含可與選自pbp分泌信號、OprE分泌信號、Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白分泌信號、天青蛋白分泌信號、鐵(III)結(jié)合蛋白分泌信號和脂蛋白B分泌信號的熒光假單胞菌Sec-系統(tǒng)分泌信號或與該信號序列基本同源的序列相連的重組蛋白或肽。
在另一具體實(shí)施方案中，提供了一種包含熒光假單胞菌宿主細(xì)胞和至少一個(gè)載體的表達(dá)系統(tǒng)，該載體包括來自可與相關(guān)蛋白質(zhì)或肽相連的任何基因組的Sec分泌信號。載體可以具有上述任何特性。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，Sec分泌信號來自熒光假單胞菌基因組。然而，在另一具體實(shí)施方案中，Sec-分泌信號來自任何細(xì)菌基因組。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，分泌信號來自非熒光假單胞菌基因組的細(xì)菌基因組，并且在特定具體實(shí)施方案中，分泌信號來自大腸桿菌基因組。在某些具體實(shí)施方案中，分泌信號可以原產(chǎn)于該蛋白質(zhì)。在另一具體實(shí)施方案中，分泌信號不是原產(chǎn)于蛋白質(zhì)。
例如，提供的分泌系統(tǒng)可以包括Sec分泌信號，例如用于skp蛋白質(zhì)的分泌信號。在將重組表達(dá)的蛋白質(zhì)導(dǎo)向周質(zhì)隔室或?qū)蚣?xì)胞外時(shí)，載體中可以包含可與相關(guān)蛋白質(zhì)相連的該蛋白質(zhì)的內(nèi)在前導(dǎo)序列。
在其它具體實(shí)施方案中，載體中可以包括來自不同蛋白質(zhì)的分泌信號序列。令人驚奇地，熒光假單胞菌可以恰當(dāng)?shù)赝ㄟ^其Sec分泌路徑將帶有各種信號序列的蛋白質(zhì)導(dǎo)向周質(zhì)中。在一些具體實(shí)施方案中，在信號序列和相關(guān)蛋白質(zhì)或肽之間不提供進(jìn)一步修飾。然而，在某些具體實(shí)施方案中，加入附加的裂解信號以促進(jìn)肽的氨基末端的恰當(dāng)加工。
分泌系統(tǒng)還可以包括如下所述的發(fā)酵培養(yǎng)基。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該系統(tǒng)包括無機(jī)鹽培養(yǎng)基。在另一具體實(shí)施方案中，該系統(tǒng)在培養(yǎng)基中包括化學(xué)誘導(dǎo)物。
該系統(tǒng)還可以包括啟動(dòng)子(其可以是可選擇啟動(dòng)子)和誘導(dǎo)物。有時(shí)，該啟動(dòng)子是非原產(chǎn)于熒光假單胞菌的啟動(dòng)子，例如大腸桿菌啟動(dòng)子。在某些具體實(shí)施方案中，該啟動(dòng)子是，例如，可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，例如lac啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子還可以是幾種不同啟動(dòng)子的混合物，其中至少一種不是原產(chǎn)于熒光假單胞菌有機(jī)體。例如，啟動(dòng)子可以是trc啟動(dòng)子。啟動(dòng)子還可以是例如tac啟動(dòng)子。
方法在一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了一種用于制造重組蛋白的改進(jìn)的方法，其包括表達(dá)與Sec分泌信號相連的相關(guān)融合蛋白的熒光假單胞菌宿主細(xì)胞。該方法可以包括提供一種包含載體的熒光假單胞菌細(xì)胞，該載體對可與重組Sec系統(tǒng)分泌信號序列相連的重組蛋白或肽編碼；并在產(chǎn)生蛋白質(zhì)或肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞。載體可以具有上述任何特性。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，Sec分泌信號來自熒光假單胞菌基因組。在另一具體實(shí)施方案中，Sec-分泌信號來自任何細(xì)菌基因組。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，分泌信號來自細(xì)菌基因組，并且在特定具體實(shí)施方案中，分泌信號來自大腸桿菌基因組。在某些具體實(shí)施方案中，分泌信號可以原產(chǎn)于該蛋白質(zhì)。在另一具體實(shí)施方案中，分泌信號不是原產(chǎn)于蛋白質(zhì)。
在另一具體實(shí)施方案中，提供了一種在任何宿主細(xì)胞中制備重組蛋白的改進(jìn)的方法，包括可與宿主細(xì)胞中的相關(guān)重組蛋白或肽相連的選自pbp、OprE、Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白、天青蛋白、鐵(III)結(jié)合蛋白或脂蛋白B分泌信號的熒光假單胞菌Sec-系統(tǒng)分泌肽的表達(dá)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞含有周質(zhì)，且Sec-系統(tǒng)肽的表達(dá)將重組蛋白導(dǎo)向細(xì)胞周質(zhì)。在附屬具體實(shí)施方案中，表達(dá)產(chǎn)生細(xì)胞外蛋白質(zhì)。該方法還可以包括從周質(zhì)或從細(xì)胞外介質(zhì)中提純重組蛋白的步驟。可以表達(dá)與蛋白質(zhì)相連的Sec-信號并且可以從細(xì)胞中提純與信號相連的蛋白質(zhì)。因此，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該分離的肽是分泌信號與相關(guān)蛋白質(zhì)或肽的融合肽。然而，還可以在將蛋白質(zhì)導(dǎo)向周質(zhì)時(shí)從蛋白質(zhì)中裂解出分泌信號。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，改進(jìn)Sec-系統(tǒng)分泌信號與蛋白質(zhì)或肽之間的連接以提高分泌信號的裂解。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該方法可以產(chǎn)生定位于宿主細(xì)胞周質(zhì)中的蛋白質(zhì)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該方法在細(xì)胞中產(chǎn)生恰當(dāng)加工的重組蛋白。在另一具體實(shí)施方案中，Sec-系統(tǒng)肽的表達(dá)可以在細(xì)胞中產(chǎn)生活性重組蛋白。與不用Sec-分泌信號表達(dá)的蛋白質(zhì)相比，本發(fā)明的方法還可以提高重組蛋白的收率。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該方法在周質(zhì)隔室中產(chǎn)生至少0.1克/升蛋白質(zhì)。在另一具體實(shí)施方案中，該方法在細(xì)胞中產(chǎn)生0.1至10克/升周質(zhì)蛋白質(zhì)。在附屬具體實(shí)施方案中，該方法在細(xì)胞中產(chǎn)生至少大約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0克/升周質(zhì)蛋白質(zhì)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所得重組蛋白總量為至少1.0克/升。在一些具體實(shí)施方案中，所得周質(zhì)蛋白質(zhì)的量為所得重組蛋白總量的至少大約5％、大約10％、大約15％、大約20％、大約25％、大約30％、大約40％、大約50％、大約60％、大約70％、大約80％、大約90％、大約95％或更多。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該方法產(chǎn)生至少0.1克/升正確加工過的蛋白質(zhì)。正確加工過的蛋白質(zhì)具有天然蛋白質(zhì)的氨基末端。在另一具體實(shí)施方案中，該方法在細(xì)胞中產(chǎn)生0.1至10克/升正確加工過的蛋白質(zhì)。在附屬具體實(shí)施方案中，該方法產(chǎn)生至少大約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0克/升正確加工過的蛋白質(zhì)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所得正確加工過的重組蛋白總量為至少1.0克/升。在附屬具體實(shí)施方案中，所得正確加工過的蛋白質(zhì)總量為至少大約2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、15.0、20.0或50.0克/升。在一些具體實(shí)施方案中，所得正確加工過的蛋白質(zhì)的量是正確加工形式的重組蛋白總量的至少大約5％、大約10％、大約15％、大約20％、大約25％、大約30％、大約40％、大約50％、大約60％、大約70％、大約80％、大約90％、大約95％或更多。
在一些具體實(shí)施方案中，可以產(chǎn)生活性形式的蛋白質(zhì)。術(shù)語“活性”是指存在生物功能或生物效應(yīng)，其中生物功能或效應(yīng)比得上或基本相當(dāng)于相應(yīng)的天然蛋白質(zhì)或肽的生物功能或效應(yīng)。在蛋白質(zhì)領(lǐng)域中，這通常意味著多核苷酸或多肽包括與使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的相應(yīng)天然蛋白質(zhì)或肽相比具有至少大約20％，大約50％，優(yōu)選至少大約60-80％，最優(yōu)選至少大約90-95％活性的生物功能或效應(yīng)。蛋白質(zhì)或肽活性的測定可以使用特定蛋白質(zhì)或肽的相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)定向(targeted)比較生物檢定法進(jìn)行。重組蛋白或多肽生物功能或效應(yīng)的一個(gè)指征是重組多肽在免疫學(xué)上可與天然多肽交叉反應(yīng)。
在另一具體實(shí)施方案中，制成的表達(dá)出的轉(zhuǎn)基因肽、多肽、蛋白質(zhì)或它們的片段中超過50％可以在宿主細(xì)胞中以可復(fù)性(renaturable)形式制造。在另一具體實(shí)施方案中，表達(dá)出的蛋白質(zhì)中大約60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％以活性形式獲得或可以恢復(fù)成活性形式。
本發(fā)明的方法可以提高重組蛋白的收率。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該方法以總細(xì)胞蛋白量(tcp)的5、10、15、20、25、30、40或50、55、60、65、70或75％制造重組蛋白。“總細(xì)胞蛋白量百分比”是以合計(jì)細(xì)胞蛋白質(zhì)百分比計(jì)的在宿主細(xì)胞中的蛋白質(zhì)或肽的量。總細(xì)胞蛋白量百分比的測定方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
在特定具體實(shí)施方案中，當(dāng)在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長時(shí)(也就是在大約4℃至大約55℃的溫度范圍內(nèi)，包括4℃和55℃在內(nèi))，宿主細(xì)胞可以具有至少1％tcp的重組肽、多肽、蛋白質(zhì)或它們的片段的表達(dá)水平和至少40克/升的細(xì)胞密度。在特別優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，當(dāng)以至少10升的發(fā)酵規(guī)模在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長時(shí)(也就是在大約4℃至大約55℃的溫度范圍內(nèi)，包括4℃和55℃在內(nèi))，表達(dá)系統(tǒng)具有至少5％tcp的重組蛋白質(zhì)或肽表達(dá)水平或至少40克/升的細(xì)胞密度。
宿主細(xì)胞在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于表達(dá)包含Sec-型分泌信號的重組蛋白的熒光假單胞菌表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明的這一方面建立在下述意外發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上——即發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌Sec分泌系統(tǒng)能夠恰當(dāng)?shù)丶庸げ臒晒饧賳伟头菬晒饧賳伟鶶ec信號系統(tǒng)中導(dǎo)出分泌信號。
在該具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群18(Gram-negative Proteobacteria Subgroup 18)”?！案锾m氏-陰性變形菌亞群18”是指熒光假單胞菌屬的所有亞種、變種、菌株及其它亞種單元(sub-special units)的集合，包括例如下列這些細(xì)胞(具有括號內(nèi)所示的示范性菌株的ATCC或其它deposit數(shù))熒光假單胞菌生物型A，也稱為生物變型1或生物變型I(ATCC 13525)；熒光假單胞菌生物型B，也稱為生物變型2或生物變型II(ATCC 17816)；熒光假單胞菌生物型C，也稱為生物變型3或生物變型III(ATCC 17400)；熒光假單胞菌生物型F，也稱為生物變型4或生物變型IV(ATCC 12983)；熒光假單胞菌生物型G，也稱為生物變型5或生物變型V(ATCC 17518)；熒光假單胞菌生物變型VI；熒光假單胞菌Pf0-1；熒光假單胞菌Pf-5(ATCC BAA-477)；熒光假單胞菌SBW25；以及熒光假單胞菌亞種細(xì)胞外層(NCIMB 10462)。
宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群19”?！案锾m氏-陰性變形菌亞群19”是指熒光假單胞菌生物型A的所有菌株的集合。該生物型的特別優(yōu)選的菌株是熒光假單胞菌菌株MB101(參看授予Wilcox的美國專利5,169,760)，及其衍生物。其優(yōu)選衍生物的一個(gè)例子是熒光假單胞菌菌株MB214，其是通過在MB101染色體asd(天冬氨酸鹽脫氫酶基因)位點(diǎn)插入天然大腸桿菌PlacI-lacI-lacZYA結(jié)構(gòu)(也就是其中刪除了PlacZ)而構(gòu)成的。
本發(fā)明中可以使用的其它熒光假單胞菌菌株包括熒光假單胞菌Migula和熒光假單胞菌Loitokitok，具有下列ATCC名稱[NCIB 8286]；NRRL B-1244；NCIB 8865菌株CO1；NCIB 8866菌株CO2；1291[ATCC17458]；IFO 15837；NCIB 8917；LA；NRRL B-1864；吡咯烷；PW2[ICMP3966；NCPPB 967；NRRL B-899]；13475；NCTC 10038；NRRL B-1603[6；IFO 15840]；52-1C；CCEB 488-A[BU 140]；CCEB 553[1EM 15/47]；IAM1008[AHH-27]；IAM 1055[AHH-23]；1[IFO 15842]；12[ATCC 25323；NIH 11；den D0oren de Jong 216]；18[IFO 15833；WRRL P-7]；93[TR-10]；108[52-22；IFO 15832]；143[IFO 15836；PL]；149[2-40-40；IFO 15838]；182[IFO 3081；PJ 73]；184[IFO 15830]；185[W2L-1]；186[IFO 15829；PJ 79]；187[NCPPB 263]；188[NCPPB 316]；189[PJ227；1208]；191[IFO 15834；PJ 236；22/1]；194[Klinge R-60；PJ 253]；196[PJ288]；197[PJ 290]；198[PJ 302]；201[PJ 368]；202[PJ 372]；203[PJ 376]；204[IFO 15835；PJ 682]；205[PJ 686]；206[PJ 692]；207[PJ 693]；208[PJ722]；212[PJ 832]；215[PJ 849]；216[PJ 885]；267[B-9]；271[B-1612]；401[C71A；IFO 15831；PJ 187]；NRRL B-3178[4；IFO 15841]；KY 8521；3081；30-21；[IFO 3081]；N；PYR；PW；D946-B83[BU 2183；FERM-P3328]；P-2563[FERM-P 2894；IFO 13658]；IAM-1126[43F]；M-1；A506[A5-06]；A505[A5-05-1]；A526[A5-26]；B69；72；NRRL B-4290；PMW6[NCIB 11615]；SC 12936；A1[IFO 15839]；F 1847[CDC-EB]；F1848[CDC 93]；NCIB 10586；P17；F-12；AmMS 257；PRA25；6133D02；6519E01；N1；SC15208；BNL-WVC；NCTC 2583[NCIB 8194]；H13；1013[ATCC 11251；CCEB 295]；IFO 3903；1062；或Pf-5。
在另一具體實(shí)施方案種，該方法提供了帶有熒光假單胞菌Sec-系統(tǒng)分泌肽的融合蛋白的表達(dá)，該熒光假單胞菌Sec-系統(tǒng)分泌肽選自磷酸鹽結(jié)合蛋白(pbp)分泌信號、外膜孔蛋白E(OprE)分泌信號、Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白分泌信號、天青蛋白分泌信號、鐵(III)結(jié)合蛋白分泌信號和脂蛋白B分泌信號。該方法建立在下述理念上——即熒光假單胞菌Sec分泌信號加工分泌蛋白的能力表明這些細(xì)胞極其適合制造分泌蛋白。因此，源自這些細(xì)胞的信號發(fā)送系統(tǒng)在多重表達(dá)系統(tǒng)中對于這種分泌是理想的信號發(fā)送系統(tǒng)。因此，使用識別出的熒光假單胞菌Sec系統(tǒng)分泌信號表達(dá)蛋白質(zhì)或肽的方法可用于任何給定的宿主系統(tǒng)，包括真核和原核來源的宿主系統(tǒng)。
在該具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可以是能夠產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)或肽的任何細(xì)胞，包括上述熒光假單胞菌細(xì)胞。最常用于制造重組蛋白或肽的系統(tǒng)包括某些細(xì)菌細(xì)胞，特別是大腸桿菌，因?yàn)樗鼈兙哂邢鄬α畠r(jià)的生長要求和潛在的在大批量培養(yǎng)物中制造蛋白質(zhì)的能力。還使用酵母表達(dá)生物相關(guān)的蛋白質(zhì)和肽，特別是用于研究用途。系統(tǒng)包括啤酒酵母(saccaromyces cerevisiae)或pichia pastoris。這些系統(tǒng)已經(jīng)充分表征，提供了大致可接受的總蛋白表達(dá)水平并且相當(dāng)快速和廉價(jià)。還出現(xiàn)了昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)作為以生物活性形式表達(dá)重組蛋白的一種備選方案。有時(shí)，可以制造后轉(zhuǎn)譯修飾的正確折疊的蛋白質(zhì)。已經(jīng)使用了哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，例如中國倉鼠卵巢細(xì)胞，以表達(dá)重組蛋白。這些表達(dá)系統(tǒng)在小規(guī)模下通常有效。某些生物制劑可以由蛋白質(zhì)制成，特別是在動(dòng)物或人類保健用途中。在另一具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞，包括，但不限于煙草細(xì)胞、玉米、來自擬南芥屬(arabidopsis)的細(xì)胞、馬鈴薯或稻米細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，在該方法中分析和改變多細(xì)胞有機(jī)體，包括，但不限于轉(zhuǎn)基因有機(jī)體。分析和/或改變多細(xì)胞有機(jī)體的技術(shù)大致基于下述用于改變細(xì)胞的技術(shù)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可以是原核生物，例如細(xì)菌細(xì)胞，包括但不限于埃希氏桿菌屬或假單胞菌屬。在例如由EstrellaMoumtain Community College，Arizona，USA的Dr MJ Parabee在URLhttp://www.emc，micropa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BiobookDiversity_2.html上提供的“Biological DiversityBacteria and Archaeans”，ON-LineBiology Book的一章中描述了典型的細(xì)菌細(xì)胞。在某些具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可以是假單胞菌細(xì)胞，并且通常是熒光假單胞菌細(xì)胞。在其它具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞也可以是大腸桿菌細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，例如昆蟲細(xì)胞，包括但不限于來自斜紋夜蛾、Trichoplusia Drosophila或estigmene屬的細(xì)胞，或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括但不限于鼠科動(dòng)物細(xì)胞、倉鼠細(xì)胞、猴子細(xì)胞、靈長類細(xì)胞或人類細(xì)胞。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可以是任何細(xì)菌分類群的一員。細(xì)胞可以是例如任何種類的真細(xì)菌的一員。宿主可以是下列分類群的任何一種中的一員酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、產(chǎn)水菌門(Aquificae)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠菌門(Chlorobi)、衣原體(Chlamydiae)、綠彎菌門(Chloroflexi)、產(chǎn)金菌門(Chrysiogenetes)、藍(lán)細(xì)菌、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、恐球菌(Deinococcus)、網(wǎng)團(tuán)菌門(Dictyoglomi)、螺旋體門(Fibrobacteres)、厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、Lentisphaerae、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、浮霉菌門(Planctomycetes)、變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體(Spirochaetes)、熱脫硫桿菌門(Thermodesulfobacteria)、熱微菌門(Thermomicrobia)、熱袍菌門(Thermotogae)、棲熱菌(Thermus)(Thermales)、或疣微菌門(Verrucomicrobia)。在真細(xì)菌宿主細(xì)胞的具體實(shí)施方案中，該細(xì)胞可以是任何種類的真細(xì)菌的一員，不包括藍(lán)細(xì)菌。
細(xì)菌宿主還可以是任何種類的變形菌的一員。變形菌宿主細(xì)胞可以是α-變形菌門、β-變形菌門、γ-變形菌門、δ-變形菌門、ε-變形菌門。此外，宿主可以是分類群α-變形菌門、β-變形菌門、γ-變形菌門的任何一種中的一員，和任何種類的γ-變形菌門的一員。
在γ-變形菌門宿主的具體實(shí)施方案中，宿主可以是分類群氣單胞菌目、交替單胞菌目、腸桿菌目、假單胞菌目或黃單胞菌目；或任何種類的腸桿菌目或假單胞菌目的一員。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可以是腸桿菌目，宿主細(xì)胞是腸桿菌目中的一員，或Erwinia屬、埃希氏桿菌屬或沙雷氏菌屬任何一種中的一員；或埃希氏桿菌屬的一員。在假單胞菌目(pseudomonadales)的宿主細(xì)胞的一個(gè)具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可以是Pseudomonadaceae屬的一員，甚至是Pseudomonas屬的一員。γ-變形菌門宿主包括大腸桿菌屬的成員和熒光假單胞菌屬的成員。
其它假單胞菌屬有機(jī)體也可用。假單胞菌屬和關(guān)系很近的物類包括革蘭氏陰性變形菌亞群1，其包括屬于被R.E.Buchanan和N.E.Gibbons(eds.)描述成“Gram-Negative Aerobic Rods and Cocci”，Bergey’sManual of Determinative Bacteriology，pp.217-289(8th ed.，1974)(TheWilliams&Wilkins Co.，Baltimore，MD，USA)(下文中稱“Bergey(1974)”)的科和/或?qū)俚淖冃尉募?。?呈現(xiàn)了有機(jī)體的這些科和屬。

“革蘭氏-陰性變形菌亞群1”也包括按照分類學(xué)中采用的標(biāo)準(zhǔn)在標(biāo)題中分類的變形菌。該標(biāo)題也包括曾經(jīng)——但已經(jīng)不再歸入該項(xiàng)中的類別，例如食酸菌屬、短波單胞菌屬、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)、氫噬胞菌屬、Oceanimonas、青枯菌屬(Ralstonia)、以及寡養(yǎng)食單胞菌屬，通過重組屬于黃單胞菌屬(以前被稱為種)的有機(jī)體而獲得的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)，通過重組屬于Bergy(1974)中所定義的醋酸桿菌屬的有機(jī)體而獲得酸單胞菌屬(Acidomonas)。此外，宿主可以包括來自假單胞菌屬、Pseudomonas enalia(ATCC 14393)、黑色腐敗假單胞菌(Pseudomonas nigrifaciens)(ATCC 19375)和Pseudomonasputrefaciens(ATCC 14393)的細(xì)胞，它們已經(jīng)分別重新分類成Alteromonas haloplanktis、Alteromonas nigrifaciens和Alteromonasputrefaciens。類似地，已經(jīng)分別將食酸假單胞菌屬(ATCC 15668)和睪丸酮假單胞菌屬(ATCC 11996)重新分類成食酸叢毛單胞菌和睪丸酮叢毛單胞菌；并且已經(jīng)分別將pseudomonas nigrifaciens(ATCC 19375)和pseudomonas piscicida(ATCC 15057)重新分類成Pseudoalteromonasnigrifaciens和Pseudoalteromonas piscicida。“革蘭氏-陰性亞群1”還包括被歸類為屬于下列任何一科的變形菌門假單胞菌科，固氮菌科(現(xiàn)在常稱其異名，假單胞菌科的“固氮菌群”)，根瘤菌科，和甲基單胞菌(現(xiàn)在常稱其異名，“Methylococcaceae”)。因此，除了在本文中其它地方描述的屬，在“革蘭氏-陰性亞群1”內(nèi)的其它變形菌屬包括1)Azorhizophilus屬的固氮菌類細(xì)菌；2)纖維弧菌素、寡源桿菌(Oligella)、和Teredinibacter屬的假單胞菌科細(xì)菌；3)Chelatobacter、劍菌屬、Liberibacter(也稱為“Candidatus Liberibacter”)和中華根瘤菌屬的根瘤菌科細(xì)菌；以及4)甲基桿菌屬、甲基暖菌屬、甲基微菌屬、甲基八疊球菌屬、和甲基球形菌屬的甲基球菌科細(xì)菌。
在另一具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群2”。“革蘭氏-陰性變形菌亞群2”是指下列屬的變形菌(除非另行說明，目錄中所列的、可公開獲得的、括號中所示的其標(biāo)號菌株全部都標(biāo)在ATCC上)酸單胞菌屬(2)；醋酸桿菌屬(93)；葡萄糖桿菌屬(37)；Brevundimonas(23)；拜葉林克氏菌屬(Beijerinckia)(13)；德克斯氏菌屬(2)；布魯氏菌(4)；土壤桿菌屬(79)；Chelatobacter(2)；劍菌屬(3)；根瘤菌屬(144)；中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)(24)；Blastomonas(1)；鞘氨醇單胞菌(27)；產(chǎn)堿桿菌(88)；包特氏菌屬(Bordetella)(43)；伯克霍爾德菌(73)；青枯菌屬(Ralstonia)(33)；食酸菌(Acidovorax)(20)；氫噬胞菌屬(9)；動(dòng)膠菌屬(Zoogloea)(9)；甲基桿菌(2)；甲基暖菌屬(1 at NCIMB)；甲基球菌屬(2)；甲基微菌屬(2)；甲基單胞菌屬(9)；甲基八疊球菌屬(1)；甲基球形菌屬；氮單胞菌屬(9)；Azorhizophilus(5)；固氮菌屬(64)；纖維弧菌屬(3)；寡源桿菌(Oligella)(5)；假單胞菌(1139)；弗朗西斯氏菌屬(4)；黃單胞菌屬(229)；寡養(yǎng)食單胞菌(50)；和Oceanimonas(4)。
“革蘭氏-陰性變形菌亞群2”的示例性宿主細(xì)胞類型包括，但不限于，下列細(xì)菌(帶有ATCC或括號中所示的示例性菌株的其它標(biāo)號)甲醇酸單胞菌(ATCC 43581)；紋膜醋酸桿菌(Acetobacter aceti(ATCC15973)；氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)(ATCC 19357)；缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)(ATCC 11568)；印度貝氏固氮菌(ATCC 9039和ATCC 19361)；膠德克斯氏菌(Derxia gummosa)(ATCC 15994)；波狀熱菌(ATCC 23456)，流產(chǎn)布魯氏菌(ATCC23448)；根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)(ATCC 23308)；放射土壤桿菌(ATCC 19358)；毛根土壤桿菌(ATCC 11325)；Chelatobacter heintzii(ATCC 29600)；Ensifer adhaerens(ATCC 33212)；豆科植物根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)(ATCC 10004)；費(fèi)氏中華根瘤菌(ATCC 35423)；Blastomonas natatoria(ATCC 35951)；少動(dòng)鞘氨醇單胞菌(ATCC 29837)；糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes faecalis)(ATCC 8750)；百日咳桿菌(Bordetella pertussis)(ATCC 9797)；洋蔥伯克霍爾德菌(ATCC 25416)；Ralstonia pickettii(ATCC 27511)；敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)(ATCC 11228)；黃色氫噬胞菌屬(ATCC 33667)；分支菌膠團(tuán)(生枝動(dòng)膠菌Zoogloea ramigera)(ATCC19544)；Methylobacter luteus(ATCC 49878)；Methylocaldum gracile(NCIMB 11912)；莢膜甲基球菌屬(Methylococcus capsulatus)(ATCC19069)；Methylomicrobium agile(ATCC 35068)；甲烷甲基單胞菌屬(ATCC 35067)；Methylosarcina fibrata(ATCC 700909)；Methylosphaerahansonii(ACAM 549)；敏捷氮單胞菌屬(ATCC 7494)；Azorhizophiluspaspali(ATCC 23833)；褐球固氮菌(ATCC 9043)；Cellvibrio mixtus(UQM 2601)；尿道寡源桿菌(ATCC 17960)；綠膿假單胞菌(ATCC10145)；熒光假單胞菌(ATCC 35858)；土拉熱弗朗西斯氏菌(Francisellatularensis)(ATCC 6223)；嗜麥寡養(yǎng)食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)(ATCC 13637)；野油菜黃單胞菌屬(Xanthomonascampestris)(ATCC 33913)；和Oceanimonas doudoroffii(ATCC 27123)。
在另一具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群3”?！案锾m氏-陰性變形菌亞群3”是指下列屬的變形菌Brevundimonas；土壤桿菌(Agrobacterium)；根瘤菌(Rhizobium)；中華根瘤菌(Sinorhizobium)；Blastomonas；鞘氨醇單胞菌；產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)；伯克霍爾德菌；青枯菌屬(Ralstonia)；食酸菌(Acidovorax)；氫噬胞菌屬；甲基桿菌屬；甲基暖菌屬；甲基球菌屬；甲基微菌屬；甲基單胞菌屬；甲基八疊球菌屬；甲基球形菌屬；氮單胞菌屬；Azorhizophilus；固氮菌(Azotobacter)；纖維弧菌屬；寡源桿菌(Oligella)；假單胞菌；Teredinibacter；弗朗西斯氏菌屬(Francisella)；寡養(yǎng)食單胞菌；黃單胞菌素；和Oceanimonas。
在另一具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群4”。“革蘭氏-陰性變形菌亞群4”是指下列屬的變形菌Brevundimonas；Blastomonas；鞘氨醇單胞菌；伯克霍爾德菌；青枯菌屬(Ralstonia)；食酸菌(Acidovorax)；氫噬胞菌屬；Mehtylobacter；甲基暖菌屬；甲基球菌屬；甲基微菌屬；甲基單胞菌屬；甲基八疊球菌屬；甲基球形菌屬；氮單胞菌屬；Azorhizophilus；固氮菌；纖維弧菌屬；寡源桿菌(Oligella)；假單胞菌；Teredinibacter；弗朗西斯氏菌屬(Francisella)；寡養(yǎng)食單胞菌；黃單胞菌素；和Oceanimonas。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群5”。“革蘭氏-陰性變形菌亞群5”是指下列屬的變形菌甲基桿菌屬；甲基暖菌屬；甲基球菌屬；甲基微菌屬；甲基單胞菌屬；甲基八疊球菌屬；甲基球形菌屬；氮單胞菌屬；Azorhizophilus；固氮菌；纖維弧菌屬；寡源桿菌(Oligella)；假單胞菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；弗朗西斯氏菌屬(Francisella)；寡養(yǎng)食單胞菌；黃單胞菌素；和Oceanimonas。
宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群6”。“革蘭氏-陰性變形菌亞群6”是指下列屬的變形菌Brevundimonas；Blastomonas；鞘氨醇單胞菌；伯克霍爾德菌；青枯菌屬(Ralstonia)；食酸菌(Acidovorax)；氫噬胞菌屬；氮單胞菌屬；Azorhizophilus；固氮菌；纖維弧菌屬；寡源桿菌(Oligella)；假單胞菌；Teredinibacter；寡養(yǎng)食單胞菌；黃單胞菌屬；和Oceanimonas。
宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群7”?！案锾m氏-陰性變形菌亞群7”是指下列屬的變形菌氮單胞菌屬；Azorhizophilus；固氮菌；纖維弧菌屬；寡源桿菌(Oligella)；假單胞菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；寡養(yǎng)食單胞菌；黃單胞菌屬；和Oceanimonas。
宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群8”?！案锾m氏-陰性變形菌亞群8”是指下列屬的變形菌Brevundimonas；Blastomonas；鞘氨醇單胞菌；伯克霍爾德菌；青枯菌屬(Ralstonia)；食酸菌(Acidovorax)；氫噬胞菌屬；假單胞菌；寡養(yǎng)食單胞菌；黃單胞菌屬；和Oceanimonas。
宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群9”?！案锾m氏-陰性變形菌亞群9”是指下列屬的變形菌Brevundimonas；伯克霍爾德菌；青枯菌屬(Ralstonia)；食酸菌(Acidovorax)；氫噬胞菌屬；假單胞菌；寡養(yǎng)食單胞菌；和Oceanimonas。
宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群10”?！案锾m氏-陰性變形菌亞群10”是指下列屬的變形菌伯克霍爾德菌；青枯菌屬(Ralstonia)；假單胞菌；寡養(yǎng)食單胞菌；和黃單胞菌屬。
宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群11”?！案锾m氏-陰性變形菌亞群11”是指下列屬的變形菌假單胞菌屬；寡養(yǎng)單胞菌屬；和黃單胞菌屬。宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群12”?！案锾m氏-陰性變形菌亞群12”是指下列屬的變形菌伯克霍爾德菌；青枯菌；假單胞菌。宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群13”?！案锾m氏-陰性變形菌亞群13”是指下列屬的變形菌伯克霍爾德菌；青枯菌；假單胞菌屬；和黃單胞菌屬。宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群14”?！案锾m氏-陰性變形菌亞群14”是指下列屬的變形菌假單胞菌屬和黃單胞菌屬。宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群15”?！案锾m氏-陰性變形菌亞群15”是指假單胞菌屬的變形菌。
宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群16”?！案锾m氏-陰性變形菌亞群16”是指下列屬的變形菌(帶有ATCC或括號中所示的示例性菌株的其它標(biāo)號)Pseudomonas abietaniphila(ATCC 700689)；銅綠假單胞菌(ATCC 10145)；產(chǎn)堿假單胞菌(ATCC 14909)；Pseudomonasanguilliseptica(ATCC 33660)；Pseudomonas citronellolis(ATCC 13674)；Pseudomonas flavescens(ATCC 51555)；門多薩假單胞菌(ATCC25411)；硝基還原假單胞菌(ATCC 33634)；Pseudomonas oleovorans(ATCC 8062)；加產(chǎn)堿假單胞菌(ATCC 17440)；Pseudomonasresinovorans(ATCC 14235)；Pseudomonas straminea(ATCC 33636)；蘑菇假單胞菌(ATCC 25941)；Pseudomonas alcaliphila；Pseudomonasalginovora；Pseudomonas andersonii；Pseudomonas asplenii (ATCC23835)；Pseudomonas azelaica(ATCC 27162)；Pseudomonas beijerinckii(ATCC 19372)；Pseudomonas borealis；Pseudomonas boreopolis(ATCC33662)；Pseudomonas brassicacearum；Pseudomonas butanovora(ATCC43655)；Pseudomonas cellulosa(ATCC 55703)；Pseudomonas aurantiaca(ATCC 33663)；Pseudomonas chlororaphis (ATCC 9446，ATCC13985，ATCC 17418，ATCC 17461)；Pseudomonas fragi(ATCC 4973)；Pseudomonas lundensis(ATCC 49968)；Pseudomonas taetrolens(ATCC4683)；Pseudomonas cissicola(ATCC 33616)；Pseudomonascoronafaciens；Pseudomonas diterpeniphila；Pseudomonas elongata(ATCC10144)；Pseudomonas flectens(ATCC 12775)；PseudomonasazotofOrnans；Pseudomonas brenneri；Pseudomonas cedrella；Pseudomonas corrugata(ATCC 29736)；Pseudomonas extremorientalis；熒光假單胞菌(ATCC 35858)；Pseudomonas gessardii；Pseudomonaslibanensis；Pseudomonas mandelii(ATCC 700871)；Pseudomonasmarginalis(ATCC 10844)；Pseudomonas migulae；Pseudomonasmucidolens(ATCC 4685)；Pseudomonas orientalis；Pseudomonasrhodesiae；Pseudomonas synxantha(ATCC 9890)；Pseudomonas tolaasii(ATCC 33618)；Pseudomonas veronii(ATCC 700474)；Pseudomonasfrederiksbergensis；Pseudomonas geniculata(ATCC 19374)；Pseudomonasgingeri；Pseudomonas graminis；Pseudomonas grimontii；Pseudomonashalodenitrificans；Pseudomonas halophila；Pseudomonas hibiscicola(ATCC19867)；Pseudomonas huttiensis (ATCC 14670)；Pseudomonashydrogenovora；Pseudomonas jessenii(ATCC 700870)；Pseudomonaskilonensis；Pseudomonas lanceolata(ATCC 14669)；Pseudomonas lini；Pseudomonas marginata(ATCC 25417)；Pseudomonas mephitica(ATCC33665)；Pseudomonas denitrificans(ATCC 19244)；Pseudomonaspertucinogena(ATCC 190)；Pseudomonas pictorum(ATCC 23328)；Pseudomonas psychrophila；Pseudomonas fulva(ATCC 31418)；Pseudomonas monteilii(ATCC 700476)；Pseudomonas mosselii；Pseudomonas oryzihabitans(ATCC 43272)；Pseudomonas plecoglossicida(ATCC 700383)；Pseudomonas putida(ATCC 12633)；Pseudomonasreactans；Pseudomonas spinosa(ATCC 14606)；Pseudomonas balearica；Pseudomonas luteola(ATCC 43273)；Pseudomonas stutzeri(ATCC17588)；Pseudomonas amygdali(ATCC 33614)；Pseudomonas avellanae(ATCC 700331)；Pseudomonas caricapapayae(ATCC 33615)；Pseudomonas cichorii(ATCC 10857)；Pseudomonas ficuserectae(ATCC35104)；Pseudomonas fuscovaginae；Pseudomonas meliae(ATCC 33050)；假單胞菌(Pseudomonas syringae)(ATCC 19310)；Pseudomonasviridiflava(ATCC 13223)；Pseudomonas thermocarboxydovorans(ATCC35961)；Pseudomonas thermotolerans；Pseudomonas thivervalensis；Pseudomonas vancouverensis(ATCC 700688)；Pseudomonaswisconsinensis；和Pseudomonas xiamenensis。
宿主細(xì)胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群17”?！案锾m氏-陰性變形菌亞群17”是指在本領(lǐng)域中被稱作“熒光假單胞菌屬”的變形菌，包括屬于例如下列假單胞菌屬的變形菌Pseudomonas azotofOrnans；Pseudomonas brenneri；Pseudomonas cedrella；Pseudomonas corrugata；Pseudomonas extremorientalis；熒光假單胞菌；Pseudomonas gessardii；Pseudomonas libanensis；Pseudomonas mandelii；邊緣假單胞菌；Pseudomonas migulae；Pseudomonas mucidolens；Pseudomonas orientalis；Pseudomonas rhodesiae；產(chǎn)黃假單胞菌；Pseudomonas tolaasii；和Pseudomonas veronii。
其它合適的宿主包括在本文獻(xiàn)其它部分中分類的那些，例如革蘭氏(+)變形菌。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是大腸桿菌。對于大腸桿菌MG1655，已經(jīng)確立了大腸桿菌的基因組序列(Blattner等，(1997)The complete genome sequence of Escherichia coli K-12 Science277(5331)1453-74)，且對于大腸桿菌K12(MWG Inc，High Point，NC)，可通過商業(yè)途徑獲得DNAmicroarrays。可以在富營養(yǎng)培養(yǎng)基，例如Luria-Bertani(LB)(10克/升胰胨，5克/升NaCl，5克/升酵母提取物)，或確定的基本培養(yǎng)基，例如M9(6克/升Na2HPO4，3克/升KH2PO4，1克/升NH4Cl，0.5克/升NaCl，pH7.4)中用1％葡萄糖之類的合適碳源培養(yǎng)大腸桿菌。常規(guī)地，將大腸桿菌的過夜培養(yǎng)物稀釋并在振蕩培養(yǎng)瓶或發(fā)酵器中植入新的富營養(yǎng)或標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中并在37℃生長。
宿主還可以來自哺乳動(dòng)物，例如來自哺乳動(dòng)物(包括任何人類或非人類哺乳動(dòng)物)的細(xì)胞。哺乳動(dòng)物可以包括，但不限于靈長動(dòng)物、猴子、豬科、綿羊科、?？?、嚙齒動(dòng)物、有蹄動(dòng)物、豬、swine、羊、羔羊、山羊、家畜、鹿、騾、馬、猴子、猿、狗、貓、鼠和小鼠。
宿主細(xì)胞還可以來自植物。對于基因和調(diào)節(jié)序列的識別，可以選擇任何植物。對于基因和調(diào)節(jié)序列的分離，合適的植物目標(biāo)的例子包括，但不限于，苜蓿、蘋果、杏、擬南芥(arabidopsis)、朝鮮薊、芝麻菜、蘆筍、鱷梨、香蕉、大麥、豆、甜菜、黑莓、藍(lán)莓、花莖甘藍(lán)、球芽甘藍(lán)、卷心菜、菜籽油、羅馬甜瓜、胡蘿卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、櫻桃、菊苣、芫荽葉、柑橘屬果樹、克萊門氏小柑橘、三葉草、椰子、咖啡、玉米、棉花、蔓越橘、黃瓜、花旗松、茄子、菊苣(endive)、寬葉萵苣、桉樹、茴香、無花果、大蒜、葫蘆、葡萄、葡萄柚、甘露、豆薯、獼猴桃、萵苣、韭菜、檸檬、酸橙、火炬松、亞麻子、芒果、瓜、蘑菇、油桃、堅(jiān)果、燕麥、油棕、油菜籽、秋葵、橄欖樹、洋蔥、橙、觀賞植物、棕櫚、番木瓜、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿子、松樹、菠蘿、車前草、李子、石榴、白楊、馬鈴薯、南瓜、溫柏、輻射松、radiscchio、蘿卜、油菜籽、覆盆子、稻米、黑麥、高粱、美國長葉松、大豆、菠菜、南瓜(squash)、草莓、sugarbeet、甘蔗、向日葵、甘薯、蘇合香、柑橘(tangerine)、茶、煙草、番茄、黑小麥、草地、蕪菁甘藍(lán)、葡萄樹、西瓜、小麥、山藥和綠皮密生西葫蘆。在一些具體實(shí)施方案中，在該方法中可用的植物為擬南芥(Arabidopsis)、玉米、小麥、大豆和棉花。
對于重組蛋白或肽的表達(dá)，或?qū)τ谧R別的補(bǔ)充基因的調(diào)節(jié)，可以使用任何植物啟動(dòng)子。植物啟動(dòng)子中包含的元件可以是通常位于轉(zhuǎn)錄初始位點(diǎn)的大約25至35上游堿基對(5’)之間的TATA框或Goldberg-Hogness框，和位于70和100上游堿基之間的CCAAT框。在植物中，CCAAT框具有與哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子的功能類似序列不同的一致序列(Messing等(1983)InGenetic Engineering of Plants，Kosuge等，eds.，pp.211-227)。此外，幾乎所有啟動(dòng)子都在轉(zhuǎn)錄初始位點(diǎn)的上游包括延伸大約-100bp至-1000bp或更高的附加的上游激活序列或增強(qiáng)子(Benoist and Chambon(1981)Nature 290304-310；Gruss等(1981)Proc.Nat.Acad.Sci.78943-947；和Khoury and Gruss(1983)Cell27313-314)。
蛋白質(zhì)制造/發(fā)酵本發(fā)明的方法最適宜提高宿主細(xì)胞中重組蛋白質(zhì)或肽的產(chǎn)量。提高的產(chǎn)量可以是恰當(dāng)加工過的蛋白質(zhì)或肽在所得每克蛋白質(zhì)中或在每克宿主蛋白質(zhì)中的含量提高。提高的產(chǎn)量還可以是制成的可回收的蛋白質(zhì)或肽在每克重組蛋白中或在每克宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)中的含量提高。提高的產(chǎn)量還可以是提高的總量與提高的恰當(dāng)加工的、活性或可溶蛋白質(zhì)含量的任意結(jié)合。
重組蛋白的改進(jìn)表達(dá)可以是蛋白質(zhì)的溶度提高。可以從宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、周質(zhì)或細(xì)胞外培養(yǎng)基中制造并回收重組蛋白或肽。蛋白質(zhì)或肽可以是不溶或可溶的。蛋白質(zhì)或肽可以包括一個(gè)或多個(gè)定向序列以協(xié)助提純。
細(xì)胞生長可以使用本領(lǐng)域已知的任何轉(zhuǎn)化方法用載體進(jìn)行假單胞菌宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并且細(xì)菌宿主細(xì)胞可以作為完整細(xì)胞或作為內(nèi)在質(zhì)體(也就是包括胞質(zhì)體)轉(zhuǎn)化。示例性的轉(zhuǎn)化方法包括穿孔法(例如電穿孔)、內(nèi)在質(zhì)體融合、細(xì)菌接合、和二價(jià)陽離子處理，例如氯化鈣處理或CaCl/Mg2+處理，或本領(lǐng)域其它公知的方法。參看，例如，Morrison，J.Bact.，132349-351(1977)；Clark-Curtiss&Curtiss，Methods inEnzymology，101347-362(Wu等，eds，1983)，Sambrok等，MolecularCloning，A Laboratory Manual(第二版，1989)；Kriegler，Gene Transferand ExpressionA Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等，eds，1994)。
此處所用的術(shù)語“發(fā)酵”既包括使用字面意義的發(fā)酵的具體實(shí)施情況，又包括使用其它非發(fā)酵型培養(yǎng)方式的具體實(shí)施情況。發(fā)酵可以在任何規(guī)模下進(jìn)行。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，發(fā)酵培養(yǎng)基可以選自富營養(yǎng)(rich)培養(yǎng)基、基本培養(yǎng)基和無機(jī)鹽培養(yǎng)基；可以使用富營養(yǎng)培養(yǎng)基，但優(yōu)選避免使用。在另一具體實(shí)施方案中，選擇基本培養(yǎng)基或無機(jī)鹽培養(yǎng)基。在再一具體實(shí)施方案中，選擇基本培養(yǎng)基。在又一具體實(shí)施方案中，選擇無機(jī)鹽培養(yǎng)基。無機(jī)鹽培養(yǎng)基特別優(yōu)選。
無機(jī)鹽培養(yǎng)基包括無機(jī)鹽和碳源，例如葡萄糖、蔗糖或甘油。無機(jī)鹽培養(yǎng)基的例子包括，例如，M9培養(yǎng)基、假單胞菌培養(yǎng)基(ATCC179)、Davis and Mingioli培養(yǎng)基(參看，BD Davis&ES Mingioli(1950)，在J.Bact.6017-28中)。用于制造無機(jī)鹽培養(yǎng)基的無機(jī)鹽包括選自例如磷酸鉀、硫酸銨或氯化銨、硫酸鎂或氯化鎂、和微量礦物質(zhì)(例如氯化鈣、鐵、銅、錳和鋅的硼酸鹽和硫酸鹽)的那些無機(jī)鹽。在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中不包含任何有機(jī)氮源，例如胨、胰蛋白胨、氨基酸或酵母提取物。相反，使用無機(jī)氮源并且其可以選自例如銨鹽、氨水和氣態(tài)氨。優(yōu)選無機(jī)鹽培養(yǎng)基包含葡萄糖作為碳源。與無機(jī)鹽培養(yǎng)基相比，基本培養(yǎng)基還可以包含無機(jī)鹽和碳源，但是可以補(bǔ)充少量氨基酸、維生素、胨或其它成分，盡管這些只能以非常小的量加入。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，可以使用下表5所列的組分制備培養(yǎng)基?？梢园凑障铝许樞蛱砑咏M分首先可以將(NH4)HPO4、KH2PO4和檸檬酸溶于大約30升蒸餾水；然后可以加入微量元素的溶液，然后加入防沫劑，例如Ucolub N115。然后，在熱殺菌(例如大約121℃)后，可以加入葡萄糖MgSO4和硫胺素-HCL的無菌溶液。使用氨水實(shí)現(xiàn)大約6.8的pH控制。然后加入無菌蒸餾水將初始體積調(diào)節(jié)至371減甘油原料(123毫升)。這些化學(xué)品可購自各個(gè)供應(yīng)商，例如Merck。該培養(yǎng)基可以進(jìn)行高細(xì)胞密度培養(yǎng)(HCDC)以生長假單胞菌屬和相關(guān)細(xì)菌。HCDC可以作為分批法開始，然后進(jìn)行兩相進(jìn)料分批培養(yǎng)。在分批部件中無限生長之后，可以在降低的比生長速率下經(jīng)過3加倍時(shí)間控制生長，其中生物量濃度可以提高數(shù)倍。Riesenberg，D.；Schulz，V.；Knorre，W.A.；Pohl，H.D.；Korz，D.；Sanders，E.A.；Ross，A.；Derckwer，W.D.(1991)“Hign cell density cultivation of Escherichia coli at controlledspecific growth rate”J Bviotechnol20(1)17-27描述了這些培養(yǎng)程序的進(jìn)一步細(xì)節(jié)。

可以以任何發(fā)酵形式培養(yǎng)本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)。例如，此處可以使用分批、進(jìn)料-分批、半連續(xù)和連續(xù)發(fā)酵模式。
本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)可用于任何發(fā)酵規(guī)模(也就是體積)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。因此，可以使用例如微升規(guī)模、厘升規(guī)模和分升規(guī)模發(fā)酵體積；可以使用1升規(guī)模和更大的發(fā)酵體積。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，發(fā)酵體積為1升或更高。在另一具體實(shí)施方案中，發(fā)酵溶劑為5升、10升、15升、20升、25升、50升、75升、100升、200升、500升、1000升、2000升、5000升、10000升或50000升或更高。
在本發(fā)明中，在允許宿主細(xì)胞存活的溫度范圍內(nèi)，優(yōu)選在大約4℃至大約55℃(包括4℃和55℃在內(nèi))的溫度，進(jìn)行轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的生長、培養(yǎng)和/或發(fā)酵。因此，例如，此處對于本發(fā)明的宿主細(xì)胞使用的術(shù)語“生長”，“培養(yǎng)”和“發(fā)酵”本質(zhì)上是指在大約4℃至大約55℃(包括4℃和55℃在內(nèi))的溫度范圍內(nèi)的“生長”、“培養(yǎng)”和“發(fā)酵”。此外，“生長”用于指活性細(xì)胞分裂和/或增大的生物狀態(tài)，以及代謝維持非分裂和/或非增大細(xì)胞的生物狀態(tài)，術(shù)語“生長”的后一種用法與術(shù)語“維持”同義。
細(xì)胞密度在表達(dá)重組分泌蛋白質(zhì)中使用熒光假單胞菌的另一優(yōu)點(diǎn)包括熒光假單胞菌與大腸桿菌或其它細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)相比以高細(xì)胞密度生長的能力。為此，本發(fā)明的熒光假單胞菌表達(dá)系統(tǒng)可以提供大約20克/升或更高的細(xì)胞密度。本發(fā)明的熒光假單胞菌表達(dá)系統(tǒng)還可以提供至少大約70克/升的細(xì)胞密度，其表示成生物量/單位體積，生物量是作為干燥細(xì)胞重量測得的。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，細(xì)胞密度為至少20克/升。在另一具體實(shí)施方案中，細(xì)胞密度為至少25克/升，30克/升，35克/升，40克/升，45克/升，50克/升，60克/升，70克/升，80克/升，90克/升，100克/升，110克/升，120克/升，130克/升，140克/升，或至少150克/升。
在另一具體實(shí)施方案中，誘導(dǎo)時(shí)的細(xì)胞密度為20克/升至150克/升；20克/升至120克/升；20克/升至80克/升；25克/升至80克/升；30克/升至80克/升；35克/升至80克/升；40克/升至80克/升；45克/升至80克/升；50克/升至80克/升；50克/升至75克/升；50克/升至70克/升；40克/升至80克/升。
相關(guān)蛋白質(zhì)或肽的分離通常，該方法與傳統(tǒng)的表達(dá)系統(tǒng)相比，提高了表達(dá)出的正確或恰當(dāng)加工的重組蛋白的量。特別地，本發(fā)明提高了恰當(dāng)加工的重組蛋白的量。
在某些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種改進(jìn)宿主細(xì)胞中重組蛋白或肽的溶度的方法。此處所用的術(shù)語“可溶”是指在生理?xiàng)l件下在緩沖劑中旋轉(zhuǎn)10-30分鐘時(shí)，蛋白質(zhì)在大約5000至20000×重力的離心作用下不沉淀?？扇艿鞍踪|(zhì)不構(gòu)成包含體或其它沉淀物的組成部分。類似地，“不溶”是指在生理?xiàng)l件下在緩沖劑中旋轉(zhuǎn)10-30分鐘時(shí)，蛋白質(zhì)或肽在大約5000至20000×重力的離心作用下沉淀。不溶蛋白質(zhì)或肽可以構(gòu)成包含體或其它沉淀物的組成部分。術(shù)語“包含體”包括細(xì)胞內(nèi)包含的任何細(xì)胞內(nèi)物體，在其中隔出蛋白質(zhì)或肽的聚集體。
本發(fā)明還提高了活性重組蛋白或肽的回收率?？梢酝ㄟ^任何方便的活體外或活體內(nèi)檢定法測量識別出的與母體多肽、多肽變體、片段(segment)取代的多肽和/或殘基取代的多肽之間的相互作用，從而測量活性蛋白質(zhì)含量。因此，可以使用活體外檢定法測定識別出的相關(guān)蛋白質(zhì)和肽之間(例如酶與底物之間、激素與激素受體之間、抗體與抗原之間等)的任何可檢出的相互作用。這種檢測可以包括測量比色變化、放射性變化、溶度變化、分子量變化(通過凝膠電泳和/或凝膠排阻法等測得)?；铙w內(nèi)檢定法包括，但不限于，檢測生理效應(yīng)(例如重量增加、電解質(zhì)平衡變化、凝血時(shí)間變化、血凝塊溶解變化和抗原反應(yīng)的誘導(dǎo))的檢定法。通常，可以使用任何活體內(nèi)檢定法，只要存在可變參數(shù)以檢測識別出的多肽與相關(guān)多肽之間相互作用的變化。參看，例如，美國專利5,834,250。
為了從周質(zhì)中釋放重組蛋白，已經(jīng)使用了包含化學(xué)品(例如氯仿)的處理(Ames等(1984)J.Bacteriol.，1601181-1183)、胍-HCl和TritonX-100(Naglak and Wang(1990)Enzyme Microb.Technol.，12603-611)。然而，這些化學(xué)品非惰性并且可能對許多重組蛋白產(chǎn)品或隨后的提純程序產(chǎn)生有害影響。還提出了大腸桿菌細(xì)胞的甘氨酸處理(其導(dǎo)致外膜的滲透)以釋放周質(zhì)內(nèi)含物(Ariga等(1989)J.Ferm.Bioeng.，68243-246)。最廣泛使用的重組蛋白的周質(zhì)釋放方法是滲壓休克(Nosal and Heppel(1966)J.Biol.Chem.，2413055-3062；Neu andHeppel(1965)J.Biol.Chem.，2403685-3692)、雞蛋清(HEW)-溶菌酶/乙二胺四乙酸(EDTA)處理(Neu and Heppel(1964)J.Biol.Chem.，2393893-3900；Witholt等(1976)Biochim.Biophys.Acta，443534-544；Pierce等(1995)ICheme Research.Event，2995-997)、和結(jié)合的HEW-溶菌酶/滲壓休克處理(French等(1996)Enzyme and Microb.Tech.，19332-338)。French法包括細(xì)胞在分餾緩沖劑中再懸浮，然后回收周質(zhì)餾分，其中滲壓休克之后立即進(jìn)行溶菌酶處理。還論述了重組蛋白，熱紫鏈霉菌α-淀粉酶的過度表達(dá)和宿主有機(jī)體的生長相對回收率的影響。
通常，這些程序包括在滲透性穩(wěn)定培養(yǎng)基中的初始分裂(disruption)，然后在非穩(wěn)定培養(yǎng)基中選擇性釋放。在所述特定程序之間，這些培養(yǎng)基的組成(pH、保護(hù)劑)和所用分裂方法(氯仿、HEW-溶菌酶、EDTA、超聲處理)可以改變。Stabel等(1994)VeterinaryMicrobiol.，38307-314論述了使用兩極離子型去垢劑代替EDTA以改變HEW-溶菌酶/EDTA處理，對于使用細(xì)胞內(nèi)分解酶系統(tǒng)分裂大腸桿菌的概述，參看Dabora和Cooney(1990)在Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology，卷43，A.Fiechter，ed.(Springer-VerlagBerlin)，pp.11-30中。
從細(xì)胞質(zhì)中以可溶蛋白或折射粒子的形式回收重組蛋白的傳統(tǒng)方法包括通過機(jī)械破壞使細(xì)菌細(xì)胞分解。機(jī)械破壞通常包括在液體懸浮液中產(chǎn)生局部空化，用硬珠進(jìn)行迅速攪動(dòng)，或細(xì)胞懸液的研磨(BacterialCell Surface Technique，Hancock and Poxton(John Wiley&Sons Ltd，1988)，第3章，55頁)。
HEW＝溶菌酶起到生物化學(xué)作用以水解細(xì)胞壁的肽葡聚糖骨架。該方法最初是Zinder和Arndt(1956)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，42586-590開發(fā)出的，其用卵清蛋白(其含有HEW-溶菌酶)處理大腸桿菌以制造之后被稱作內(nèi)在質(zhì)球的圓形細(xì)胞球。這些結(jié)構(gòu)保留了一些細(xì)胞壁組分，但是具有大的暴露出細(xì)胞質(zhì)膜的表面積。美國專利5,169,772公開了一種從細(xì)菌中提純肝素酶的方法，包括在滲透穩(wěn)定的培養(yǎng)基(例如20％蔗糖溶液)中使用例如EDTA、溶菌酶或有機(jī)化合物破壞細(xì)菌包膜，通過用低離子強(qiáng)度的緩沖劑處理細(xì)菌來從破裂細(xì)菌的周質(zhì)空間釋放出非肝素酶類的蛋白質(zhì)，并且通過用緩沖鹽溶液處理低離子強(qiáng)度洗滌過的細(xì)菌來釋放肝素酶類的蛋白質(zhì)。
可以在多種表達(dá)系統(tǒng)上以不同的成功程度使用這些方法的許多不同變體(Joseph-Liazun等，(1990)Gene，86291-295；Carter等(1992)Bio/Technology，10163-167)。提出了誘導(dǎo)重組細(xì)胞培養(yǎng)以產(chǎn)生溶菌酶的努力。EP 0 155 189公開了一種誘導(dǎo)重組細(xì)胞培養(yǎng)以產(chǎn)生溶菌酶的方法，其通常被認(rèn)為通過破壞或溶解細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)來殺滅這些宿主細(xì)胞。
美國專利4,595,658公開了一種促進(jìn)輸送到大腸桿菌周質(zhì)空間中的蛋白質(zhì)外化的方法。該方法不需要使用溶菌酶處理、機(jī)械研磨或細(xì)胞的滲壓休克處理就可以選擇性分離位于周質(zhì)中的蛋白質(zhì)。美國專利4,637,980公開了如下制造細(xì)菌產(chǎn)品用直接或間接對產(chǎn)品編碼的DNA分子轉(zhuǎn)化熱敏溶原性細(xì)菌，在許可條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)基因產(chǎn)品，并通過提高溫度誘發(fā)噬菌體編碼功能來使產(chǎn)品外化。Asami等(1997)J.Ferment.and Bioeng.，83511-516公開了通過T4噬菌體傳染進(jìn)行大腸桿菌細(xì)胞的同步破裂，且Tanji等(1998)J.Ferment.andBioeng.，8574-78公開了在T4噬菌體中編碼的溶菌基因的受控表達(dá)以產(chǎn)生大腸桿菌細(xì)胞的溫和破裂。
在細(xì)胞溶菌作用下，染色體組DNA從細(xì)胞質(zhì)滲出到培養(yǎng)基中，并導(dǎo)致流體粘度的明顯提高，這阻礙了離心力場中的固體沉降。在不存在剪切力(例如在機(jī)械破壞以分解DNA聚合物的過程中產(chǎn)生的剪切力)，通過粘性流體的較慢的固體沉降速率越慢會在離心過程中導(dǎo)致固體與液體的較差分離。除了機(jī)械剪切力，存在使DNA聚合物降解的核酸分解酶。在大腸桿菌中，外源基因endA對通常分泌到周質(zhì)中并以內(nèi)切核苷酸方式將DNA裂解成的寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶編碼(成熟蛋白質(zhì)的分子量為大約24.5kD)。已經(jīng)提出，大腸桿菌相對較弱地表達(dá)endA(Wackernagel等(1995)Gene 15455-59)、在一個(gè)具體實(shí)施方案中，不要求附加的二硫鍵助長條件和試劑來從宿主細(xì)胞中回收活性可溶形式的含二硫鍵的識別出的多肽。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因肽、多肽、蛋白質(zhì)或其片段具有激活態(tài)的折疊分子內(nèi)構(gòu)造。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因肽、多肽、蛋白質(zhì)或片段在激活態(tài)下含有至少一個(gè)分子內(nèi)二硫鍵；并且可以含有最多2、4、6、8、10、12、14、16、18或20或更多二硫鍵。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離提純至相當(dāng)純度，包括但不限于硫酸銨或乙醇沉淀、酸萃取、陰離子或陽離子交換色譜法、磷酸纖維素色譜法、疏水作用色譜法、親和色譜法、鎳色譜法、羥磷灰石色譜法、反相色譜法、植物血凝素色譜法、制備電泳法、去垢劑增溶、用這些物質(zhì)進(jìn)行選擇性沉淀作為柱色譜法、免疫純化法和其它方法。例如，具有確定分子粘合性能的蛋白質(zhì)可以可逆融合配體。使用合適的配體，可以將蛋白質(zhì)選擇性吸附到提純柱上，然后以相對純凈的形式從柱中釋放出來。然后通過酶活性去除融合蛋白。此外，可以使用免疫親和柱或Ni-NTA柱提純蛋白質(zhì)。在例如R.Scopes，Protein PurificationPrinciples and Practice，Springer-VerlagN.Y.(1982)；Deutscher，Guide to Protein Purification，Academic Press(1990)；美國專利4,511,503；S.Roe，Protein Purification TechniquesAPractical Approach(Practical Approach Series)，Oxford Press(2001)；D.Bollag等，Protein Methods，Wiley-Lisa，Inc.(1996)；AK Patra等，ProteinExpr Purif，18(2)p/182-92(2000)；和R.Mukhija等，Gene 165(2)p.303-6(1995)中進(jìn)一步描述了通用技術(shù)。還可以參看，例如，Ausubel等(1987和定期增補(bǔ))；Deutscher(1990)“Guide to Protein Purification，”Methods in Enzymology卷182和該系列的其它卷；Coligan等(1996和定期增補(bǔ))Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene，NY；和關(guān)于蛋白質(zhì)提純產(chǎn)品引用的制造商文獻(xiàn)，例如Pharmacia，Piscataway，N.J.，或Bio-Rad，Richmond，Calif。結(jié)合重組技術(shù)可以融合到合適的片段上，例如融合到FLAG序列或可經(jīng)由蛋白酶可去除序列融合的對等物上。參看，例如，Hochuli(1989)Chemische Industrie 1269-70；Hochuli(1990)“Purification of Recombinant Proteins with Metal ChelateAbsorbent”，在Setlow(ed.)Genetic Engineering，Principle and Methods1287-98，Plenum Press，NY中；和Crowe等(1992)QLAexpressTheHigh Level Expression&Protein Purification System QULAGEN，Inc.，Chatsworth，Calif。
表達(dá)蛋白質(zhì)的檢測是通過本領(lǐng)域已知的方法實(shí)現(xiàn)的并且包括，例如，放射性免疫測定、Western印跡技術(shù)或免疫沉淀反應(yīng)。
可以通過許多方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和提純重組制成和表達(dá)的酶，例如如果需要，對于最終提純步驟可以使用高效液相色譜法(HPLC)。
在本發(fā)明中表達(dá)的某些蛋白質(zhì)可以形成不溶聚集體(“包含體”)。對于從包含體中提純蛋白質(zhì)，適合使用幾種方案。例如，包含體提純通常包括通過宿主細(xì)胞的破裂(例如通過在50mM TRIS/HCL pH 7.5，50mM NaCl，5mM MgCl2，1mM DTT，0.1mM ATP，和1mM PMSF的緩沖劑中培養(yǎng))來提取、分離和/或提純包含體。通過French Press 2-3次，從而使細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞溶解。也可以使用Polytron(BrinkmanInstruments)使細(xì)胞懸液均化或在冰上進(jìn)行聲處理。其它溶解細(xì)菌的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的(參看，例如上述Sambrook等；上述Ausubel等)。
如果需要，可以使包含體溶解，并且通常將溶解的細(xì)胞懸液離心分離以去除不需要的不溶物?？梢酝ㄟ^用相容緩沖劑稀釋或滲析來使形成包含體的蛋白質(zhì)復(fù)性(renature)。合適的溶劑包括，但不限于脲(大約4M至大約8M)、甲酰胺(至少大約80％，體積/體積基)，和鹽酸胍(大約4M至大約8M)。盡管鹽酸胍和類似試劑是變性劑，但該變性不是不可逆的，并且在變性劑去除(例如通過滲析)或稀釋時(shí)產(chǎn)生復(fù)性，從而可以重新形成免疫和/或生物活性的蛋白質(zhì)。其它合適的緩沖劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
或者，可以從宿主周質(zhì)中提純重組蛋白質(zhì)或肽。在宿主細(xì)胞溶解后，當(dāng)將重組蛋白輸出到宿主細(xì)胞的周質(zhì)中時(shí)，可以通過冷滲壓休克以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法分離細(xì)菌的周質(zhì)餾分。為了從周質(zhì)中分離重組蛋白，例如，可以離心處理細(xì)菌細(xì)胞以形成丸粒。這些丸?？梢栽诤?0％蔗糖的緩沖劑中重新懸浮。為了溶解細(xì)胞，可以離心處理細(xì)菌并將丸粒重新懸浮在冰冷的5mM MgSO4中并在冰浴中保持大約10分鐘?？梢噪x心處理細(xì)胞懸液并將上清液潷析并保存?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)分離技術(shù)從宿主蛋白質(zhì)中分離上清液中存在的重組蛋白。
初始鹽分分離可以從相關(guān)重組蛋白中分離許多不需要的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(或來自細(xì)胞培養(yǎng)基的蛋白質(zhì))。一個(gè)這樣的例子可以是硫酸銨。硫酸銨通過有效減少蛋白質(zhì)混合物中水的量來使蛋白質(zhì)沉淀。蛋白質(zhì)隨后根據(jù)其溶度沉淀。蛋白質(zhì)越疏水，就越可能在較低的硫酸銨濃度下沉淀。典型的方案包括在蛋白質(zhì)溶液中加入飽和硫酸銨，從而使所得硫酸銨濃度在20-30％之間。該濃度會使多數(shù)疏水蛋白質(zhì)沉淀。然后棄置沉淀物(除非相關(guān)蛋白質(zhì)是疏水的)并在上清液中加入硫酸銨至已知能使相關(guān)蛋白質(zhì)沉淀的濃度。然后使沉淀物溶于緩沖劑并根據(jù)需要通過滲析或透濾法去除過量的鹽。依靠蛋白質(zhì)溶度進(jìn)行的其它方法(例如冷乙醇沉淀法)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并可用于分餾絡(luò)合蛋白質(zhì)混合物。
可以使用透過不同孔徑大小的膜(例如Amicon或Millipore膜)的超濾利用重組蛋白的分子量將其與具有更大或更小尺寸的蛋白質(zhì)分離。作為第一步驟，可以透過下述膜超濾蛋白質(zhì)混合物——該膜的孔徑大小可以截留比相關(guān)蛋白質(zhì)的分子量小的分子量。然后再將超濾的滲余物用下述膜超濾——該膜具有大于相關(guān)蛋白質(zhì)分子量的分子截留。重組蛋白可以透過膜進(jìn)入濾液。然后如下對該濾液進(jìn)行色譜分析。
還可以根據(jù)尺寸、表面凈電荷、疏水性和對配體的親合力將重組蛋白與其它蛋白質(zhì)分離。此外，可以將蛋白質(zhì)的抗體結(jié)合到柱基質(zhì)(column matrices)上并將蛋白質(zhì)免疫提純。所有這些方法都是本領(lǐng)域公知的。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以使用來自許多不同制造商(例如Pharmacia Biotech)以任何規(guī)模進(jìn)行色譜技術(shù)。
實(shí)踐中，通常在培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)導(dǎo)向周質(zhì)的異質(zhì)蛋白質(zhì)(參看歐洲專利EP 0 288 451)，這可能是由于損害或提高了外細(xì)胞膜流動(dòng)性?？梢允褂酶鞣N滲透外細(xì)胞膜的機(jī)制提高該“被動(dòng)”分泌的速率大腸桿菌素(Miksch等(1997)Arch.Microbiol.167143-150)；生長速率(Shokri等，(2002)App Miocrobiol Biotechnol 58386-392)；TolIII過度表達(dá)(Wan和Baneyx(1998)Protein Expression Purif1413-22)；細(xì)菌素釋放蛋白(Hsiung等(1989)Bio/Technology 7267-71)、大腸桿菌素A溶解蛋白(Lloubes等(1993)Biochimie 75451-8)、使周質(zhì)蛋白滲漏的突變體(Furlong和Sundstrom(1989)Developments in Indus.Microbio.30141-8)；融合partner(Jeong和Lee(2002)Appl.Environ.Microbio.684979-4985)；通過滲壓休克回收(Taguchi等(1990)BiochimicaBiophysica Acta 1049278-85)。將工程蛋白運(yùn)送到周質(zhì)空間中，隨后局部定位在培養(yǎng)液中，由此在大腸桿菌中制造恰當(dāng)折疊的活性蛋白質(zhì)(Wan和Baneyx(1998)Protein Expression Purif.1413-22；Simmons等(2002)J.Immun.Meth.263133-147；Lundell等(1990)J.Indust.Microbio.5215-27)。
革蘭氏-印跡細(xì)菌已經(jīng)演化出許多用于穿過雙重膜輸出蛋白質(zhì)的系統(tǒng)(參看圖1)。這些分泌途徑包括，例如用于一步穿過內(nèi)在質(zhì)及外膜易位的ABC(I型)路徑、Path/Fla(III型)路徑和Path/Vir(IV型)路徑；用于穿過質(zhì)膜易位的Sec(II型)、Tat、MscL和Holins路徑；和用于兩步穿過內(nèi)在質(zhì)和外膜易位的Sec-加-fimbrial usher孔蛋白(FUP)、Sec-加-自動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)子(AT)、Sec-加-兩partner分泌(TPS)、Sec-加-主末端分支(MTB)和Tat-加-MTB路徑。并非所有細(xì)菌都具有所有這些分泌路徑。
三種蛋白質(zhì)系統(tǒng)(I、III和IV型)在單個(gè)能量結(jié)合步驟中同時(shí)穿過內(nèi)膜和外膜分泌蛋白質(zhì)。四種系統(tǒng)(Sec、Tat、MscL和Holins)僅穿過內(nèi)膜分泌，另外四個(gè)系統(tǒng)(MTB、FUP、AT和TPS)僅穿過外膜分泌。
使用本發(fā)明的分泌信號或宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)中的蛋白質(zhì)還可以在進(jìn)一步的步驟中主動(dòng)輸出到細(xì)胞外介質(zhì)中。用于主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的已知機(jī)制通常是通過自動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)子、兩partner分泌系統(tǒng)、主末端分支系統(tǒng)或fimbrial usher孔蛋白。
使用本發(fā)明的分泌信號或宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)中的蛋白質(zhì)還可以在進(jìn)一步的步驟中主動(dòng)輸出到細(xì)胞外介質(zhì)中。用于主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的已知機(jī)制通常是通過自動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)子、兩partner分泌系統(tǒng)、主末端分支系統(tǒng)或fimbrial usher孔蛋白。
通過自動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)子(AT)路徑轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)通常含有N-末端Sec-型信號肽、中央通道區(qū)(central passenger domain)和α-區(qū)的C-末端250-300氨基酸殘基。不同自動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)子的α-區(qū)高度同源，而通道區(qū)在序列和尺寸上明顯不同。通過Sec系統(tǒng)和信號肽的裂解穿過內(nèi)膜分泌后，α-區(qū)的低聚物形成外膜孔蛋白，通過該孔蛋白分泌通道區(qū)(Veiga等(2002)EMBO J.，212122-2131)。通道區(qū)或者被釋放到環(huán)境中，或者殘留在細(xì)胞表面上。多數(shù)自動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)子與革蘭氏-陰性病原體的毒性有關(guān)。
兩-partner分泌(TPS)系統(tǒng)在功能上與AT系統(tǒng)類似，盡管蛋白質(zhì)沒有共享序列同源性。TPS系統(tǒng)由兩個(gè)通過相鄰基因編碼的含信號肽的蛋白質(zhì)構(gòu)成。一個(gè)蛋白質(zhì)含有通道區(qū)，另一個(gè)含有α-區(qū)。兩個(gè)蛋白質(zhì)都通過Sec系統(tǒng)分泌到周質(zhì)中，并且?guī)в型ǖ绤^(qū)的蛋白質(zhì)進(jìn)一步通過由帶有α-區(qū)的蛋白質(zhì)形成的外膜孔輸出(Jacob-Dubuisson等(2001)Mal Microbiol.40306-13)。TPS系統(tǒng)的多數(shù)底物蛋白是來自1651至5640氨基酸的大蛋白質(zhì)。盡管它們與N-末端250殘基(其是轉(zhuǎn)運(yùn)子的導(dǎo)向序列)極其相似，但它們的C-末端序列非常不同。
主末端分支(MTB)是使已經(jīng)折疊的蛋白質(zhì)從周質(zhì)轉(zhuǎn)譯到細(xì)胞外介質(zhì)中的大復(fù)合物。該復(fù)合物包含至少10個(gè)蛋白質(zhì)組分，其中一些與4型菌毛生源系統(tǒng)共享序列同源性(Pugsley(1993)Microbiol.Rev.5750-108)。編碼功能MTB系統(tǒng)的基因通常在基因組中形成聚簇。尚未充分理解MTB作用下的蛋白質(zhì)分泌的導(dǎo)向信號和分子機(jī)制。
FUP系統(tǒng)是革蘭氏-陰性變形菌和藍(lán)細(xì)菌中許多纖毛(菌毛)的生物形成原因。為每一傘毛的結(jié)構(gòu)蛋白編碼的操縱子也為傘毛類周質(zhì)伴侶蛋白和傘毛類外膜usher蛋白編碼。所有這些蛋白質(zhì)都可以用Sec-型信號肽合成為前體蛋白。在通過Sec系統(tǒng)穿過內(nèi)膜轉(zhuǎn)移后，將菌毛亞基結(jié)合到伴侶蛋白上，這防止菌毛在周質(zhì)中的自組裝。伴侶蛋白與usher蛋白之間的相互作用釋放出蛋白質(zhì)亞基，其隨后相互作用并通過usher蛋白穿過外膜分泌。
復(fù)性和再折疊可以將不溶蛋白復(fù)性或再折疊以產(chǎn)生二級和三級蛋白質(zhì)構(gòu)象?？梢栽谕瓿芍亟M產(chǎn)品的構(gòu)造時(shí)根據(jù)需要使用蛋白質(zhì)再折疊步驟。可以使用本領(lǐng)域已知的促進(jìn)蛋白質(zhì)離解/結(jié)合的試劑實(shí)現(xiàn)再折疊和復(fù)性。例如，可以用二硫蘇糖醇培養(yǎng)蛋白質(zhì)，然后用氧化谷胱甘肽二鈉鹽培養(yǎng)，然后用含有脲之類的再折疊劑的緩沖劑培養(yǎng)。
還可以如下將重組蛋白復(fù)性例如用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或50mM乙酸鈉pH 6緩沖劑加上200mM NaCl將其滲析?；蛘撸褂煤械鞍酌敢种苿┑脑?00mM NaCl，20％甘油，20mM Tris/HCl pH7.4中的直線6M-1M脲梯度溶液將蛋白質(zhì)固定在柱(例如Ni NTA柱)上，與此同時(shí)將蛋白質(zhì)再折疊。復(fù)性可以進(jìn)行1.5小時(shí)或更久。復(fù)性之后，加入250mM咪唑來洗脫蛋白質(zhì)。通過用PBS或50mM乙酸鈉pH6緩沖劑加上200mM NaCl進(jìn)行的最終滲析步驟去除咪唑。將提純的蛋白質(zhì)儲存在4℃下或冰凍在-80℃下。
其它方法包括，例如，MH Lee等，Protein Expr.Purif.，25(1)p.166-73(2002)，W.K.Cho等，J.Biotechnology，77(2-3)p 169-78(2000)，Ausubel等(1987和定期增補(bǔ))，Deutscher(1990)“Guide to ProteinPurification，”Methods in Enzymology卷182和該系列的其它卷；Coligan等(1996和定期增補(bǔ))Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene，NY，S.Roe，Protein Purification TechniquesA Practical Approach(Practical Approach Series)，Oxford Press(2001)；D.Bollag等，ProteinMethods，Wiley-Lisa，Inc.(1996)中描述的那些。
活性蛋白或肽分析活性蛋白可以具有作為序列來源的天然蛋白質(zhì)或肽的至少20％，30％或40％，且優(yōu)選至少50％，60％或70％，且最優(yōu)選至少80％，90％或95％的比活性。此外，底物特異性(Kcat/Km)任選大致類似于天然蛋白質(zhì)或肽。通常，Kcat/Km是天然蛋白或肽的至少30％，40％或50％；并優(yōu)選至少60％，70％，80％或90％。蛋白質(zhì)和肽活性以及底物特異性(Kcat/Km)的檢定和定量測量方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
按照本發(fā)明制成的重組蛋白或肽的活性可以通過本領(lǐng)域已知的任何蛋白質(zhì)特定傳統(tǒng)或標(biāo)準(zhǔn)活體外或活體內(nèi)檢定法測量?？梢詫⒓賳伟置诔傻闹亟M蛋白或肽的活性與相應(yīng)原始蛋白質(zhì)的活性進(jìn)行比較以測定重組蛋白是否表現(xiàn)出與通常在相同或類似的生理?xiàng)l件下在原始蛋白或肽中觀察到的活性大致類似或相當(dāng)?shù)幕钚浴?br> 可以將重組蛋白的活性與之前確立的天然蛋白質(zhì)或肽的標(biāo)準(zhǔn)活性進(jìn)行比較。或者，可以在與天然蛋白質(zhì)或肽的同時(shí)或大致同時(shí)的對比檢定法中測定重組蛋白質(zhì)或肽的活性。例如，可以使用活體外檢定法測定重組蛋白質(zhì)或肽與目標(biāo)之間(例如表達(dá)酶與底物之間、表達(dá)激素與激素受體之間、表達(dá)抗體與抗原之間等)的任何可檢出的相互作用。這種檢測可以包括測量比色變化、增殖變化、細(xì)胞死亡、細(xì)胞排斥、放射性變化、溶度變化、分子量變化(通過凝膠電泳和/或凝膠排阻法等測得)、磷酸化能力，抗體特異性檢定法(例如ELISA檢定法)等等。此外，活體內(nèi)檢定法包括，但不限于，與天然蛋白質(zhì)或肽的生理效應(yīng)比較起來檢測假單胞菌制成的蛋白質(zhì)或肽的生理效應(yīng)(例如重量增加、電解質(zhì)平衡變化、凝血時(shí)間變化、血凝塊溶解變化和抗原反應(yīng)的誘導(dǎo))的檢定法。通常，可以使用任何可與天然蛋白質(zhì)或肽進(jìn)行對比分析的活體外或活體內(nèi)檢定法來測定假單胞菌制成的重組蛋白或肽的活性，只要這種活性是可檢定的?；蛘撸梢詸z定本發(fā)明中制成的蛋白質(zhì)或肽的刺激或抑制蛋白質(zhì)或肽與下述分子之間的相互作用的能力——該分子通常會與蛋白質(zhì)或肽相互作用，例如，通常與原始蛋白質(zhì)相互作用的信號路徑的底物或組分。這些檢定法通常包括在允許蛋白質(zhì)或肽與目標(biāo)分子相互作用的條件下將蛋白質(zhì)與底物分子結(jié)合的步驟，并且檢測出與蛋白質(zhì)和目標(biāo)分子相互作用的生物化學(xué)后果。
在下列文獻(xiàn)中描述了可用于測定蛋白質(zhì)或肽活性的檢定法Ralph，P.J.，等(1984)J.Immunol.1321858或Saiki等(1981)J.Immunol.1271044，Steward，W.B.II(1980)The Interferon Systerms.Springer-Verlag，Vienna and New York，Broxmeyer，H.E.，等(1982)Blood 60595，“Molecular CloningA Laboratory Manual”，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis eds，1989，以及“Methods in EnzymologyGuide to Molecular Cloning Techniques”，Academic Press，Berger，S.L.和A.R.Kimmel eds.，1987，AK Patra等，Protein Expr Purif，18(2)p/182-92(2000)，Kodama等，J.Biochem.991465-1472(1986)；Stewart等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA905209-5213(1993)；(Lombillo等，J.Cell Biol.128107-115(1995)；(Vale等，Cell 4239-50(1985))相關(guān)蛋白質(zhì)宿主細(xì)胞可以設(shè)計(jì)成表達(dá)重組蛋白質(zhì)或肽。這些可以具有任何類型和任何尺寸。然而，在某些具體實(shí)施方案中，重組蛋白或肽是治療上有效的蛋白質(zhì)或肽。在一些具體實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)可以是哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)，例如人類蛋白質(zhì)，并且可以是例如，生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子或血蛋白。重組蛋白或肽可以按照類似方法加工成天然蛋白或肽。在某些具體實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)或肽在編碼序列中不包括分泌信號。在某些具體實(shí)施方案中，重組蛋白或肽在尺寸上低于100kD，低于50kD，或低于30kD。在某些具體實(shí)施方案中，重組蛋白或肽是至少5，10，15，20，30，40，50或100個(gè)氨基酸的肽。
可以廣泛地公開獲得分子遺傳學(xué)和遺傳工程技術(shù)所需的詳盡的序號信息。哺乳動(dòng)物以及人類的完整核苷酸序列、基因、cDNA序列、氨基酸序列和基因組的獲得方法可獲自GenBank，URL地址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez。附加信息還可獲自GeneCards，來自WeizmannInstitute of Science Genome and BioinfOrnatics(http://bioinfOrnatics.weizmann.ac.il/cards/)的關(guān)于基因及其產(chǎn)品以及生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的電子百科全書集成信息，核苷酸序列信息還可獲自EMBL核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(http://www.ebi.ac.uk/embl/)或DNA數(shù)據(jù)庫或Japan(DDBJ，http://www.ddbj.nig.ac.jp/)；氨基酸序列的信息的其它站點(diǎn)包括Georgetown的蛋白質(zhì)信息資源網(wǎng)站(http://www-nbrf.georgetown.edu/pir/)和Swiss-Prot(http://au.expasy.org/sprot/sprot-top.html)。
可以在本發(fā)明中表達(dá)的蛋白質(zhì)的例子包括如下分子，例如腎素、生長激素，包括人類生長激素；?？粕L激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激索；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；胰島素原；血栓形成素；促卵胞成熟激素；降血鈣素；促黃體生成激素；胰高血糖素；凝血因子，例如第VIIIC因子、克雷斯馬斯因子(factor IX)、組織因子、和von Willebrands因子；抗凝血因子，例如蛋白質(zhì)C；atrial naturietic因子；肺表面活性物質(zhì)；纖溶酶原激活物，例如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA)的；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和-β；腦啡肽酶；血清白蛋白，例如人血清白蛋白；米勒管抑制物質(zhì)(mullerian-inhibitingsubstance)；松弛素A-鏈；松弛素B-鏈；prorelaxin；鼠促性腺激素相關(guān)肽；微生物蛋白質(zhì)，例如β-內(nèi)酰胺酶；脫氧核糖核酸酶；抑制素；苯丙酸諾龍；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)；激素或生長因子的受體；整聯(lián)蛋白；蛋白A或D；類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)因子，例如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)素-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)、或諸如NCF-β的神經(jīng)生長因子；心臟營養(yǎng)素(心臟肥大因子)，例如心臟營養(yǎng)素-1(CT-1)；血小板源生長因子(PDGF)；成纖維細(xì)胞生長因子，例如aFGF和bFGF；表皮生長因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1；TGF-β2；TGF-β3；TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦ICF-1)、胰島素樣生長因子；I和II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-1)，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白；CD蛋白質(zhì)，例如CD-3、CD-4、CD-8、CD-19；促紅細(xì)胞生成素；osteoinductive factors；免疫毒素；骨形態(tài)生成蛋白(BMP)；干擾素，例如干擾素-α、-β、和-γ；菌落刺激因子(CSFs)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白細(xì)胞介素(ILs)，例如IL-1至IL-10；抗-HER-2抗體；超氧化物歧化酶；T細(xì)胞受體；表面膜蛋白質(zhì)；促衰變因子；病毒抗原，例如AIDS包膜的一部分；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；homing受體；粘附分子(addressins)；調(diào)節(jié)蛋白；抗體；和上列多肽的任一種的片段。
在某些具體實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)或肽可以選自IL-1、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-12elasti、IL-13、IL-15、、IL-16、IL-18、IL-18BPa、IL-23、IL-24、VIP、促紅細(xì)胞生成素、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、血小板源生長因子(PDGF)、MSF、FLT-3配體、BGF、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF；例如，αFGF(FGF-1)、βFGF(FGF-2)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6或FGF-7)、胰島素樣生長因子(例如，IGF-1、IGF-2)；腫瘤壞死因子(例如，TNF、淋巴細(xì)胞毒素)、神經(jīng)生長因子(例如，NGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)；干擾素(例如，IFN-α、IFN-β、IFN-γ)；白血病抑制因子(LIF)；睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)；制瘤素M；干細(xì)胞因子(SCF)；轉(zhuǎn)化生長因子(例如，TGF-α、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)；TNF總科(例如，LIGHT/TNFSF14、STALL-1/TNFSF13B(BLy5、BAFF、THANK)、TNFα/TNFSF2和TWEAK/INFSF12)；或趨化激素(chemokines)(BCA-1/BLC-1、BRAK/Kec、CXCL16、CXCR3、ENA-78/LIXEotaxin-2/MPIF-2、Exodus-2/SLC、Fractalkine/Neurotactin、GROα/MGSA、HCC-1、I-TAC、Lymphotactin/ATAC/SCM、MCP-1/MCAF、MCP-3、MCP-4、MDC/STCP-1/ABCD-1、MIP-1□、MIP-1□、MIP-2□/GRO□、MIP-3□/Exodus/LARC、MIP-3/Exodus-3/ELC、MIP-4/PARC/DC-CK1、PF-4、RANTES、SDF1、TARC、或TECK)。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了通過假單胞菌屬宿主細(xì)胞制造重組多亞基蛋白質(zhì)?？杀磉_(dá)的多亞基蛋白質(zhì)包括同數(shù)和異數(shù)(homomeric和heteromeric)蛋白質(zhì)。多亞基蛋白質(zhì)可以包括兩個(gè)或多個(gè)可以相同或不同的亞基。例如，蛋白質(zhì)可以是含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多亞基的同數(shù)蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)還可以是含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多亞基的異數(shù)蛋白質(zhì)。示例性的多亞基蛋白質(zhì)包括包括離子通道受體的受體；包括軟骨素的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)；膠原；包括MHC蛋白質(zhì)、全鏈抗體和抗體片段的免疫調(diào)節(jié)劑；包括RNA聚合酶、DNA聚合酶的酶；和膜蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了通過宿主細(xì)胞制造血蛋白。該具體實(shí)施方案中表達(dá)的血蛋白包括，但不限于主要在哺乳動(dòng)物的血液中發(fā)現(xiàn)的載體蛋白，例如白蛋白(包括人血清蛋白和牛白蛋白)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、重組轉(zhuǎn)運(yùn)半分子(transferrin half-molecules)、結(jié)合珠蛋白、纖維蛋白原和其它抗血友病因子、補(bǔ)體成分、免疫球蛋白、酶抑制劑、諸如血管緊張素和血管舒緩激肽的物質(zhì)的前體、胰島素、內(nèi)皮縮血管肽、和球蛋白(包括α、β、γ-球蛋白)，以及其它類型的prote ins、肽及其片段。已經(jīng)提出了許多血蛋白的氨基酸序列(參看，S.S.Baldwin(1993)Comp.Biochem Physiol.106b203-218)，包括人類血清白蛋白的氨基酸序列(Lawn，L.M.，等(1981)Nucleic Acids Research，96103-6114)和人類血清血蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白的氨基序列(Yang，F(xiàn).等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 812752-2756)。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了通過熒光假單胞菌屬的宿主細(xì)胞制造重組酶或輔因子。在該具體實(shí)施方案中表達(dá)的酶和輔因子包括但不限于醛縮酶、胺氧化酶、氨基酸氧化酶、天門冬氨酸酶、B12依賴酶、羧肽酶、carboxyesterase、carboxylyases、chemotrypsin、CoA所需酶、氰醇合成酶、cystathione synthases、脫羧酶、脫氫酶、醇脫氫酶、脫水酶、心肌黃酶、加雙氧酶、enoate reductases、epoxidehydrases、fumerases、半乳糖氧化酶、葡萄糖異構(gòu)酶、葡糖氧化酶、glycosyltrasferases、甲基轉(zhuǎn)移酶、腈水化酶、核苷磷酸化酶、氧化還原酶、oxynitilases、肽酶、glycosyltrasferase、過氧化物酶、稠合到具有治療活性的多肽上的酶、組織纖溶酶原激活物、蛇毒凝血酶、鏈激酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶；脫氧核糖核酸酶、氨基酸水解酶(例如，天門冬酰胺酶、氨基水解酶)；羧肽酶；蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、膠原酶；神經(jīng)氨酸酶；乳糖酶、麥芽糖酶、蔗糖酶、和阿拉伯呋喃糖酶。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了通過熒光假單胞菌屬的宿主細(xì)胞制造重組單鏈、Fab片段和/或全鏈抗體或它們的片段或部分。單鏈抗體可以包括在穩(wěn)定折疊的多肽單鏈上的抗體的抗原結(jié)合區(qū)域。Fab片段可以是一段特定的抗體。Fab片段可以含有抗原結(jié)合位點(diǎn)。Fab片段可以含有2條鏈輕鏈和重鏈片段。這些片段可以通過連接鍵或二硫鍵連接。
重組蛋白或肽的編碼序列可以是目標(biāo)多肽的內(nèi)在編碼序列(如果可以得到的話)，但是更優(yōu)選是經(jīng)過選擇、改進(jìn)或最優(yōu)化以用于宿主細(xì)胞的選定表達(dá)的編碼序列例如通過合成基因以反應(yīng)假單胞菌類型(例如熒光假單胞菌)的密碼子使用偏性。在一個(gè)或多個(gè)載體內(nèi)構(gòu)造所得基因，或?qū)⑺没虿迦胍粋€(gè)或多個(gè)載體內(nèi)，然后將載體轉(zhuǎn)化成表達(dá)宿主細(xì)胞。被稱作以“可表達(dá)形式”提供的核酸或多核苷酸是指含有至少一個(gè)可通過所選細(xì)菌表達(dá)宿主細(xì)胞表達(dá)的基因的核酸或多核苷酸。
在某些具體實(shí)施方案中，相關(guān)蛋白質(zhì)是天然蛋白質(zhì)(例如天然哺乳動(dòng)物或人類蛋白質(zhì))，或與其基本同源。在這些具體實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)未發(fā)現(xiàn)具有串聯(lián)體(concatameric)形式，而是僅連接到分泌信號上并任選連接到用于提純和/或識別的標(biāo)記序列上。
在其它具體實(shí)施方案中，相關(guān)蛋白質(zhì)是在大約20至大約42℃具有活性的蛋白質(zhì)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)在生理溫度具有活性并且在加熱至高溫或極端溫度(例如超過65℃)時(shí)失活。
在其它具體實(shí)施方案中，相關(guān)蛋白質(zhì)是在大約20至大約42℃具有活性和/或在加熱至高溫或極端溫度(例如超過65℃)時(shí)失活的蛋白質(zhì)；其是天然蛋白質(zhì)(例如天然哺乳動(dòng)物或人類蛋白質(zhì))，或與其基本同源，并且不以串聯(lián)體形式從核酸中表達(dá)；而且啟動(dòng)子不是熒光假單胞菌中的內(nèi)在啟動(dòng)子，而是來自另一有機(jī)體，例如大腸桿菌。
在其它具體實(shí)施方案中，制成的蛋白質(zhì)還包括附加的導(dǎo)向序列，例如將蛋白質(zhì)導(dǎo)向細(xì)胞外介質(zhì)的序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，附加的導(dǎo)向序列可連接到蛋白質(zhì)的羧基末端上。在另一具體實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)包括自動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)子的分泌信號、兩partner分泌系統(tǒng)、主末端分支系統(tǒng)或fimbrial usher孔蛋白。
實(shí)施例實(shí)施例1.Sec-分泌信號肽的表征通過大腸桿菌堿性磷酸酶(phoA)編碼序列-染色體組DNA融合體的形成和表達(dá)來表征熒光假單胞菌Sec-系統(tǒng)分泌信號肽。進(jìn)一步表征六個(gè)表達(dá)的融合體的特性。
用SPScan程序(Menne等(2000)BioinfOrnatics 16741-742)與來自其它假單胞菌的同源蛋白進(jìn)行比較，從而推導(dǎo)出被確認(rèn)為PhoA融合體的分泌基因的信號序列的裂解位點(diǎn)。通過與信號肽酶II基序進(jìn)行比較推導(dǎo)出putative脂蛋白的裂解位點(diǎn)；信號肽II特定裂解脂蛋白的信號序列。使用SignalP(用于分析putative信號肽的軟件程序；獲自Centerfor Biological Sequence Analysis of the Technical University of Denmark，在http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。還參看H Nielson等(1997)Protein Engineering 101-6。在有些情況下，使用增補(bǔ)來源進(jìn)一步表征信號肽的特性。在pbp的情況下，通過加工過的融合蛋白的MALDI-TOF分析(參看下面的實(shí)施例5)獲得裂解信息。該信息列在表6中。

PhoA融合蛋白的Western分析為了分析是否制成了融合蛋白，在培養(yǎng)物(其通過離心分離到全細(xì)胞餾分(細(xì)胞質(zhì)和周質(zhì))和無細(xì)胞培養(yǎng)液餾分中)上用抗體對堿性磷酸酶進(jìn)行Western分析。在五個(gè)菌株(對其測定插入位點(diǎn))中，四個(gè)信號序列(Putative天青蛋白、Putative磷酸鹽結(jié)合蛋白、Putative周質(zhì)脂蛋白B、Putative Fe(III)結(jié)合蛋白)產(chǎn)生了具有預(yù)定尺寸的融合蛋白，一個(gè)(Putative oprE蛋白)產(chǎn)生了比預(yù)定尺寸小大約40kD的蛋白質(zhì)，一個(gè)(Putative Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白)產(chǎn)生了比預(yù)定尺寸小大約20kD的蛋白質(zhì)。Western分析和PhoA活性分析表明信號序列將異質(zhì)PhoA蛋白質(zhì)輸送到熒光假單胞菌的周質(zhì)中。
實(shí)施例2.pbp-scFv融合體的構(gòu)造、表達(dá)和表征將磷酸鹽結(jié)合蛋白(也就是包括Met1)的Putative 24氨基酸信號序列融合到gal2 scFv基因(gal2)上以產(chǎn)生SEQ ID Nos15和16(見表)并測試分泌到周質(zhì)中和/或培養(yǎng)上清液中的情況。如下所述構(gòu)造融合體。
磷酸鹽結(jié)合蛋白分泌前導(dǎo)-gal2-His標(biāo)記融合體


磷酸鹽結(jié)合蛋白分泌前導(dǎo)-gal2-His標(biāo)記融合體核酸序列(SEQ ID NO15)氨基酸序列(SEQ ID NO16)pbp-scFv載體的構(gòu)造通過重疊延伸法(SOE)PCR使用拼接將熒光假單胞菌oprF和磷酸鹽結(jié)合蛋白(pbp)putative信號序列在+2位置融合到部分Gal2編碼序列上。使用熒光假單胞菌pbp分泌信號肽作模板，使用引物sig_pbp_for(gctctagagg aggtaactta tgaaactgaa acg；SEQID NO17)和pbp_gal2SO_rev(ctgcacctgg gcggccaccg cgtt；SEQ IDNO18)(包括pbp_gal2SOE_for(aacgcggtgg ccgcccaggt gcag；SEQ IDNO19))進(jìn)行PCR。這產(chǎn)生含有pbp信號肽編碼序列和gal2單鏈抗體(scAb或scFv)的5’末端的編碼序列的寡核苷酸片段。
還擴(kuò)增gal2ORF。使用引物pbp_gal2SOE_for(SEQ ID NO19)和scFv2rev(acgcgtcgac ttattaatgg tgatgatggt gatgtgcggc cgcacgtttg atc；SEQID NO20)并使用gal2-編碼多核苷酸作模板進(jìn)行PCR。這產(chǎn)生含有pbp信號肽的3’末端編碼序列和gal2的開放讀碼框(ORF)的多核苷酸片段。
將信號序列的指定-1氨基酸(提出的裂解位點(diǎn)前面的最后一個(gè)氨基酸)融合到gal2scFv(Ala)的+2氨基酸上。該融合體與磷酸鹽結(jié)合蛋白信號肽的匹配之處在于緊隨重組信號肽酶裂解位點(diǎn)的氨基酸(+1)是Ala，正如活性pbp蛋白中相應(yīng)的氨基酸殘基那樣。
在Ptac啟動(dòng)子的控制下將所得融合體克隆到熒光假單胞菌載體Pmyc1803中以產(chǎn)生質(zhì)粒Pdow1123(pbp:gal2)。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成攜帶質(zhì)粒pCN51-lacI(包括lac阻遏物)的熒光假單胞菌菌株MB101，產(chǎn)生菌株DC217。還將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成大腸桿菌菌株JM109。
用于在大腸桿菌中分泌的ScFv無性系的構(gòu)造將gal2 ORF結(jié)合到pET2b(+)上，從而使pelB信號序列在Gal2的+2位置融合到丙氨酸殘基上。將正確的無性系轉(zhuǎn)化成BL21(DE3)Gold(stratagene)以用于表達(dá)分析。
比較熒光假單胞菌與大腸桿菌中的Gal2 scFv分泌如上所述，將用于大腸桿菌表達(dá)/分泌的pelB分泌信號與兩個(gè)putative熒光假單胞菌分泌信號一起在+2位置融合到gal2開放讀碼框上，也就是去除融合體中的Gal2的N-末端蛋氨酸并替換成指定的信號序列(圖2)。測試外膜孔蛋白F(oprF)和磷酸鹽結(jié)合蛋白(pbp)信號序列將異質(zhì)蛋白分泌到周質(zhì)中和/或培養(yǎng)基中的能力。據(jù)發(fā)現(xiàn)，在20升規(guī)模的熒光假單胞菌中表達(dá)和加工了OprF和pbp前導(dǎo)序列構(gòu)造。這兩種構(gòu)造都產(chǎn)生大約9-10克/升蛋白質(zhì)，它們大部分被發(fā)現(xiàn)在不溶餾分中(圖3B)。大約50％的oprF信號序列被加工，而大約100％的pbp信號被加工(圖3A和3B)。
此外，來自pbp:gal2融合體的少量(＜1％)加工過的Gal2表現(xiàn)出已經(jīng)分泌到培養(yǎng)基中(圖3B)。與oprF信號序列類似，pelB信號序列表現(xiàn)出確實(shí)被加工過(圖4)。在大腸桿菌中表達(dá)的pelB-gal2融合體產(chǎn)生大約1.6克/升的蛋白質(zhì)，其大約54％被加工過的。其中，11％被發(fā)現(xiàn)在可溶餾分中。盡管與熒光假單胞菌pbp:gal2構(gòu)造相比，對于大腸桿菌構(gòu)造，蛋白質(zhì)總量中有更大的比率被發(fā)現(xiàn)在可溶餾分中，但是在熒光假單胞菌中加工過的蛋白質(zhì)的總收率明顯更高。

ScFv活性的分析進(jìn)行酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)以測量純化Gal13和Gal2抗-β-半乳糖苷酶scFv的活性。在涂有β-半乳糖苷酶的微板孔中加入不同量的純化scFv。使用與堿性磷酸酶共軛的抗-His標(biāo)記抗體和抗-mouse抗體檢測結(jié)合抗體(圖5A)。使用抗β-半乳糖苷酶的兔子多克隆抗體作為正對照物。如圖6B所示，從小規(guī)模表達(dá)實(shí)驗(yàn)中提純的Gal2抗體表現(xiàn)出明顯的活性。這些結(jié)果表明來自包含體(Gal2)的分離的可復(fù)性活性抗體。
實(shí)施例3比較大腸桿菌與熒光假單胞菌中的抗-地高辛scFv的分泌將抗-地高辛scFv克隆到pET27d載體中以在大腸桿菌中進(jìn)行分泌表達(dá)。將抗-地高辛scFv轉(zhuǎn)譯融合到pelB前導(dǎo)物(leader)上，產(chǎn)生pDOW1153。在熒光假單胞菌中，將抗-地高辛scFv轉(zhuǎn)譯融合到磷酸鹽結(jié)合蛋白分泌信號序列上，產(chǎn)生pDOW1142。SDS-PAGE(圖6)和Western分析(圖7)表明在熒光假單胞菌和大腸桿菌中表達(dá)的抗-地高辛scFv都不可溶。大腸桿菌無性系在3小時(shí)誘導(dǎo)后產(chǎn)生60微克/毫升的蛋白質(zhì)，且pelB分泌前導(dǎo)物沒有表現(xiàn)出被加工。熒光假單胞菌無性系pDOW1142產(chǎn)生比pDOW1153多大約20倍的蛋白質(zhì)，其中表達(dá)的蛋白質(zhì)為1.23毫克/毫升(通過與BSA標(biāo)準(zhǔn)比較時(shí)SDS-PAGE的光密度分析法測得)(圖8)。通過光密度分析法以20升規(guī)模測定時(shí)，攜帶pDOW1142的熒光假單胞菌進(jìn)行的抗-地黃辛scFv表達(dá)為大約15-20克/升(數(shù)據(jù)未顯示)。如在振蕩培養(yǎng)瓶規(guī)模下觀察的那樣，所有蛋白質(zhì)似乎都被恰當(dāng)?shù)丶庸ぁ?br> 純化抗-地高辛scFv活性的分析。從熒光假單胞菌和大腸桿菌結(jié)構(gòu)中提純抗-地高辛scFv。使用酶聯(lián)免疫吸附檢定法(ELISA)評估活性。如圖9所示，從攜帶分泌結(jié)構(gòu)pDOW1142的熒光假單胞菌中分離出的抗-地高辛scFv被發(fā)現(xiàn)如多克隆抗體對照物一樣是活性的。然而，大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)pDOW1152被發(fā)現(xiàn)含有活性抗-地高辛scFv，而從攜帶分泌的抗-地高辛scFv結(jié)構(gòu)pDOW1153的大腸桿菌中提純的蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)無活性并且大量未被加工(圖10)。
這些結(jié)果表明，熒光假單胞菌產(chǎn)生比大腸桿菌分泌的結(jié)構(gòu)多19倍的蛋白質(zhì)。此外，在大腸桿菌結(jié)構(gòu)中使用的pelB分泌信號不如在熒光假單胞菌中的磷酸鹽結(jié)合蛋白分泌信號那樣被有效地加工。蛋白質(zhì)在熒光假單胞菌和大腸桿菌中都幾乎完全不溶。然而，純化的熒光假單胞菌分泌的蛋白質(zhì)與純化的大腸桿菌胞漿蛋白質(zhì)一起被發(fā)現(xiàn)是活性的。
實(shí)施例4.用于pbp:gal2的表征的MALDI-TOF分析使用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析來表征分泌的成熟蛋白質(zhì)pbp:gal2的氨基酸組成以證實(shí)已經(jīng)在pbp信號肽的putative信號肽酶裂解位點(diǎn)產(chǎn)生putative信號肽酶裂解。對于該分析，對于pbp:gal2獲得肽質(zhì)量指紋譜，并且將這些數(shù)據(jù)與推導(dǎo)氨基酸序列的理論肽質(zhì)量指紋譜進(jìn)行比較。為了產(chǎn)生這些肽質(zhì)量指紋譜，用endoproteinase Lys-C消化蛋白質(zhì)，并且測定所得肽的質(zhì)量。通過源后衰減(MALDI-PSD)測定N-末端肽序列。沒有觀察到與未加工的蛋白質(zhì)對應(yīng)的肽質(zhì)量。結(jié)果與預(yù)期的相同(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例5pbp-hGH融合體的構(gòu)造、表達(dá)和表征將熒光假單胞菌磷酸鹽結(jié)合蛋白分泌前導(dǎo)物融合到人類生長激素(hGH)基因的成熟區(qū)域的N-末端并測試其分泌到周質(zhì)中的情況。使用sig_pbp_for(SEQ ID NO17)和pbp_hgh(gggaatggttgggaaggcca ccgcgttggc；SEQ ID NO21)引物，從作為模板的熒光假單胞菌pbp信號序列的無性系中PCR擴(kuò)增pbp信號序列編碼區(qū)，然后進(jìn)行凝膠提純。這產(chǎn)生含有pbp信號肽編碼序列和hGH的成熟區(qū)域的5’末端的編碼序列的寡核苷酸片段。
使用引物ELVIfor(agagaactag taaaaaggag aaatccatgg ctacaggctcccggacgtcc；SEQ ID NO22)和ELVIrev(agagactcga gtcattagaa gccacagctgccctccac；SEQ ID NO23)，從人類垂體cDNA庫(Clontech，Palo AltoCA)中PCR-擴(kuò)增人類生長激素的編碼cDNA，它們被設(shè)計(jì)成僅擴(kuò)增hGH的成熟區(qū)域，并且克隆到pMYC1803/SpeI XhoI中，形成pDOW2400。使用引物pbp_hgh_revcomp(gccaacgcgg tggccttcccaaccattccc；SEQ ID NO24)和hgh_rev(agagactcga gtcattagaa gccacagctgccctccacag agcggcac；SEQ ID NO25)從pDOW2400中擴(kuò)增成熟的hGH基因，然后用Strataprep柱(Stratagene)提純以去除引物和其它反應(yīng)組分。為了制造pbp-hGH融合體的編碼多核苷酸，將兩個(gè)PCR反應(yīng)結(jié)合并再用sig_pbp_for(SEQ ID NO17)和hgh_rev(SEQ ID NO25)擴(kuò)增以連接這兩段。將該片段結(jié)合到pDOW1269上以形成pDOW1323-10，使pbp-hGH處于tac啟動(dòng)子的控制下。將ligation mix轉(zhuǎn)化到熒光假單胞菌中。該融合體的DNA和氨基酸序列分別表現(xiàn)在(SEQ ID NO26)和(SEQ ID NO27)中。
磷酸鹽結(jié)合蛋白分泌前導(dǎo)物-人類生長激素融合核酸序列(SEQID NO26)

磷酸鹽結(jié)合蛋白分泌前導(dǎo)物-人類生長激素融合核酸序列(SEQID NO26)氨基酸序列(SEQ ID NO27)首先以振蕩培養(yǎng)瓶規(guī)模測試所得菌株。通過SDS-PAGE檢測加工過和未加工的蛋白質(zhì)的預(yù)計(jì)尺寸(分別是22.2kDa和24.5kDa)誘導(dǎo)帶。大約一半的蛋白質(zhì)被加工過(表明定向到周質(zhì)中)，在加工過的蛋白中，大約一半在可溶餾分中，一半在不溶餾分中(數(shù)據(jù)未顯示)。表達(dá)研究的規(guī)模最高為20升生物反應(yīng)器。Coomassie-染色的SDS-PAGE凝膠的光密度分析發(fā)表明所得hGH總量的18％被加工過并可溶。菌株產(chǎn)生3.2克/升所有形式的hGH；加工過和可溶的hGH為0.6克/升。
實(shí)施例6熒光假單胞菌中的Skp伴侶蛋白表達(dá)在熒光假單胞菌中表達(dá)具有內(nèi)在前導(dǎo)序列的大腸桿菌Skp蛋白質(zhì)(圖10)。在生長24小時(shí)后，加入5mM安息香酸鹽誘導(dǎo)Skp(在PCT公開WO 04/005221中描述了安息香酸鹽啟動(dòng)子)。在誘導(dǎo)12小時(shí)后，通過在20,000克的離心處理將誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的樣品分離入可溶和不溶餾分。使用MES緩沖劑在4-12％NuPAGE上分離蛋白質(zhì)。僅在誘導(dǎo)的可溶樣品中在大約17kDa的分子量觀察到大腸桿菌Skp蛋白質(zhì)(由圖10中的箭頭表示)。
通過MALDI源后衰減(PSD)將蛋白質(zhì)識別為Skp。制備切離17kDa蛋白質(zhì)帶的胰凝乳蛋白酶消化液。觀察兩個(gè)胰凝乳蛋白酶片段，它們與由Skp的理論消化液預(yù)測的尺寸匹配(表8)進(jìn)一步通過MALDI-PSD分析具有1378.7m/z的離子質(zhì)量的putative N-末端肽，其顯示出ADKIAIVNMGSLF的預(yù)計(jì)N-末端氨基酸序列，表明已經(jīng)按照預(yù)期去除了前導(dǎo)序列，相當(dāng)于Ala20與Ala21之間的加工位點(diǎn)(圖11)。

*通過MALDI-PSD進(jìn)一步分析該片段。
實(shí)施例7在大腸桿菌中的熒光假單胞菌信號序列表達(dá)來自熒光假單胞菌的信號序列在大腸桿菌中起作用，可以使pbp:Gal2蛋白質(zhì)被加工并分泌到周質(zhì)中。
用pDOW1123(pbp:gal2融合)或pDOW1141(oprF:gal2融合)轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109(Promega)。用編碼為pbp:gal2的pDOW1123轉(zhuǎn)化的JM109表明，在37℃生長時(shí)用0.4mM和0.01mM IPTG誘導(dǎo)時(shí)的Gal2蛋白質(zhì)的表達(dá)(圖12)。用0.01mM IPTG誘導(dǎo)的培養(yǎng)物表現(xiàn)出與正對照物(在熒光假單胞菌中表達(dá)的DC265，pbp:gal2)相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)。
在圖12中在28kDa區(qū)域中看到的兩條帶代表信號序列的細(xì)菌加工(裂解)之前和之后的Gal2。通過SDS-PAGE在不溶餾分中觀察到這兩個(gè)帶，并且與通過DC245制成的加工過和未加工的Gal2共遷移(圖13)。通過MALDI-PSD確定每個(gè)帶的N-末端序列，從而證實(shí)下方帶是Gal2并如預(yù)期被加工(FPTIPLSRPF)。上方帶含有未加工的Gal2的序列。在SDS-PAGE凝膠上，周質(zhì)樣品顯示出在尺寸上與加工過的Gal2一致的帶(圖14)。
在用0.01mM IPTG誘導(dǎo)并在37℃生長的JM109/pDOW1123樣品的可溶、不溶和周質(zhì)餾分上進(jìn)行Western印跡法。結(jié)果表明在所有三個(gè)餾分中都發(fā)現(xiàn)了加工過的Gal2(圖15)。
圖3未加工的gal2加工過的gal2php:gal2(pDOW1123)和oprF:gal2(pDOW1122)中的Western分析20升規(guī)模的表達(dá)(32小時(shí)誘導(dǎo))圖5A堿性磷酸酶接合的抗-mouse抗體抗-His標(biāo)記單克隆抗體用6×His標(biāo)記的Gal2scFvβ-半乳糖苷酶B ELISA檢定法 分泌的oprF:gal2再折疊蛋白質(zhì)和通過Ni-NTA提純的細(xì)胞質(zhì)gal13天然蛋白質(zhì)C從熒光假單胞菌或大腸桿菌中分離出的Gal13抗體活性的ELISA測量圖9抗地黃辛ELISA圖11未加工的Skp蛋白質(zhì)的氨基酸序列。下劃線的序列相當(dāng)于信號序列加工過的Skp蛋白質(zhì)的氨基酸序列。下劃線的序列相當(dāng)于被識別為MALDI-PSD的信號序列。
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸序列，其包含熒光假單胞菌Sec-系統(tǒng)分泌肽的分泌信號編碼序列或與該編碼序列基本同源的序列——該分泌信號肽選自磷酸鹽結(jié)合蛋白(pbp)分泌信號、外膜孔蛋白E(OprE)分泌信號、Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白分泌信號、天青蛋白分泌信號、鐵(III)結(jié)合蛋白分泌信號和脂蛋白B分泌信號。
2.如權(quán)利要求1的核酸，其中該序列為磷酸鹽結(jié)合蛋白(pbp)分泌信號或與該pbp信號序列基本同源的序列編碼。
3.如權(quán)利要求2的核酸，其中該序列與SEQ ID NO2至少80％或至少85％相同。
4.如權(quán)利要求2的核酸，其中該序列與SEQ ID NO2至少90％或至少95％相同。
5.如權(quán)利要求1的核酸，其中該序列與選自下列序列的核酸序列雜交pbp分泌信號編碼的序列、SEQ ID NO2的序列、與SEQ ID NO2至少80％相同的序列、與SEQ ID NO2至少85％相同的序列、與SEQID NO2至少90％相同的序列、與SEQ ID NO2至少95％相同的序列。
6.如權(quán)利要求1的核酸，其包含SEQ ID NO2的序列，其調(diào)節(jié)至反映選定表達(dá)核酸序列的宿主機(jī)體的密碼子偏性。
7.如權(quán)利要求1的核酸，其中該序列為外膜孔蛋白E(OprE)分泌信號或與該OprE信號序列基本同源的序列編碼。
8.如權(quán)利要求7的核酸，其中該序列與SEQ ID NO4至少80％、或至少85％、至少90％或至少95％相同。
9.如權(quán)利要求1的核酸，其中該序列為Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白分泌信號或與該信號序列基本同源的序列編碼。
10.如權(quán)利要求9的核酸，其中該序列與SEQ ID NO6至少80％、或至少85％、至少90％或至少95％相同。
11.如權(quán)利要求1的核酸，其中該序列為天青蛋白分泌信號或與該信號序列基本同源的序列編碼。
12.如權(quán)利要求11的核酸，其中該序列與SEQ ID NO8至少80％、或至少85％、至少90％或至少95％相同。
13.如權(quán)利要求1的核酸，其中該序列為鐵(III)結(jié)合蛋白分泌信號或與該信號序列基本同源的序列編碼。
14.如權(quán)利要求13的核酸，其中該序列與SEQ ID NO10至少80％、或至少85％、至少90％或至少95％相同。
15.如權(quán)利要求1的核酸，其中該序列為脂蛋白B分泌信號或與該信號序列基本同源的序列編碼。
16.如權(quán)利要求15的核酸，其中該序列與SEQ ID NO12至少80％、或至少85％、至少90％或至少95％相同。
17.如權(quán)利要求1的核酸，其中該序列與選自下列序列的核酸序列雜交與SEQ ID NO4至少80％相同的序列、與SEQ ID NO6至少80％相同的序列、與SEQ ID NO8至少80％相同的序列、與SEQ ID NO10至少80％相同的序列和與SEQ ID NO12至少80％相同的序列。
18.如權(quán)利要求1的核酸，其包含選自SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10和SEQ ID NO12的核酸序列，其被調(diào)節(jié)至反映選定表達(dá)核酸序列的宿主機(jī)體的密碼子偏性。
19.如權(quán)利要求5或17的核酸，其中雜交是在嚴(yán)格條件下進(jìn)行的。
20.如權(quán)利要求19的核酸，其中雜交在68℃進(jìn)行。
21.一種重組載體，其包含編碼熒光假單胞菌Sec-系統(tǒng)分泌肽的核酸分泌信號序列——該分泌信號肽選自pbp分泌信號、OprE分泌信號、Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白分泌信號、天青蛋白分泌信號、鐵(III)結(jié)合蛋白分泌信號和脂蛋白B分泌信號；或與該分泌信號序列基本同源的序列；或與該分泌信號序列雜交的序列。
22.如權(quán)利要求21的載體，其中分泌信號序列是選自SEQ IDNO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10和SEQ ID NO12，或是與該分泌信號序列基本同源的序列。
23.如權(quán)利要求21的載體，其中分泌信號序列為磷酸鹽結(jié)合蛋白(pbp)分泌信號或與該pbp信號序列基本同源的序列編碼。
24.如權(quán)利要求23的載體，其中分泌信號序列與SEQ ID NO2至少80％或至少85％相同。
25.如權(quán)利要求23的載體，其中分泌信號序列與SEQ ID NO2至少90％或至少95％相同。
26.如權(quán)利要求23的載體，其包含SEQ ID NO2的分泌信號序列，其被調(diào)節(jié)至反映選定表達(dá)核酸序列的宿主機(jī)體的密碼子偏性。
27.如權(quán)利要求21的載體，其中分泌信號序列為外膜孔蛋白E(OprE)分泌信號或與該信號序列基本同源的序列編碼。
28.如權(quán)利要求21的載體，其中分泌信號序列為Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白分泌信號或與該信號序列基本同源的序列編碼。
29.如權(quán)利要求21的載體，其中分泌信號序列為天青蛋白分泌信號或與該信號序列基本同源的序列編碼。
30.如權(quán)利要求21的載體，其中分泌信號序列為鐵(III)結(jié)合蛋白分泌信號或與該信號序列基本同源的序列編碼。
31.如權(quán)利要求21的載體，其中分泌信號序列為脂蛋白B分泌信號或與該信號序列基本同源的序列編碼。
32.如權(quán)利要求21的載體，其中分泌信號序列與選自下列序列的核酸序列雜交與SEQ ID NO4至少80％相同的序列、與SEQ ID NO6至少80％相同的序列、與SEQ ID NO8至少80％相同的序列、與SEQID NO10至少80％相同的序列和與SEQ ID NO12至少80％相同的序列。
33.如權(quán)利要求21的載體，其中分泌信號序列選自SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10和SEQ ID NO12，其被調(diào)節(jié)至反映選定表達(dá)核酸序列的宿主機(jī)體的密碼子偏性。
34.如權(quán)利要求21的載體，其包含與分泌信號序列雜交的序列。
35.如權(quán)利要求34的載體，其中雜交是在嚴(yán)格條件下進(jìn)行的。
36.如權(quán)利要求35的載體，其中雜交在68℃進(jìn)行。
37.如權(quán)利要求21的載體，其中分泌信號序列被可操縱地連接到相關(guān)重組蛋白或肽的編碼序列上。
38.如權(quán)利要求37的載體，其中重組蛋白或肽原產(chǎn)于宿主。
39.如權(quán)利要求38的載體，其中重組蛋白或肽原產(chǎn)于熒光假單胞菌。
40.如權(quán)利要求37的載體，其中重組蛋白或肽來自不是原產(chǎn)于宿主有機(jī)體的蛋白質(zhì)或肽。
41.如權(quán)利要求37的載體，其中重組蛋白或肽來自非假單胞菌的有機(jī)體。
42.如權(quán)利要求37的載體，其中重組蛋白或肽來自真核有機(jī)體。
43.如權(quán)利要求37的載體，其中重組蛋白或肽來自哺乳動(dòng)物有機(jī)體。
44.如權(quán)利要求37的載體，其在信號肽序列與重組蛋白或肽序列之間進(jìn)一步包含連接序列。
45.如權(quán)利要求44的載體，其中連接序列可被信號肽酶裂解。
46.如權(quán)利要求37的載體，其中重組蛋白或肽序列被可操縱地連接到第二信號序列上。
47.如權(quán)利要求46的載體，其中第二信號序列包含導(dǎo)向外膜分泌信號的序列。
48.如權(quán)利要求21的載體，其中載體進(jìn)一步包含啟動(dòng)子。
49.如權(quán)利要求48的載體，其中啟動(dòng)子原產(chǎn)于細(xì)菌宿主細(xì)胞。
50.如權(quán)利要求48的載體，其中啟動(dòng)子不是原產(chǎn)于細(xì)菌宿主細(xì)胞。
51.如權(quán)利要求48的載體，其中啟動(dòng)子原產(chǎn)于大腸桿菌。
52.如權(quán)利要求48的載體，其中啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
53.如權(quán)利要求48的載體，其中啟動(dòng)子是lac啟動(dòng)子或lac啟動(dòng)子的衍生物。
54.一種重組細(xì)胞，其包含編碼熒光假單胞菌Sec-系統(tǒng)分泌肽的核酸分泌信號序列——該分泌信號肽選自pbp分泌信號、OprE分泌信號、Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白分泌信號、天青蛋白分泌信號、鐵(III)結(jié)合蛋白分泌信號和脂蛋白B分泌信號；與該分泌信號序列基本同源的序列；或與該分泌信號序列雜交的序列，或與該編碼序列基本同源的序列。
55.如權(quán)利要求54的重組細(xì)胞，其中分泌信號序列在表達(dá)載體中。
56.如權(quán)利要求54的重組細(xì)胞，其中分泌信號序列是pbp序列。
57.如權(quán)利要求54的重組細(xì)胞，其中分泌信號序列是OprE序列。
58.如權(quán)利要求54的重組細(xì)胞，其中分泌信號序列被可操縱地連接到相關(guān)重組蛋白或肽上。
59.如權(quán)利要求54的重組細(xì)胞，其中細(xì)胞表達(dá)被可操縱地連接到由該核酸編碼的分泌信號肽上的相關(guān)蛋白質(zhì)或肽。
60.如權(quán)利要求59的細(xì)胞，其中該蛋白質(zhì)或肽表達(dá)在細(xì)胞的周質(zhì)隔室中。
61.如權(quán)利要求54的細(xì)胞，其中細(xì)胞中的酶使信號肽從相關(guān)蛋白質(zhì)或肽裂解。
62.如權(quán)利要求54的細(xì)胞，其中細(xì)胞來自細(xì)菌宿主。
63.如權(quán)利要求62的細(xì)胞，其中宿主是假單胞菌。
64.如權(quán)利要求63的細(xì)胞，其中宿主是熒光假單胞菌。
65.如權(quán)利要求62的細(xì)胞，宿主是大腸桿菌。
66.一種分離肽，其包含熒光假單胞菌Sec-系統(tǒng)分泌肽的編碼氨基酸序列——該分泌信號肽選自pbp分泌信號、OprE分泌信號、Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白分泌信號、天青蛋白分泌信號、鐵(III)結(jié)合蛋白分泌信號和脂蛋白B分泌信號，或與該信號序列基本同源的序列。
67.如權(quán)利要求66的肽，其中分泌肽包含磷酸鹽結(jié)合蛋白(pbp)分泌信號或與該pbp信號序列基本同源的序列。
68.如權(quán)利要求66的肽，其中氨基酸序列與SEQ ID NO1的氨基酸2-24至少90％相同。
69.如權(quán)利要求66的肽，其中氨基酸序列與SEQ ID NO1的氨基酸2-24至少95％相同。
70.如權(quán)利要求66的肽，其中氨基酸序列與SEQ ID NO1的氨基酸2-24至少98％相同。
71.如權(quán)利要求66的肽，其中分泌肽包含外膜孔蛋白E(OprE)分泌信號或與該OprE信號序列基本同源的序列。
72.如權(quán)利要求66的肽，其中氨基酸序列與SEQ ID NO3的氨基酸2-21至少90％相同。
73.如權(quán)利要求66的肽，其中分泌肽包含Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白分泌信號或與該信號序列基本同源的序列。
74.如權(quán)利要求66的肽，其中分泌肽包含天青蛋白分泌信號或與該信號序列基本同源的序列。
75.如權(quán)利要求66的肽，其中分泌肽包含鐵(III)結(jié)合蛋白分泌信號或與該信號序列基本同源的序列。
76.如權(quán)利要求66的肽，其中分泌肽包含脂蛋白B分泌信號或與該信號序列基本同源的序列。
77.如權(quán)利要求66的肽，其被可操縱地連接到相關(guān)重組蛋白或肽上。
78.如權(quán)利要求77的肽，其中重組蛋白或肽來自不是熒光假單胞菌有機(jī)體的有機(jī)體。
79.一種用于表達(dá)重組蛋白或肽的表達(dá)系統(tǒng)，包含a.一種宿主細(xì)胞；和b.一種載體，其包含被可操縱地與熒光假單胞菌Sec-系統(tǒng)分泌信號相連的重組蛋白或肽——該分泌信號選自pbp分泌信號、OprE分泌信號、Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白分泌信號、天青蛋白分泌信號、鐵(III)結(jié)合蛋白分泌信號和脂蛋白B分泌信號、或與該信號序列基本同源的序列。
80.如權(quán)利要求79的系統(tǒng)，其中分泌信號序列是pbp序列。
81.如權(quán)利要求79的系統(tǒng)，其中分泌信號序列是OprE序列。
82.如權(quán)利要求79的系統(tǒng)，其中分泌信號序列是Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白分泌信號。
83.如權(quán)利要求79的系統(tǒng)，其中分泌信號序列是天青蛋白分泌信號。
84.如權(quán)利要求79的系統(tǒng)，其中分泌信號序列是鐵(III)結(jié)合蛋白分泌信號。
85.如權(quán)利要求79的系統(tǒng)，其中分泌信號序列是脂蛋白B分泌信號。
86.如權(quán)利要求79的系統(tǒng)，其中分泌信號序列被可操縱地連接到相關(guān)重組蛋白或肽上。
87.如權(quán)利要求79的系統(tǒng)，其中細(xì)胞表達(dá)被可操縱地與由該核酸編碼的分泌信號肽相連的相關(guān)蛋白質(zhì)或肽。
88.如權(quán)利要求87的系統(tǒng)，其中該蛋白質(zhì)或肽表達(dá)在細(xì)胞的周質(zhì)隔室中。
89.如權(quán)利要求87的系統(tǒng)，其中細(xì)胞中的酶使信號肽從相關(guān)蛋白質(zhì)或肽裂解。
90.如權(quán)利要求79的系統(tǒng)，其中細(xì)胞來自細(xì)菌宿主。
91.如權(quán)利要求90的系統(tǒng)，其中宿主是假單胞菌。
92.如權(quán)利要求91的系統(tǒng)，其中宿主是熒光假單胞菌。
93.如權(quán)利要求90的系統(tǒng)，其中宿主是大腸桿菌。
94.如權(quán)利要求79的系統(tǒng)，進(jìn)一步包含發(fā)酵培養(yǎng)基。
95.如權(quán)利要求94的系統(tǒng)，其中發(fā)酵培養(yǎng)基包含化學(xué)誘導(dǎo)物。
96.一種用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白或肽的方法，包括提供一種包含載體的細(xì)胞，該載體編碼與熒光假單胞菌Sec系統(tǒng)分泌信號可操縱地連接的重組蛋白或肽——該分泌信號選自pbp分泌信號、OprE分泌信號、Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白分泌信號、天青蛋白分泌信號、鐵(III)結(jié)合蛋白分泌信號和脂蛋白B分泌信號、或與該信號序列基本同源的序列；并在產(chǎn)生重組蛋白或肽的表達(dá)的條件下生長該細(xì)胞。
97.如權(quán)利要求96的方法，其中分泌信號是pbp分泌信號。
98.如權(quán)利要求96的方法，其中分泌信號是OprE分泌信號。
99.如權(quán)利要求96的方法，其中分泌信號是Lys-Arg-Orn結(jié)合蛋白分泌信號。
100.如權(quán)利要求96的方法，其中分泌信號是天青蛋白分泌信號。
101.如權(quán)利要求96的方法，其中分泌信號是鐵(III)結(jié)合蛋白分泌信號。
102.如權(quán)利要求96的方法，其中分泌信號是脂蛋白B分泌信號。
103.如權(quán)利要求96的方法，其中細(xì)胞在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長。
104.如權(quán)利要求96的方法，其中細(xì)胞以高細(xì)胞密度生長。
105.如權(quán)利要求104的方法，其中細(xì)胞以至少20克/升的細(xì)胞密度生長。
106.如權(quán)利要求96的方法，額外包括將重組蛋白提純。
107.如權(quán)利要求96的方法，其中通過親和色譜法提純重組蛋白。
108.如權(quán)利要求96的方法，其中重組蛋白與分泌信號的可操縱的連接可被原產(chǎn)于宿主細(xì)胞的酶裂解。
109.如權(quán)利要求109的方法，其中分泌信號在表達(dá)過程中與重組蛋白裂解。
110.如權(quán)利要求96的方法，其中重組蛋白或肽來自原產(chǎn)于宿主有機(jī)體的蛋白質(zhì)或肽。
111.如權(quán)利要求96的方法，其中重組蛋白或肽來自原產(chǎn)于熒光假單胞菌的蛋白質(zhì)或肽。
112.如權(quán)利要求96的方法，其中重組蛋白或肽來自不是原產(chǎn)于宿主有機(jī)體的蛋白質(zhì)或肽。
113.如權(quán)利要求96的方法，其中重組蛋白或肽來自不是假單胞菌的有機(jī)體。
114.如權(quán)利要求96的方法，其中重組蛋白或肽來自真核有機(jī)體。
115.如權(quán)利要求96的方法，其中重組蛋白包含包括至少兩個(gè)半胱氨酸殘基的序列。
116.如權(quán)利要求96的方法，其中在細(xì)胞中在重組蛋白中形成至少一個(gè)二硫鍵。
117.如權(quán)利要求96的方法，在信號肽序列與重組蛋白或肽序列之間進(jìn)一步包含連接序列。
118.如權(quán)利要求96的方法，其中至少50％重組蛋白包含天然氨基末端。
119.如權(quán)利要求96的方法，其中至少80％重組蛋白包含天然氨基末端。
120.如權(quán)利要求96的方法，其中至少90％重組蛋白包含天然氨基末端。
121.如權(quán)利要求96的方法，其中至少50％重組蛋白是活性的。
122.如權(quán)利要求96的方法，其中至少80％重組蛋白是活性的。
123.如權(quán)利要求96的方法，其中至少50％重組蛋白表達(dá)在周質(zhì)隔室中。
124.如權(quán)利要求96的方法，其中至少75％重組蛋白表達(dá)在周質(zhì)隔室中。
125.如權(quán)利要求96的方法，其中至少90％重組蛋白表達(dá)在周質(zhì)隔室中。
126.如權(quán)利要求96的方法，其中細(xì)胞是假單胞菌細(xì)胞。
127.如權(quán)利要求126的方法，其中細(xì)胞是熒光假單胞菌細(xì)胞。
128.如權(quán)利要求96的方法，其中細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
129.一種用于在熒光假單胞菌宿主細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白的改進(jìn)的方法，包括提供一種包含載體的熒光假單胞菌細(xì)胞，該載體編碼與重組Sec系統(tǒng)分泌信號序列可操縱地相連的重組蛋白或肽；并在產(chǎn)生該蛋白或肽的表達(dá)的條件下生長該細(xì)胞。
130.如權(quán)利要求129的方法，其中信號序列來自熒光假單胞菌基因組。
131.如權(quán)利要求129的方法，其中信號序列不是來自熒光假單胞菌基因組。
132.如權(quán)利要求129的方法，其中信號序列來自大腸桿菌基因組。
133.如權(quán)利要求129的方法，其中細(xì)胞在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長。
134.如權(quán)利要求129的方法，其中細(xì)胞以高細(xì)胞密度生長。
135.如權(quán)利要求134的方法，其中細(xì)胞以至少20克/升的細(xì)胞密度生長。
136.如權(quán)利要求129的方法，額外包括將重組蛋白提純。
137.如權(quán)利要求136的方法，其中通過親和色譜法提純重組蛋白。
138.如權(quán)利要求129的方法，其中重組蛋白與分泌信號的可操縱的連接可被原產(chǎn)于宿主細(xì)胞的酶裂解。
139.如權(quán)利要求138的方法，其中分泌信號在表達(dá)過程中與重組蛋白裂解。
140.如權(quán)利要求129的方法，其中重組蛋白或肽來自假單胞菌有機(jī)體。
141.如權(quán)利要求129的方法，其中重組蛋白或肽來自不是假單胞菌的有機(jī)體。
142.如權(quán)利要求129的方法，其中重組蛋白或肽來自真核有機(jī)體。
143.如權(quán)利要求129的方法，其中重組蛋白包含包括至少兩個(gè)半胱氨酸殘基的序列。
144.如權(quán)利要求129的方法，其中在細(xì)胞中在重組蛋白中形成至少一個(gè)二硫鍵。
145.如權(quán)利要求129的方法，在信號肽序列與重組蛋白或肽序列之間進(jìn)一步包含連接序列。
146.如權(quán)利要求129的方法，其中至少50％重組蛋白包含天然氨基末端。
147.如權(quán)利要求129的方法，其中至少80％重組蛋白是活性的。
148.如權(quán)利要求129的方法，其中至少90％重組蛋白是活性的。
149.如權(quán)利要求129的方法，其中至少50％重組蛋白表達(dá)在周質(zhì)隔室中。
150.如權(quán)利要求129的方法，其中至少75％重組蛋白表達(dá)在周質(zhì)隔室中。
151.如權(quán)利要求129的方法，其中至少90％重組蛋白表達(dá)在周質(zhì)隔室中。
全文摘要
本發(fā)明使用熒光假單胞菌Sec分泌系統(tǒng)描述了使用Sec－系統(tǒng)分泌信號肽制造重組蛋白的改進(jìn)的方法和原核表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明描述了特定的新型Sec－系統(tǒng)分泌信號肽作為重組蛋白和肽的改進(jìn)分泌的融合蛋白和編碼序列。
文檔編號C07H19/00GK1882605SQ200480034455
公開日2006年12月20日 申請日期2004年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月21日
發(fā)明者D·M·雷塔拉克, J·C·斯涅德, T·M·拉姆塞耶爾 申請人:陶氏環(huán)球技術(shù)公司