專利名稱：被設(shè)計用于破壞NEMO寡聚化的肽對NF－κB活化的選擇性抑制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制NF-κB信號途徑的多肽和編碼相同的多肽的多核苷酸。本發(fā)明還提供了通過給所需處理的對象施用本發(fā)明的多肽而調(diào)控和/或治療炎癥應(yīng)答、腫瘤發(fā)生、病毒感染；調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡；以及調(diào)節(jié)抗原刺激的B或T淋巴細(xì)胞的方法。最后，本發(fā)明提供了一種鑒定調(diào)控NEMO寡聚化的多肽的方法。
核因子-κB(NF-κB)信號傳導(dǎo)是一種在炎癥應(yīng)答、腫瘤發(fā)生、病毒感染、細(xì)胞增殖和凋亡以及抗原刺激的B和T淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)中都涉及到的重要的信號途徑(Ghosh，1998，Annu.Rev.Immunol.；Karin，1999，J.Biol.Chem.；Israel，2000，Trends Cell Biol.；Santoro，2003，EMBO J.)。在哺乳動物細(xì)胞中，存在5種二聚體化的NF-κB家族成員RelA、RelB、c-Rel、NF-κB2/p100/p52和NF-κB1/p105/p50。NF-κB的優(yōu)勢形式是一種由p50和RelA亞基構(gòu)成的異二聚體的轉(zhuǎn)錄因子，通過與已知為IκB的蛋白抑制家族的成員結(jié)合，使得NF-κB被隔離在細(xì)胞漿內(nèi)。在細(xì)胞因子TNF-α和白介素-1、內(nèi)毒素(LPS)、微生物和病毒感染的刺激之下，促炎癥信號匯集于經(jīng)典的IκB激酶復(fù)合物(IKK)，這是一種由兩個激酶亞基(IKKα/IKK-1和IKKβ/IKK-2)以及一個結(jié)構(gòu)性/調(diào)節(jié)性亞基(NEMO/IKKγ)組成的蛋白復(fù)合物。一旦活化的IKK復(fù)合物將IκB蛋白磷酸化，就觸發(fā)了IκB的泛素化以及隨后的蛋白酶體的降解。然后游離的NF-κB可以移動到核內(nèi)，啟動或上調(diào)基因表達(dá)。盡管IKKα和IKKβ表現(xiàn)出驚人的結(jié)構(gòu)相似性(52％)，但是精細(xì)的遺傳學(xué)研究已經(jīng)顯示它們涉及兩條活化NF-κB的途徑(Pomerantz，2002，Mol Cell)。IKKβ是一種促炎癥激酶，它作用于激活經(jīng)典NF-κB復(fù)合物的活化，而IKKα與NF-κB誘導(dǎo)激酶(NIK)相關(guān)，它在非經(jīng)典的NF-κB信號途徑中發(fā)揮著重要作用(Senftleben，2001，Science)。IKKα在角化細(xì)胞分化中也發(fā)揮著作用，但是這個過程并不依賴于它的激酶活性(Hu，2001，Nature)。
NEMO蛋白(NF-κB必需調(diào)控物)在NF-κB途徑活化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。NEMO蛋白與被稱為IKK復(fù)合物的高分子量復(fù)合物中的IKKα和IKKβ蛋白激酶相關(guān)。IKK激酶經(jīng)未知機(jī)制通過磷酸化而被活化，相信該機(jī)制是NEMO寡聚化的結(jié)果(Agou et al.，2004，J.Biol.Chem.)。NEMO蛋白的存在是IKK活化的基礎(chǔ)，因為NEMO缺陷細(xì)胞不能應(yīng)答于多種刺激而活化NF-κB。NEMO是由一個N末端的包括一個大卷曲螺旋(CC1)的IKK結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成。C末端結(jié)構(gòu)域作用為蛋白的調(diào)節(jié)部分，已經(jīng)報道它經(jīng)常作用為連接多種上游信號傳導(dǎo)分子或病毒蛋白的結(jié)合模板(Ghosh，1998，Annu.Rev.Immunol.；Santoro，2003，EMBO J.)。有趣的是，主要是在分子的這個部分發(fā)現(xiàn)了引起IP和EDA-ID病變的突變(Dffinger，2001，Nature Gen.；Zonana，2000，Am.J.Hum.Genet.)。C末端結(jié)構(gòu)域是由包括兩個連續(xù)的卷曲螺旋基序CC2(246-286位殘基)和LZ(390-412殘基)的最小寡聚化結(jié)構(gòu)域(Tegethoff，2003，Mol.Cell Biol.；Agou et al.，2004，J.Biol.Chem.)以及C末端的極遠(yuǎn)端的鋅指基序組成。
應(yīng)答于促炎癥刺激而觸發(fā)IKK活化的生化機(jī)制仍不清楚。已經(jīng)證實活化T環(huán)上的兩個絲氨酸殘基的磷酸化誘導(dǎo)了IKKβ的活化。但是，導(dǎo)致這個磷酸化事件的機(jī)制仍不知道。一個可能的機(jī)制包括NEMO寡聚化所誘導(dǎo)的激酶的構(gòu)型改變(Agou et al.，2004，J.Biol.Chem.)。這種寡聚化狀態(tài)的變化可以通過反式-自磷酸化的機(jī)制誘導(dǎo)T環(huán)活化(Zandi，1997，Cell；Tang，2003，J.Biol.Chem.)。與NEMO寡聚化在IKK活化中的作用相符合的是，在應(yīng)答于多種刺激的NEMO缺陷細(xì)胞的活化中，最小寡聚化結(jié)構(gòu)域內(nèi)的突變不能通過遺傳學(xué)互補(bǔ)解救NF-κB。此外，NEMO的強(qiáng)制寡聚化導(dǎo)致了IKK復(fù)合物的完全活化(Inohara，2000，J.Biol.Chem.；Poyet，2000，J.Biol.Chem.；Poyet，2001，J.Biol.Chem.)。最近，已經(jīng)報道了NEMO應(yīng)答于TNF-α的磷酸化和泛素化(Carter，2001，J.Biol.Chem.；Trompouky，2003，Nature；Kovalenko，2003，Nature)。但是，仍沒有證實這些NEMO修飾是應(yīng)答于一些促炎癥刺激而活化IKK復(fù)合物的關(guān)鍵步驟。
對NF-κB活化的抑制形成了一個用于開發(fā)新的抗炎癥和抗腫瘤藥物的特殊靶點(diǎn)(May，2000，Science；Poulaki，2002，Am J Pathol..)。在NF-κB信號途徑中發(fā)揮著作用的多種蛋白之中，IKK復(fù)合物代表著其中一種最有前途的用于發(fā)現(xiàn)新的特異的NF-κB抑制劑的分子靶點(diǎn)。為了將在體內(nèi)的潛在的毒性作用最小化，治療的成功將極大地依賴于NF-κB抑制劑阻斷活化信號而不修飾基本水平的NF-κB活性的能力。May等描述了一種細(xì)胞可通透性肽抑制劑，它通過破壞組成型NEMO與IKK激酶的相互作用而特異地阻斷促炎癥的NF-κB活化(May，2000，Science；May，2002，J.Biol.Chem.)。經(jīng)對肽的合理設(shè)計改變蛋白功能而調(diào)控蛋白-蛋白相互作用為新型治療藥物的基礎(chǔ)研究和開發(fā)提供了重要工具(Souroujon，1998，Nat Biotechnol.)，特別是對表現(xiàn)出可變的和動態(tài)的結(jié)合性能的信號蛋白(Pawson，2003，Science)。在文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了多個對肽調(diào)控物的研究，其中肽通過干擾定位(轉(zhuǎn)移)(Lin，1995，J.Biol.Chem.)、補(bǔ)償受體(Chang，2000，J.Biol.Chem.)、分子內(nèi)相互作用(Souroujon，1998，Nat Biotechnol.)和寡聚化(Judice，1997，P.N.A.S.)而調(diào)節(jié)蛋白功能。在后者中，用不同的肽對HIV-1 gp41融合蛋白的抑制提供了清晰的概念證據(jù)(對其綜述見Chan，1998，Cell and Eckert，2001，Ann.Rev.Biochem.)。
在這種理論下，對NF-κB活化的抑制提供了一種用于開放新的抗炎癥和抗腫瘤藥物的有希望的靶點(diǎn)，本發(fā)明者已經(jīng)開始發(fā)現(xiàn)侯選的抗炎癥和抗腫瘤藥物，并提供了篩選相同的抗炎癥和抗腫瘤藥物的方法。
本發(fā)明的一個目的是提供了可用于調(diào)節(jié)和/或抑制NF-κB信號途徑的衍生自NEMO的多肽。
為此，本發(fā)明提供了抑制NE-κB信號途徑的NEMO衍生多肽。
在本發(fā)明的一個實施方式中，NEMO衍生多肽是CC2結(jié)構(gòu)域(小鼠SEQ ID NO3或人SEQ ID NO14)。
在本發(fā)明的另一個實施方式中，NEMO衍生多肽是LZ結(jié)構(gòu)域(小鼠SEQ ID NO7或人SEQ ID NO16)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，NEMO衍生多肽經(jīng)一個間隔序列與一個具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的多肽融合。
另外，本發(fā)明的另一個實施方式，是編碼NEMO衍生多肽(無論是否具有間隔序列及具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的多肽)的多核苷酸。
還在本發(fā)明的另一個實施方式中，是通過給有治療需要的對象施用NEMO多肽而調(diào)控或治療NF-κB信號途徑所調(diào)節(jié)的疾病的方法。NF-κB信號途徑所調(diào)節(jié)的疾病包括炎癥應(yīng)答、腫瘤形成、和病毒感染。
本發(fā)明也提供了一種通過給有治療需要的對象施用NEMO衍生多肽而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖或凋亡的方法。
仍在本發(fā)明的另一個實施方式中，是一種通過給有治療需要的對象施用NEMO衍生多肽而調(diào)節(jié)抗原刺激的B或T淋巴細(xì)胞的方法。
還在另一個實施方式中，本發(fā)明還提供了一種鑒定調(diào)控NEMO寡聚化的多肽的方法，通過a)鑒定出侯選多肽序列；b)通過用一個間隔序列連接所述的侯選多肽序列與一個具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的多肽，生成一個多肽融合構(gòu)建體；c)將一種細(xì)胞培養(yǎng)物與多肽融合構(gòu)建體接觸；和d)監(jiān)測NF-κB信號途徑的活性；e)比較存在所述多肽融合構(gòu)建體時的NF-κB信號途徑的活性與沒有所述多肽融合構(gòu)建體時的NF-κB信號途徑的活性，以確定出所述多肽融合構(gòu)建體造成的相對抑制；和
f)將所述多肽融合構(gòu)建體造成的相對抑制與NEMO寡聚化相關(guān)聯(lián)。
上面的目的著重于本發(fā)明的某些部分。在下面對發(fā)明的詳細(xì)描述中可以找到本發(fā)明的其他目的、部分和實施方式。
當(dāng)通過參照以下的圖并結(jié)合下面的詳細(xì)描述更好地理解本發(fā)明時，可以容易地獲得對本發(fā)明以及許多本發(fā)明的伴隨優(yōu)點(diǎn)的更完整的認(rèn)識。


圖1NEMO蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。
(A)小鼠的NEMO蛋白含有412個氨基酸以及多個結(jié)構(gòu)域，包括N末端的IKK結(jié)合結(jié)構(gòu)域和寡聚化結(jié)構(gòu)域、富脯氨酸基序(PPP)和C末端的鋅指基序(ZF)。顯示了利用Wolf等(1997，Protein Sci.)開發(fā)的算法得到的卷曲螺旋預(yù)測(白框)和NLM保守基序(黑框)。標(biāo)明了對應(yīng)于第二卷曲螺旋(CC2)和亮氨酸拉鏈(LZ)基序的NEMO253-337序列(SEQ ID NO12的235-337位殘基)，它包含了所有的NEMO寡聚化所需的決定子(Agou et al.，2004，J.Biol.Chem.)，NLM保守基序(SEQ ID NO12的293-322位殘基)用下劃線標(biāo)出，以及用序列下方的圓筒表示卷曲螺旋序列。序列上方的字母表示“a”和“d”位點(diǎn)的七次重復(fù)，這是卷曲螺旋序列的重要特點(diǎn)(Vinson，2002，Mol.Cell.Biol.)。對來自小鼠(Mm)、人(Hs)、牛(Bt)和果蠅(Dm)的NEMO蛋白的多個序列對比顯示NEMO樣基序(NLM)共享不同種屬的NRP/optineurin、ABIN-1/Naf1、ABIN-2和ABIN-3/LIND(分別是SEQ ID NOs19-29)。通過利用CLUSTAL W(Thompson，1994，N.A.R.)對PSI-BLAST生成的序列片段的最高積分對的分析以及重新排列對比構(gòu)建出多個序列對比。分別用(！)或(*)表示相同的和相似的氨基酸殘基(陰影部分)。
圖2NEMO肽攝取的流式細(xì)胞術(shù)分析(A)通過與Antennapedia肽綴合而介導(dǎo)NEMO肽的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。將70Z/3細(xì)胞在不存在(W/O)或存在所示的2μM BODIPY標(biāo)記的Ant-CC2野生型肽(WT)、或Ant-CC2突變型肽(Mu)、或Ant-LZ(WT)野生型肽或Ant-LZ突變肽(Mu)時，在37℃下培養(yǎng)2h，或與對應(yīng)于2μMBODIPY綴合的BSA(BODIPY-BSA)或BODIPY-FL本身的對照一起培養(yǎng)。(B)Antennapedia介導(dǎo)的70Z/3-C3細(xì)胞在37℃下5h對0、0.2、2和20μM Ant-CC2的攝取的濃度依賴性(左邊)以及對在37℃下加入20μMAnt-CC2后0、0.5、1、2或5h時的BODIPY綴合的Ant-CC2的FACS的動力學(xué)分析。
圖3用細(xì)胞可通透性Ant-CC2和Ant-LZ肽對LPS誘導(dǎo)的NF-κB活化的抑制。
(A)用pIL1-β-半乳糖苷酶(攜帶有在NF-κB控制之下的β-半乳糖苷酶基因)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染70Z3B淋巴細(xì)胞(見“材料和方法”)。將所生成的細(xì)胞株70Z3-C3孵育2個小時，有或沒有20μM Antennapedia肽(Ant)、或BODIPY標(biāo)記的Antennapedia肽(BODIPY-Ant)、或與CC2結(jié)合的BODIPY標(biāo)記的Antennapedia肽(BODIPY-Ant-CC2)或LZ(BODIPY-Ant-LZ)肽。在細(xì)胞內(nèi)吞攝取肽之后，用LPS(3μg/ml，左側(cè)的(+))處理細(xì)胞5個小時，或不處理(右側(cè)和左側(cè)的(-))，并用β-半乳糖苷酶檢測法測定NF-κB活性。誤差欄表示三次不同試驗的標(biāo)準(zhǔn)差。(B)用BODIPY-Ant-CC2肽(左側(cè))或BODIPY-Ant-LZ肽(右側(cè))對LPS誘導(dǎo)的NF-κB活化的抑制的濃度依賴性。如和(A)中一樣，但用不同濃度的所示的肽處理細(xì)胞。通過確定IC50值(對應(yīng)于與對照比較(無肽時)，對LPS誘導(dǎo)的NF-κB活性的50％抑制)，測定出每種肽抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB活化的能力。(C)、(D)N端Antennapedia融合序列對抑制NF-κB活化的影響。將對照(無肽)或CC2、或LZ肽(在其N末端具有(BODIPY-ANT-CC2、BODIPY-ANT-LZ)或不具有(CC2、LZ)Antennapedia序列)與70Z3-C3細(xì)胞一起孵育2個小時，隨后用(+)或不用(-)LPS處理3個小時。然后用β-半乳糖苷酶檢測法測定NF-κB活性。
圖4對應(yīng)答于LPS的NF-κB活化的特異抑制依賴于CC2和LZ卷曲螺旋的疏水核心中的少數(shù)突變。
左側(cè)圖表示CC2(A)和LZ(B)肽的螺旋輪狀圖。視圖取自分子頂部。從(a)到(g)位點(diǎn)是卷曲螺旋序列的基本特征(Vinson，2002，Mol.Cell.Biol.)，它們代表每個肽序列中的序列位點(diǎn)。第一個(a)和第四個(d)位點(diǎn)通常是由疏水性氨基酸所占據(jù)，它們構(gòu)成了平行的和反向平行的卷曲螺旋的疏水核心。顯示了被引入到CC2變異體的(a)位點(diǎn)的突變(BODIPY-Ant-CC2(Mu)；如SEQ ID NO3的6-40位殘基所示，具有對應(yīng)于SEQ ID NO5的6-40位殘基的甘氨酸突變)或LZ變異體的(d)位點(diǎn)的突變(BODIPY-Ant-(Mu))。在右側(cè)圖中，將70Z3-C3細(xì)胞孵育2個小時，沒有(對照)或有10μM野生型(BODIPY-Ant-CC2(WT))或突變型(BODIPY-Ant-CC2(Mu))CC2肽(A)或野生型(BODIPY-Ant-LZ(WT))或突變型(BODIPY-Ant-(Mu))LZ肽(B)。然后充分地洗滌細(xì)胞以去除過多的還沒有被細(xì)胞內(nèi)吞的肽，然后將細(xì)胞稀釋3倍，并容許在用(+)或不用(-)LPS處理5個小時之前生長24個小時。用β-半乳糖苷酶檢測法測定NF-κB活性。誤差欄代表兩次獨(dú)立試驗的標(biāo)準(zhǔn)差。
圖5通過特異的卷曲螺旋鏈的形成而發(fā)生LZ肽對NF-κB活化的抑制。
(A)NEMO衍生LZ(SEQ ID NO12的301-336位殘基)和GCN4肽(SEQ ID NO8的23-55位殘基)的序列對比。利用CLUSTAL X排列對比兩種卷曲螺旋基序。分別用(！)或(*)表示相同的和相似的氨基酸殘基(陰影部分)。(B)GCN4卷曲螺旋的概況及螺旋輪狀圖(頂視圖)。用其相對應(yīng)的[a-g]位點(diǎn)顯示出GCN4的氨基酸序列，并根據(jù)它們的保守程度框出不同于相應(yīng)的NEMO衍生LZ序列的殘基。表明了相同的(空方塊)和相似的殘基(空三角)。(C)細(xì)胞可通透性NEMO衍生LZ和GCN4肽對LPS誘導(dǎo)的NF-κB活化的抑制作用的比較。將70Z3-C3細(xì)胞孵育2個小時，沒有(無肽)或有10μM Antennapedia融合LZ(BODIPY-Ant-LZ)或GCN4(BODIPY-Ant-GCN4)肽。然后充分地洗滌細(xì)胞以去除任何沒有被細(xì)胞內(nèi)吞的過量的肽，并稀釋3倍以促進(jìn)在用(+)或不用(-)LPS處理5個小時之前生長24個小時。用β-半乳糖苷酶檢測法測定NF-κB活性。誤差欄代表兩次獨(dú)立試驗的標(biāo)準(zhǔn)差。
圖6具有或不具有Antennapedia序列的NEMO衍生多肽的寡聚化性能。
將10μM濃度的所有的肽都裝柱到superdex75HR10/30柱中，柱已在含有0.1mM DDM的緩沖液中被平衡以提高回收(見“材料和方法”)。在左側(cè)圖中顯示了與Antennapedia序列融合(BODIPY-Ant-CC2(WT)、BODIPY-Ant-CC2(Mu))或沒有融合(CC2(WT)、CC2(Mu))的CC2突變體(虛線)和CC2野生型(實線)的色譜圖，并在左側(cè)圖形中顯示了與Antennapedia序列融合(BODIPY-Ant-LZ(WT)、BODIPY-Ant-LZ(Mu))或沒有融合(LZ(WT)、LZ(Mu))的LZ突變體(虛線)和野生型(實線)的洗脫圖。用箭頭表示球蛋白標(biāo)記物的洗脫體積Oval，卵白蛋白(43kDa)；Chym，糜蛋白酶基因A(25kDa)；Ribo，核糖核酸酶(13.4kDa)和Apro，抑肽酶(6.5kDa)。
圖7Ant-CC2和Ant-LZ肽與CC2肽的結(jié)合。
(A)通過熒光各向異性用CC2直接滴定BODIPY-Ant-CC2(1μM)。用氨基酸分析確定CC2的濃度。標(biāo)繪出毫單位(mA)BODIPY-Ant-CC2的各向異性數(shù)值對漸增濃度的CC2肽的曲線。將數(shù)據(jù)點(diǎn)安放到(fitted)(實線)KD為15.2μM的等溫結(jié)合方程式中(材料和方法)。兩條虛線代表化學(xué)當(dāng)量滴度以及在CC2濃度為16μM時的相交線。假定為1μM濃度的BODIPY-Ant-CC2，得出復(fù)合化學(xué)計量為0.8。(B)通過熒光各向異性用CC2直接滴定BODIPY-Ant-LZ(1μM)。給出了單獨(dú)毫單位(mA)的BODIPY-Ant-LZ(白框)時或存在CC2肽(30μM，灰框；100μM，黑框)時的各向異性數(shù)值。
圖8Ant-CC2和Ant-LZ肽誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Y79的細(xì)胞死亡。
用不同濃度的Ant-CC2(WT)(實方塊)或Ant-CC2(Mu)(空方塊)(A)、或Ant-LZ(WT)(實心圓)或Ant-LZ(Mu)(空心圓)(B)、或Ant肽(空三角)(C)處理Rb細(xì)胞株Y793個小時(A、B)或16個小時(C)。然后用在“材料和方法”中所述的MTS檢測法評價細(xì)胞存活。
除非有特別的定義，在此所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與酶學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、和材料科學(xué)領(lǐng)域的熟練人員所通常理解的相同含義。
在本發(fā)明的實踐或測試中可以施用所有與在此所述的合適的方法和材料相似的或等價的方法和材料。通過引用將在此所提及的所有出版物、專利申請書、專利、或其他參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容并入本申請。本說明書包括定義將控制利益沖突。此外，材料、方法和實施例都只是舉例說明，并不是一種對發(fā)明的限制，除非有不同的說明。
在本申請中，本發(fā)明者研究了被設(shè)計用于破壞NEMO寡聚化的肽對NF-κB活化的抑制。本發(fā)明者先前已經(jīng)顯示最小三聚體化區(qū)包括CC2-LZ卷曲螺旋亞結(jié)構(gòu)域，以及分離的和/或純化的CC2和LZ結(jié)構(gòu)域彼此相互結(jié)合形成一種穩(wěn)定的異二聚體的三聚體。這個結(jié)構(gòu)模型使人想起來自HIV-1的gp41外功能結(jié)構(gòu)域的折疊(Agou et al.，2004，J.Biol.Chem.)。它包括一個中心的三鏈的卷曲螺旋(由NEMO的CC2卷曲螺旋基序組成)，圍繞其周圍的是來源于NEMO的C末端的LZ螺旋基序，它們以反向平行的方式包繞在CC2卷曲螺旋的外側(cè)。根據(jù)這個模型，本發(fā)明者合理地設(shè)計出了兩種對應(yīng)于CC2或LZ亞結(jié)構(gòu)域的優(yōu)化部分的細(xì)胞可通透肽，它們模仿了NEMO亞基之間的接觸區(qū)域。用FACS監(jiān)測肽轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的前B 70Z/3淋巴細(xì)胞中，用NF-κB依賴的β-半乳糖苷酶檢測法定量了它們對LPS誘導(dǎo)的NF-κB活化的作用。本發(fā)明者也已經(jīng)證實LZ肽和CC2肽(較小程度)特異地抑制了NF-κB活化，IC50值為μM范圍。作用是特異的，因為對照肽包括突變的CC2和LZ肽以及異源的卷曲螺旋肽(GCN4)對NF-κB活化都沒有抑制作用。此外，本發(fā)明者已經(jīng)顯示這些NF-κB肽抑制劑誘導(dǎo)了表現(xiàn)出組成性NF-κB活性的人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Y79的細(xì)胞死亡。總而言之，本發(fā)明者已經(jīng)提供了一種通過靶向于NEMO寡聚化而抑制NF-κB途徑的新的和有前途的策略。
本發(fā)明者已經(jīng)證實NEMO構(gòu)成了一種用于尋找抑制NF-κB信號途徑的藥物的優(yōu)選靶點(diǎn)，因為這種蛋白作用為NF-κB活化途徑的上游。在下面的文章中部分研究并發(fā)表了NEMO的作用以及它的各種結(jié)構(gòu)域“NEMO trimerizes through its coiled-coil C-terminal domain.”J Biol Chem，2002May 17；277(20)17464-75.Agou F.et al.，通過引用將其拷貝并入本申請。
在本發(fā)明中，發(fā)明者已經(jīng)合成了模擬寡聚化結(jié)構(gòu)域(CC2結(jié)構(gòu)域＝近40個殘基)或LZ基序(LZ結(jié)構(gòu)域＝近40個殘基)的肽。這些肽的組合改變了NEMO的寡聚化或NEMO與蛋白效應(yīng)物的結(jié)合，兩者都抑制了NF-κB途徑。
在本發(fā)明的一個方面，已經(jīng)將肽藥物與一種長度為16個氨基酸的肽(penetratin/Antennapedia)化學(xué)地組合，據(jù)此使得肽藥物的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)成為可能。也可以將所形成的肽與一種熒光示蹤物化學(xué)地結(jié)合，使得能通過FACS監(jiān)測B淋巴細(xì)胞株的細(xì)胞內(nèi)吞作用。
在B淋巴細(xì)胞中直接地測試這些肽的作用，這些B淋巴細(xì)胞已經(jīng)穩(wěn)定地整合了β-半乳糖糖苷酶攜帶基因，并且在基因的啟動子的上游也具有一些轉(zhuǎn)錄因子(C3克隆)的活化位點(diǎn)(見下面的實施例)。
通過以LPS對B淋巴細(xì)胞進(jìn)行刺激后測定這些肽的抑制作用，本發(fā)明者已經(jīng)能成功地監(jiān)測這些肽的抑制作用。
總的結(jié)果發(fā)現(xiàn)相當(dāng)?shù)蛣┝康?20μM)模擬“CC2”基序的肽的存在比對照肽減少了70％的NF-κB活性。在這個濃度，“亮氨酸拉鏈”肽的作用仍是更為顯著的，因為其在培養(yǎng)基中的存在完全地清除了細(xì)胞應(yīng)答。
這些NF-κB信號途徑的新的抑制劑提供了一種作為抗炎癥化合物以及也作為抗腫瘤化合物的主要優(yōu)點(diǎn)，它們可以被用于癌癥和其他疾病的治療和/或預(yù)防。
本發(fā)明涉及被用于調(diào)控NEMO的寡聚化的化合物、肽、或組合物。具體地，在此下面所描述的肽化合物可以是分離的和/純化的或與或沒有與載體試劑結(jié)合的形式。要明白本發(fā)明也包含具有與NEMO衍生多肽具有至少70％同源性的肽，只要同源物具有所述的抑制活性。下面提供了用于評價NEMO衍生多肽以及其同源物的抑制活性的方法，并在本申請的實施例部分有舉例說明。當(dāng)與對照肽比較，NF-κB活性減少至少50％時，就認(rèn)為本發(fā)明的肽及其劑量具有抑制活性。
本發(fā)明也涉及含有所述肽的藥物組合物，特別是在制備用于治療炎癥應(yīng)答、腫瘤形成、病毒感染、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡以及抗原刺激的藥物的藥物組合物。在一個優(yōu)選的實施方式中，含有所述肽的藥物組合物可用于治療癌癥。
本發(fā)明也包括獲得、制備、和鑒定抑制NF-κB信號途徑的肽和化合物的方法，特別是通過70Z/3-C3細(xì)胞株，70Z/3-C3是在2003年4月1日保藏于法國微生物保藏中心(CNCM，28rue du Docteur Roux，75724PARIS Cedex 15，法國)的細(xì)胞株，保藏號為I-3004。
術(shù)語“減少”或“抑制”在此意味著直接或間接地降低NF-κB途徑中的一種或多種酶的細(xì)胞內(nèi)活性。短句“抑制NF-κB途徑”優(yōu)選地意味著通過破壞NEMO寡聚化而抑制NF-κB途徑。
術(shù)語“增強(qiáng)”在此意思是增加由相應(yīng)DNA編碼的NEMO衍生肽的細(xì)胞內(nèi)活性或濃度。在對細(xì)菌細(xì)胞的各種操作的幫助下，可以實現(xiàn)增強(qiáng)作用。為了獲得增強(qiáng)作用，特別是過度表達(dá)，可以增加相應(yīng)基因的拷貝，可以使用強(qiáng)啟動子，或可以突變位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動子和調(diào)節(jié)區(qū)域或核糖體結(jié)合位點(diǎn)。整合結(jié)構(gòu)基因上游的表達(dá)框以相同的方式發(fā)揮作用。另外，通過采用誘導(dǎo)型啟動子增加表達(dá)也是可能的。也可以使用編碼具有高活性的相應(yīng)酶的基因。通過延長mRNA壽命的措施也可以提高表達(dá)。此外，作為總的結(jié)果，阻止酶的降解也就增加了酶活性。因此，可以以任何所需的方式任意地組合這些措施。例如如在Methods in PlantMolecular Biology，Maliga et al，Eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1995)中所述的，這些和其他的用于改變植物中的基因活性的方法是已知的。
也可以使用編碼相應(yīng)的或不同的具有高活性的抑制NF-κB途徑的NEMO衍生肽的基因。優(yōu)選地，相應(yīng)的酶比天然形式的NEMO蛋白具有更高的抑制NF-κB途徑的能力，更優(yōu)選地至少是5％、10％、25％或50％更多的抑制。最優(yōu)選地，與存在天然NEMO蛋白時的NF-κB途徑比較，本發(fā)明的NEMO衍生肽減少NF-κB途徑至少50％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％。
在本申請中，一種多核苷酸序列與本發(fā)明的序列是“同源的”，條件是它的至少70％、優(yōu)選地至少80％、最優(yōu)選地至少90％的堿基組成和堿基序列對應(yīng)于本發(fā)明的序列。根據(jù)本發(fā)明，“同源蛋白”或“同源肽”被理解為包括含有至少70％、優(yōu)選地至少80％、最優(yōu)選地至少90％的氨基酸序列都對應(yīng)于NEMO的CC2區(qū)域(SEQ ID NO3)或NEMO的LZ區(qū)域(SEQ ID NO7)的氨基酸序列(對于小鼠來源的NEMO)以及NEMO的CC2區(qū)域(SEQ ID NO14)或NEMO的LZ區(qū)域(SEQ ID NO16)的氨基酸序列(對于人來源的NEMO)的蛋白(肽)，其中對應(yīng)被理解為意思是相對應(yīng)的氨基酸或是相同的或是互為同源的氨基酸。如本發(fā)明的實施例所表明的，還要明白CC2的同源肽優(yōu)選地保留了卷曲螺旋基序結(jié)構(gòu)以及LZ的同源肽優(yōu)選地保留了螺旋基序結(jié)構(gòu)。用通過對SEQ ID NO3、SEQID NO7、SEQ ID NO14、和SEQ ID NO16的鑒定以及下面實施例中的詳細(xì)描述所提供的指導(dǎo)，對本發(fā)明范圍內(nèi)的理論突變的篩選將不會要求超出本領(lǐng)域人員的技術(shù)水平以外的技術(shù)。更具體地，作為本領(lǐng)域的一種常規(guī)技術(shù)，通過對侯選序列(即對應(yīng)于SEQ ID NO3、SEQ ID NO7、SEQ ID NO14、和SEQ ID NO16的區(qū)域)的鑒定，技術(shù)人員將檢測并篩選所述序列的一種或所有可能的預(yù)突變，以鑒定出具有相同的或更好的治療療效的突變體。
用語“同源氨基酸”表示那些具有對應(yīng)性能的氨基酸，特別是其電荷、疏水性狀、立體性能等等。
通過使用已知的軟件或計算機(jī)程序例如BestFti或Gap配對比較程序(GCG Wisconsin Package，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin 53711)可以常規(guī)地確定出核苷酸或氨基酸序列的同源性、序列相似性或序列相同性。BestFit使用Smith和Waterman(Advances in Applied Mathematics 2482-489(1981))的局部同源性算法以找出兩個序列之間的最佳相同性或相似性的片段。Gap實施總體對比利用Needleman和Wunsh(J.Mol.Biol.48443-453(1970))的方法進(jìn)行一種序列的所有氨基酸與另一種相似序列的所有氨基酸的對比。當(dāng)使用例如BestFit的序列對比程序確定序列同源性、相似性或相同性的程度時，可以使用缺省設(shè)置，或可以選擇合適的積分矩陣以優(yōu)化相同性、相似性或同源性積分。相似地，當(dāng)使用例如BestFIt的程序確定兩種不同氨基酸序列之間的序列相同性、相似性或同源性時，可以使用缺省設(shè)置，或可以選擇合適的積分矩陣?yán)鏱losum45或blosum80以優(yōu)化相同性、相似性或同源性積分。
本發(fā)明也涉及編碼NEMO的CC2區(qū)域(SEQ ID NO3)或NEMO的LZ區(qū)域(SEQ ID NO7)(對于小鼠來源的NEMO)以及NEMO的CC2區(qū)域(SEQ ID NO14)或NEMO的LZ區(qū)域(SEQ ID NO16)(對于人來源的NEMO)或其片段的多核苷酸，通過用含有編碼NEMO的CC2區(qū)域(SEQ ID NO3)或NEMO的LZ區(qū)域(SEQ ID NO7)(對于小鼠來源的NEMO)以及NEMO的CC2區(qū)域(SEQ ID NO14)或NEMO的LZ區(qū)域(SEQ ID NO16)(對于人來源的NEMO)的所述多核苷酸或其片段的序列的探針與對應(yīng)的基因庫的雜交以及對所述DNA序列的分離的方式，通過篩選可以得到這些多核苷酸序列。
本發(fā)明的多核苷酸序列適合用作RNA、cDNA和DNA的雜交探針，以分離那些表現(xiàn)出與編碼NEMO的CC2區(qū)域(SEQ ID NO3)或NEMO的LZ區(qū)域(SEQ ID NO7)(對于小鼠來源的NEMO)以及NEMO的CC2區(qū)域(SEQ ID NO14)或NEMO的LZ區(qū)域(SEQ ID NO16)(對于人來源的NEMO)的序列或其片段的高度相似性的cDNA或基因。
本發(fā)明的多核苷酸序列也適合用作用于生成DNA的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的引物，所述DNA編碼具有抑制NF-κB途徑的能力的NEMO衍生多肽。
寡核苷酸例如那些作用為探針或引物的寡核苷酸可以含有30多個核苷酸，優(yōu)選地最多到30個，更優(yōu)選地最多到20個，最優(yōu)選地含有至少15個連續(xù)核苷酸。具有長度為至少40個或50個核苷酸的寡核苷酸也是適合的。
術(shù)語“分離的和/或純化的”意思是與其天然環(huán)境分開。
術(shù)語“多核苷酸”通常指的是多核糖核苷酸和多脫氧核糖核苷酸，并且可以表示未修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA。
術(shù)語“多肽”被理解為意思是含有兩個或多個經(jīng)肽鍵連接在一起的氨基酸的肽或蛋白。
本發(fā)明的多肽包括對應(yīng)于NEMO的CC2區(qū)域(SEQ ID NO3)或NEMO的LZ區(qū)域(SEQ ID NO7)(對于小鼠來源的NEMO)以及NEMO的CC2區(qū)域(SEQ ID NO14)或NEMO的LZ區(qū)域(SEQ ID NO16)(對于人來源的NEMO)的多肽或其片段，特別是那些具有抑制NF-κB途徑的生物活性的多肽，本發(fā)明的多肽也包括那些其氨基酸序列的70％、優(yōu)選地至少80％與對應(yīng)于NEMO的CC2區(qū)域(SEQ ID NO3)或NEMO的LZ區(qū)域(SEQ ID NO7)(對于小鼠來源的NEMO)以及NEMO的CC2區(qū)域(SEQ ID NO14)或NEMO的LZ區(qū)域(SEQ ID NO16)(對于人來源的NEMO)的多肽或其片段同源的多肽，以及最優(yōu)選地包括那些表現(xiàn)出與對應(yīng)于NEMO的CC2區(qū)域(SEQ ID NO3)或NEMO的LZ區(qū)域(SEQ IDNO7)(對于小鼠來源的NEMO)以及NEMO的CC2區(qū)域(SEQ ID NO14)或NEMO的LZ區(qū)域(SEQ ID NO16)(對于人來源的NEMO)的多肽或其片段具有至少90％到95％同源性的多肽，并且它們都具有所述的活性。
本發(fā)明也涉及通過對遺傳密碼子的降解編碼編碼NEMO的CC2區(qū)域(SEQ ID NO3)或NEMO的LZ區(qū)域(SEQ ID NO7)(對于小鼠來源的NEMO)以及NEMO的CC2區(qū)域(SEQ ID NO14)或NEMO的LZ區(qū)域(SEQ ID NO16)(對于人來源的NEMO)的DNA序列或其片段。本領(lǐng)域人員知道上面所提及的DNA序列可以依據(jù)于小鼠來源的NEMO(SEQID NO11)和人來源的NEMO(SEQ ID NO17)的全長DNA序列，以及據(jù)此可以用這些序列查明本發(fā)明的這些序列的范圍。
以相同的方式，本發(fā)明還涉及與編碼NEMO的CC2區(qū)域(SEQ IDNO3)或NEMO的LZ區(qū)域(SEQ ID NO7)(對于小鼠來源的NEMO)以及NEMO的CC2區(qū)域(SEQ ID NO14)或NEMO的LZ區(qū)域(SEQ IDNO16)(對于人來源的NEMO)的DNA序列或其片段雜交的DNA序列。
此外，本領(lǐng)域人員也知道作為“有義突變”的蛋白中的保守氨基酸取代例如用丙氨酸對甘氨酸的取代或谷氨酸對天冬氨酸的取代不會造成蛋白活性的任何根本的變化，即它們在功能上是中性的。也知道蛋白的N或C末端的變化基本上不會損害蛋白的功能，并且甚至可能穩(wěn)定所述的功能。
以相同的方式，本發(fā)明也涉及與編碼NEMO的CC2區(qū)域(SEQ IDNO3)或NEMO的LZ區(qū)域(SEQ ID NO7)(對于小鼠來源的NEMO)以及NEMO的CC2區(qū)域(SEQ ID NO14)或NEMO的LZ區(qū)域(SEQ IDNO16)(對于人來源的NEMO)的DNA序列或其片段雜交的DNA序列。本發(fā)明也涉及利用從編碼NEMO的CC2區(qū)域(SEQ ID NO3)或NEMO的LZ區(qū)域(SEQ ID NO7)(對于小鼠來源的NEMO)以及NEMO的CC2區(qū)域(SEQ ID NO14)或NEMO的LZ區(qū)域(SEQ ID NO16)(對于人來源的NEMO)的DNA序列或其片段所產(chǎn)生的寡核苷酸引物通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)所生成的DNA序列。這種類型的寡核苷酸的長度通常為至少15個核苷酸。
術(shù)語“嚴(yán)格條件”或“嚴(yán)格雜交條件”包括指的是在該條件下，多核苷酸將與其靶序列以比其他序列可檢測到的更高程度雜交(例如，比背景至少高2倍)。嚴(yán)格條件是序列依賴性的并且在不同的環(huán)境中可以有所不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可以鑒定出與探針100％互補(bǔ)的靶序列(同源探查)?；蛘?，可以調(diào)整嚴(yán)格條件以容許序列中的錯配，這樣可以檢測出更低程度的相似性(異源探查)。
嚴(yán)格條件通常是那些鹽濃度小于約1.5M Na離子(在pH為7.0到8.3時，通常為約0.01到1.0M Na離子濃度(或其他鹽))和溫度至少是約30℃(短探針，例如10到50個核苷酸)以及至少是約60℃(長探針，例如超過50個核苷酸)的條件。通過加入去穩(wěn)定劑例如甲酰胺也可以實現(xiàn)嚴(yán)格條件。舉例說明的低嚴(yán)格條件包括用30到35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液在37℃下雜交，以及用1X到2XSSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M枸櫞酸鈉)在50到55℃下洗滌。舉例說明的中度嚴(yán)格條件包括在40到45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS溶液中在37℃下雜交，以及用0.5X到1X SSC在55到60℃下洗滌。舉例說明的高度嚴(yán)格條件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS在37℃下雜交，以及用0.1X SSC在60到65℃下洗滌。
特異性通常是雜交后洗滌的函數(shù)，關(guān)鍵因素是離子強(qiáng)度和最終洗滌溶液的溫度。對于DNA-DNA雜交，從Meinkoth和Wahl的方程式(Anal.Biochem.，138267-284(1984))Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L中可以近似得到Tm；其中M是單價陽離子的摩爾濃度，％GC是DNA中的鳥嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比；％form是雜交溶液中的甲酰胺的百分比，以及L是雜交體的堿基對的長度。Tm是其中50％的互補(bǔ)靶序列與完全匹配探針雜交時的溫度(在給定的離子強(qiáng)度和pH值下)。每1％錯配使得Tm降低約1℃；因此，可以調(diào)整Tm、雜交和/或洗滌條件使得與所需相同性的序列發(fā)生雜交。例如，如果要尋找有著近似90％相同性的序列，可以降低Tm 10℃。在給定的離子強(qiáng)度和pH值下，所選定的嚴(yán)格條件通常比特異序列及其互補(bǔ)序列的熱熔點(diǎn)(Tm)約低5℃。但是，高度嚴(yán)格條件可以利用在比熱熔點(diǎn)(Tm)低1、2、3或4℃下進(jìn)行雜交和/或洗滌；中度嚴(yán)格條件可以利用在比熱熔點(diǎn)(Tm)低6、7、8、9、或10℃下進(jìn)行雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格條件可以利用在比熱熔點(diǎn)(Tm)低11、12、13、14、15或20℃下進(jìn)行雜交和/或洗滌。利用方程式、雜交和洗滌組成、以及所需的Tm，本領(lǐng)域的一般人員明白這內(nèi)在地描述了雜交和/或洗滌溶液的嚴(yán)格性的變異。如果所需程度的錯配使得Tm小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，優(yōu)選地增加SSC濃度使得可以使用更高的溫度。在Molecular Biology，Chapter 2，Ausubel，et al.，Eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(2000)中可以找到對核酸雜交的詳細(xì)指南。
因此，根據(jù)上述的信息，本領(lǐng)域人員可以鑒定并分離和/或純化多核苷酸，其與本多核苷酸基本上相似。在這樣分離到的這些多核苷酸中，可以將多核苷酸用作例如抑制NF-κB途徑的多核苷酸。
本發(fā)明的一個實施方式是篩選與本發(fā)明的多核苷酸基本上同源的多核苷酸的方法，優(yōu)選地是那些編碼具有抑制NF-κB途徑的能力的蛋白的多核苷酸。
本發(fā)明的多核苷酸序列可以被攜帶于一種或多種合適的質(zhì)粒載體上，如在植物等領(lǐng)域所已知的那樣。
在一個實施方式中，用適合于細(xì)胞類型的合適載體將其攜帶在細(xì)菌或真菌的菌株上，這對于繁殖多核苷酸可能是有益的。在這些細(xì)胞類型中繁殖多核苷酸并生成蛋白的常見方法在本領(lǐng)域是已知的，以及在例如Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York(1982)and Sambrook et al.，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork(1989)中有所描述。
依據(jù)SEQ ID NO3(NEMO蛋白的CC2區(qū)域，即SEQ ID NO12的246-286位氨基酸)和SEQ ID NO7(NEMO蛋白的LZ區(qū)域，即SEQ IDNO12的390-412位氨基酸)描述上述的實施方式，其中SEQ ID NO12是小鼠來源的NEMO。還根據(jù)SEQ ID NO14和SEQ ID NO16(兩者都來源于SEQ ID NO18，人來源的NEMO)描述了上述的實施方式。但是，要明白本發(fā)明優(yōu)選地提供了NEMO蛋白的肽衍生物，它可以被內(nèi)吞到真核細(xì)胞內(nèi)。通過NEMO肽衍生物、或其同源物與具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的多肽的融合可以傳導(dǎo)對NEMO衍生物的內(nèi)吞作用。熟練人員可以容易地知道術(shù)語“高轉(zhuǎn)導(dǎo)能力”在此意思是多肽和其融合蛋白容易橫穿細(xì)胞膜，使得融合肽被內(nèi)吞到細(xì)胞環(huán)境內(nèi)。具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的肽的實例包括Antennapedia/penetratin蛋白(Ant)(Prochiantz，2000，Curr.Opin.CellBiol.)的第三螺旋、TAT來源肽(Fawel，1994，P.N.A.S.)、來自HSV-1的VP22(Stroh C.2003，Oncogene)、Pep1(Morris，2001，Nature Biotech.)。
為了舉例說明本發(fā)明以及其用處，本發(fā)明者已經(jīng)將SEQ ID NO3和SEQ ID NO7與內(nèi)吞肽Ant(SEQ ID NO1)融合，兩者被短SKGMQ連接子(SEQ ID NO9)或LKAQADI連接子(SEQ ID NO10)所分離。所形成的Ant-CC2構(gòu)建體具有序列CRQIKIWFQNRRMKWKKSKGMQLEDLRQQLQQAEEALVAKQELIDKLKEEAEQHKIV(SEQ ID NO2)，其中已經(jīng)加入了N末端的半胱氨酸，用于結(jié)合熒光團(tuán)以促進(jìn)對內(nèi)吞作用和/或抑制的檢測。所形成的Ant-LZ構(gòu)建體具有序列CRQIKIWFQNRRMKWKKLKAQADIYKADFQAERHAREKLVEKKEYLQEQLEQLQREFNKL(SEQ ID NO6)，其中已經(jīng)加入了N末端的半胱氨酸，用于結(jié)合熒光團(tuán)以促進(jìn)對內(nèi)吞作用和/或抑制的檢測。
在本發(fā)明中，N末端的半胱氨酸是一種任選的添加，例如可以從最終的抑制肽中刪除這個殘基。另外，在本發(fā)明中，具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的肽(例如Ant)與CC2或LZ肽之間的連接子可以是不同的序列和/或長度，只要連接子序列沒有顯著地減弱CC2或LZ肽的抑制性能。為此，連接子的長度范圍可以是1-35個氨基酸，優(yōu)選地是2-25個氨基酸，最優(yōu)選地是4-10個氨基酸。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方式中，連接子序列是SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的序列。
如上所述，要明白CC2的同源肽優(yōu)選地保留卷曲螺旋結(jié)構(gòu)以及LZ的同源肽優(yōu)選地保留螺旋基序結(jié)構(gòu)，既便在如上所述的融合構(gòu)建體中也是如此。這樣，本發(fā)明包括在上面的同源性規(guī)定范圍之內(nèi)的SEQ IDNO2和SEQ ID NO6(小鼠來源)以及SEQ ID NO13和SEQ ID NO15(人來源)的同源肽，并且所述的同源肽分別保留了CC2和LZ的結(jié)構(gòu)以及抑制NF-κB途徑的能力。
在本發(fā)明的一個實施方式中，本發(fā)明者探討了野生型NEMO的N末端結(jié)構(gòu)域，特別是在圖1A中所示的NLM保守基序(SEQ ID NO12的293-322位殘基)。至此，生成了下面的序列(見表1的相應(yīng)序列)NLM-DR(SEQ ID NO30)Ant.NLM-DR(SEQ ID NO31)Tat NLM-DR(SEQ ID NO32)R7-NLM-DR(SEQ ID NO33)R9-NLM-DR(SEQ ID NO34)NLM-DR是一種來源于在圖1A所設(shè)定的更大的30個氨基酸的保守NLM基序的21個氨基酸“基序”(以及對應(yīng)的覆蓋相同的氨基酸范圍的野生型NLM)。NLM-DR已經(jīng)是野生型NLM序列的突變形式，其中野生型序列中的11位殘基上的天冬氨酸已經(jīng)被精氨酸所取代(見表1和SEQID NO30)。如結(jié)構(gòu)研究所確認(rèn)的，選擇出這個突變，因為所形成的多肽將促進(jìn)分子內(nèi)形成鹽橋連接，容許穩(wěn)定螺旋形式的肽。
從圓二色性研究(CD)中，發(fā)現(xiàn)CC2和LZ肽都采用螺旋結(jié)構(gòu)，并依賴于它們的濃度。CC2形成了比LZ更為穩(wěn)定的螺旋。RMN和RayonX衍射研究已經(jīng)確認(rèn)了CC2的結(jié)構(gòu)。通過CD研究，NLM-DR肽一直被構(gòu)建作為比野生型肽更為穩(wěn)定的螺旋。
盡管在這個實施例中所利用的多肽為21個氨基酸長度，但是在本發(fā)明中要關(guān)注的是NLM片段的可操作的大小可以短到15個氨基酸。另外，任何能增強(qiáng)螺旋性以及肽與其分子靶點(diǎn)之間的分子之間相互作用的NLM多肽序列內(nèi)的突變將是特別有意義的，并在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在本發(fā)明中，推測Antennapedia介導(dǎo)的肽單聚體化可能是關(guān)鍵的。具體地，推測單聚體化容許它們干擾NEMO寡聚化。
核因子-κB(NF-κB)信號傳導(dǎo)是一種必需的信號途徑，它涉及炎癥應(yīng)答、腫瘤形成、病毒感染、細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)；以及對抗原刺激的B和T淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)(Ghosh，1998，Annu.Rev.Immunol.；Karin，1999，J.Biol.Chem.；Israel，2000，Trends Cell Biol.；Santoro，2003，EMBOJ..)。這樣，本發(fā)明的肽可用于調(diào)控和/或治療炎癥應(yīng)答、腫瘤形成、病毒感染；調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡；以及調(diào)節(jié)抗原刺激的B或T淋巴細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了一種治療所述病變的方法，通過給有治療需要的對象施用本發(fā)明的肽。
在本發(fā)明中，“有治療需要的對象”可以是人、家養(yǎng)動物、農(nóng)場動物、或一般在野地發(fā)現(xiàn)的動物。例如，對象可以選自人、狗、貓、馬、牛、小鼠、豚鼠、羊、豬等。
所施用的肽的量清楚地依賴于其所被施用的對象。對于對象是人的情況，所施用的肽的量將依賴于各種因素，包括患者的年齡、病變的嚴(yán)重度以及患者的既往病史，并且一直都在給藥醫(yī)師的合理判斷之內(nèi)。單次或分開劑量施用給人或其他哺乳動物的本發(fā)明的化合物的總的每日劑量可以是單次或多次劑量的例如從0.1mg/Kg/天到30mg/Kg/天的肽的量，優(yōu)選地是從0.1mg/Kg/天到20mg/Kg/天的肽的量，更優(yōu)選地是從0.1mg/Kg/天到10mg/Kg/天肽的量。單次劑量組合物可以包含這些量或其約數(shù)以補(bǔ)足每日劑量。在一個優(yōu)選的實施方式中，優(yōu)選劑量是每日兩次施用10mg/患者。在特別優(yōu)選的實施方式中，施用途徑是靜脈內(nèi)施用。
也可以施用本發(fā)明的肽作為一種藥物施用組合物的成分。換句話說，肽可存在于用于施用給有治療需要的對象的劑型中。本發(fā)明的肽可以是用于抑制NF-κB途徑或用于治療炎癥應(yīng)答、腫瘤形成、病毒感染、細(xì)胞增殖和凋亡以及調(diào)節(jié)抗原刺激的唯一的活性成分?；蛘撸窘M合物也可以含有一種或多種可以用于治療相同的病變的化合物。本發(fā)明的肽也可以是在組合物中，該組合物包含一種或多種用于治療非NF-κB途徑所引起的疾病的化合物。
可以單獨(dú)地或聯(lián)合一種或多種可藥用載體施用治療有效量的適合于本發(fā)明施用的肽。術(shù)語“可藥用載體”在此意思是無毒的、惰性的固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、裝膠囊材料或任何類型的輔助劑型?？梢杂米骺伤幱幂d體的材料的一些實例是糖例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；西黃蓍膠粉；麥芽；明膠；滑石粉；賦形劑例如可可脂和栓劑蠟；油例如花生油、棉花籽油、紅花油、芝麻油、玉米油和大豆油；乙二醇例如丙二醇；酯例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；緩沖劑例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；海藻酸；無熱原水；等張鹽水；Ringer液；乙醇和磷酸緩沖液、以及其他的無毒性的兼容的潤滑劑例如月桂硫酸鈉和硬脂酸鎂、以及顯色劑、釋放劑、包被劑、甜化劑、調(diào)味劑和芳香劑、防腐劑和抗氧化劑也可以存在于組合物中，根據(jù)制劑者的判斷。
可以將適合于在本發(fā)明中施用的藥物組合經(jīng)口服、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、腸外(例如肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下注射、或植入)、經(jīng)腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹腔內(nèi)、舌下、局部(例如作為粉劑、軟膏、或滴劑)、口腔內(nèi)、經(jīng)口噴霧、或經(jīng)鼻噴霧施用給人和其他的動物。可以以適合于每種施用途徑的劑型制成藥物組合物。
用于口服施用的液體劑型包括可藥用的乳劑、微乳劑、溶液、懸浮液、糖漿和酏劑。除了活性NEMO衍生多肽之外，液體劑型可以含有本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑。惰性稀釋劑可以包括水或其他溶劑、穩(wěn)定劑和乳化劑例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯乙醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁烯乙二醇、而甲基酰胺、油(特別是，棉花籽油、落花生油、玉米油、芽孢油、橄欖油、蓖麻油、和芝麻油)、甘油、2-四氫呋喃甲醇、聚乙二醇和山梨糖的脂肪酸酯、以及它們的混和物。用于口服施用的液體劑型也可以包含佐劑，其包括濕化劑、乳化劑和懸浮劑、甜化劑、調(diào)味劑和芳香劑。用于口服施用的其他劑型包括例如在存在無毒性的懸浮劑例如羧甲基纖維素鈉的水媒介中含有活性NEMO衍生多肽的水懸浮液，以及在合適的植物油例如花生油中含有本發(fā)明的NEMO衍生多肽的油性懸浮液。
根據(jù)已知技術(shù)利用合適的分散劑或濕化劑及懸浮劑可以制劑成可注射制劑例如無菌可注射的水性或油性懸浮液。無菌可注射制劑也可以是一種無毒的可腸外使用的稀釋劑或溶劑的無菌的可注射溶液、懸浮液或乳劑(例如1，3-丁二醇溶液)。在可用的載體和溶劑中，可以被采用的是水、Ringer液、U.S.P.和等張氯化鈉溶液。另外，無菌的、非揮發(fā)性油通常被用作一種溶劑或懸浮介質(zhì)。為此目的，可以采用任何溫和的非揮發(fā)性油，包括合成的甘油單酯或雙酯。另外，在注射劑的制備中可以使用脂肪油例如油酸。
例如可以經(jīng)截菌濾器通過過濾、或者可以通過與無菌固體組合物形式的滅菌劑(在使用之前，可以將其溶解或分散在無菌水或其他的無菌可注射介質(zhì)中)結(jié)合將可注射制劑滅菌。
為了延長發(fā)明的NEMO衍生多肽的作用，常常需要減慢皮下或肌肉內(nèi)注射的肽的吸收。通過使用具有弱水溶性的晶體或非晶體物質(zhì)的液態(tài)懸浮液可以實現(xiàn)這一點(diǎn)。那么NEMO衍生多肽的吸收率將依賴于它的溶解率，這可以依次地依賴于晶體大小和晶體形式。或者，將藥物溶解或懸浮在油性載體中可以實現(xiàn)腸外施用的NEMO衍生多肽形式的延遲吸收。通過形成NEMO衍生多肽的可生物降解聚合物(例如聚乳酸-聚乙醇酸交酯)的微膠囊化基質(zhì)可以制成可注射的長效劑型。依據(jù)NEMO衍生多肽與聚合物的比例以及所采用的特殊聚合物的性質(zhì)，可以控制NEMO衍生多肽釋放的速率。其他生物可降解聚合物的實例包括多正酯類和聚酐。通過將NEMO衍生多肽裝入與身體組織相兼容的脂質(zhì)體或微乳劑，也可以制備長效的可注射劑型。
用于經(jīng)直腸或陰道施用的組合物優(yōu)選地是栓劑，通過混和本發(fā)明的NEMO衍生多肽與合適的非刺激性的賦形劑或載體例如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟可以制備這些栓劑，這些賦形劑或載體在室溫下是固體，而在體溫下是液體，因此可以溶解在直腸或陰道腔內(nèi)并釋放出肽。
用于口服施用的固體劑型包括膠囊、片劑、藥丸、小球粒(prill)、粉劑和顆粒。在這些固體劑型中，將肽與至少一種惰性的、可藥用的賦形劑或載體混和。另外，固體劑型可以含有一種或多種添加劑、填充劑、粘合劑、濕化劑、崩解劑、阻滯劑、促吸收劑、濕潤劑、吸收劑、或潤滑劑。合適的添加劑或填充劑的實例包括淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、和硅酸、檸檬酸鈉和磷酸二鈣。合適的粘合劑的實例包括微晶纖維素、羧甲基纖維素、海藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯酮、蔗糖和阿拉伯膠。甘油是合適的濕化劑的實例。合適的崩解劑的實例包括瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、玉米淀粉、海藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉。石蠟是合適的延緩溶解劑的實例。任何季銨化合物都可以作為促吸收劑。合適的濕潤劑的實例包括十六醇和單硬脂酸甘油酯。合適的吸收劑的實例包括高嶺土和膨潤粘土。合適的潤滑劑的實例包括滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂硫酸鈉。對于膠囊、片劑和藥丸而言，劑型也可以包括緩沖劑。
如果需要，利用已知的方法和賦形劑可以將片劑包衣，其可以包括利用例如羧丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯的腸溶包衣。按本領(lǐng)域人員已知的方式可以將片劑制劑，使得能獲得本發(fā)明的NEMO衍生多肽的持續(xù)釋放。如果需要，用已知方法可以給這些片劑提供腸溶包衣，例如通過使用醋酸鄰苯二甲酸纖維素。它們可以任選地含有遮光劑，并且它們可以是一種組合物，它們僅僅或優(yōu)選地在腸道的某一部分釋放出活性成分，任選地以延遲的方式?？梢允褂玫陌窠M合物的實例包括聚合物質(zhì)和蠟。
相似地，用已知的方法可以制備膠囊例如硬的或軟的明膠膠囊(含有活性肽以及有或沒有添加的賦形劑)，如果需要，用已知的方式可以給其提供腸溶包衣。利用已知方法可以將膠囊的內(nèi)容物制劑成能給出活性NEMO衍生多肽的持續(xù)釋放。在這些固體劑型中，可以將活性NEMO衍生多肽與至少一種惰性稀釋劑例如蔗糖、乳糖或淀粉混和。在正常的實踐過程中，這些劑型也可以包括除惰性稀釋劑以外的附加物，例如壓片潤滑劑和其他壓片輔助物例如硬脂酸鎂和微晶纖維素。對于膠囊、片劑和藥丸而言，劑型也可以包括緩沖劑。它們可以任選地含有遮光劑，以及它們可以是一種組合物，它們僅僅或優(yōu)選地在腸道的某一部分釋放出活性成分，任選地以延遲的方式?？梢允褂玫陌窠M合物的實例包括聚合物質(zhì)和蠟。
利用這些賦形劑例如乳糖或奶糖以及高分子量的聚乙二醇等等，也可以將相似類型的固體組合物用作軟的和硬填充的明膠膠囊中的填充劑。
如果需要，本明的NEMO衍生多肽可以與緩釋或靶向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)例如聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和微球體等結(jié)合。例如通過經(jīng)截細(xì)菌濾器的過濾，或者通過與無菌固體組合物形式的滅菌劑(在使用之前，可以將它們即刻溶解在無菌水或一些其他的無菌注射介質(zhì)中)的結(jié)合可以將它們滅菌。
可以將NEMO衍生多肽制劑成顆粒，有或沒有附加的賦形劑。顆?？梢员换颊咚苯訑z入或在攝入之前它們可以被添加到合適的液體載體(例如水)中。顆?？梢院斜澜鈩鐝囊环N酸和一種碳酸鹽或碳酸氫鹽結(jié)合所形成的泡騰劑，以促進(jìn)在液體介質(zhì)中的分散。
用于局部或經(jīng)皮施用本發(fā)明的肽的劑型包括軟膏、糊劑、乳膏、洗劑、膠、粉劑、溶液、噴霧劑、吸入劑或貼片。經(jīng)皮貼片具有額外的優(yōu)點(diǎn)，即為身體提供了肽的可控轉(zhuǎn)運(yùn)。或通過提供速率可控膜或通過將肽分散在聚合物基質(zhì)或膠中可以控制速率。在無菌條件下，可以將活性成分與一種可藥用載體或任何所需的防腐劑或緩沖劑(如果需要)混和。將肽溶解或分散在合適的介質(zhì)中可以制成這樣的劑型。也可以使用吸收增強(qiáng)劑以增加肽穿透皮膚。眼科劑型、滴耳劑、眼膏、粉劑和溶液也是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
用于局部施用的劑型可以包括一種基質(zhì)，本發(fā)明的藥用的NEMO衍生多肽可分散于其中，這樣使得肽可以與皮膚接觸，以便經(jīng)皮施用肽。通過混和藥用的活性NEMO衍生多肽與局部載體(例如動物和植物脂肪、油、凡士林油、蠟、石蠟、淀粉、西黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨潤粘土、硅酸、滑石粉和氧化鋅、或它們的混和物)，以及與強(qiáng)的經(jīng)皮促進(jìn)劑例如二甲基亞砜或丙二醇一起可以制備出合適的經(jīng)皮組合物?；蛘?，活性NEMO衍生多肽可以被分散在可藥用的糊劑、乳膏、膠或軟膏基質(zhì)中。在局部用劑型中所含有的活性NEMO衍生多肽的量將是使得在局部用劑型預(yù)期被用于皮膚之上的時間段內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)出治療有效量的肽的量。
除本發(fā)明的NEMO衍生多肽以外，粉劑和噴霧劑可以含有賦形劑例如乳糖、滑石粉、硅酸、氫氧化鋁、硅酸鈣和聚酰胺粉末、或這些物質(zhì)的混和物。噴霧劑可以另外含有常用的推進(jìn)劑例如氯氟代烴?？梢詫⒅委熁钚缘腘EMO衍生多肽制劑成一種組合物，它可以被作為氣溶膠分散到患者的口腔或鼻腔內(nèi)?？梢詮谋媒M件或者從含有揮發(fā)性推進(jìn)劑的加壓組件中施用這些氣溶膠。
也可以通過或從外在來源的連續(xù)輸注(例如通過靜脈內(nèi)輸注)或從放置在身體內(nèi)的NEMO衍生多肽的來源的連續(xù)輸注施用在本發(fā)明的方法中所用的治療活性的NEMO衍生多肽。內(nèi)在來源包括含有NEMO衍生多肽的植入型儲存藥盒，例如通過滲透可以持續(xù)地釋放出所輸注的多肽，以及植入物可以是(a)一種例如非常保守的水溶性衍生物(例如十二烷酸鹽或親脂酯)形式的液體例如所輸注的肽的油性懸浮液，或者可以是(b)一種所輸注的NEMO衍生多肽的植入支持物形式的固體，例如合成樹脂或蠟狀材料。支持物可以是含有全部量的肽的單一體，或一系列的多個體，每個都含有部分量的所轉(zhuǎn)運(yùn)的肽。在內(nèi)在來源中所存在的活性肽的量應(yīng)當(dāng)是使得在一段長時間內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)了治療有效量的肽的量。
本發(fā)明也涉及有效量的組合物在制備用于調(diào)控或治療有治療需要的對象中由NF-κB信號途徑所調(diào)節(jié)的疾病的藥物中的用途，組合物包括本發(fā)明的多肽融合構(gòu)建體以及一種或多種可藥用載體或賦形劑。
根據(jù)所述用途的一個有利的實施方式，由NF-κB信號途徑所調(diào)節(jié)的所述疾病選自由炎癥應(yīng)答、腫瘤形成、和病毒感染所組成的組。
本發(fā)明也涉及有效量的組合物在制備用于調(diào)節(jié)有治療需要的對象中的細(xì)胞增殖或凋亡的藥物中的用途，組合物包括本發(fā)明的多肽融合構(gòu)建體以及一種或多種可藥用載體或賦形劑。
本發(fā)明也涉及有效量的組合物在制備用于調(diào)節(jié)有治療需要的對象中的抗原刺激的B或T淋巴細(xì)胞的藥物中的用途，組合物包括本發(fā)明的多肽融合構(gòu)建體以及一種或多種可藥用載體或賦形劑。
根據(jù)所述用途的一個有利的實施方式，所述對象是人。
根據(jù)所述用途的另一個有利的實施方式，所述的有效量的范圍從0.1mg/Kg/天到30mg/Kg/天。
根據(jù)所述用途的另一個有利的實施方式，用從由口服、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、腸外、經(jīng)腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹腔內(nèi)、舌下、局部用、和口腔內(nèi)施用所組成的組中選出的方式施用所述的組合物。
根據(jù)所述用途的另一個有利的實施方式，優(yōu)選地靜脈內(nèi)施用所述的組合物。
本發(fā)明還提供了一種鑒定調(diào)控NEMO寡聚化的多肽的方法，通過a)鑒定出侯選多肽序列；b)通過經(jīng)間隔序列將所述的侯選多肽序列與具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的多肽連接生成了多肽融合構(gòu)建體；c)將細(xì)胞培養(yǎng)物與多肽融合構(gòu)建體接觸；和d)檢測NF-κB信號途徑的活性；e)比較存在所述多肽融合構(gòu)建體時的NF-κB信號途徑的活性與沒有所述多肽融合構(gòu)建體時的NF-κB信號途徑的活性，以確定所述多肽融合構(gòu)建體造成的相對抑制；和f)將所述多肽融合構(gòu)建體造成的相對抑制與NEMO寡聚化相關(guān)聯(lián)。
在這個方法中，侯選多肽序列優(yōu)選地具有卷曲螺旋或螺旋結(jié)構(gòu)。更優(yōu)選地，侯選多肽序列具有20-60個氨基酸。來源于NEMO的候選多肽序列也是優(yōu)選的。
如在上面的實施方式中所說明的那樣，間隔序列的長度范圍可以為1到35個氨基酸，但是也可以采用更短的長度(見上)。間隔序列的實例包括SEQ ID NO9和SEQ ID NO10。另外，具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的多肽的實例是具有氨基酸序列SEQ ID NO11的多肽。
在一個優(yōu)選的實施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)物含有已經(jīng)被NF-κB依賴性β-半乳糖糖苷酶報道基因所轉(zhuǎn)染的前B 70Z/3淋巴細(xì)胞。
為了確定多肽融合構(gòu)建體的確已經(jīng)結(jié)合到細(xì)胞培養(yǎng)物所含的細(xì)胞內(nèi)，要求多肽融合構(gòu)建體具有N末端的半胱氨酸殘基。這樣，通過半胱氨酸殘基與熒光團(tuán)(例如，BODIPY)的化學(xué)反應(yīng)可以標(biāo)記多肽融合構(gòu)建體，使得能通過例如FACS的技術(shù)監(jiān)測細(xì)胞攝取。
因此，鑒定調(diào)控NEMO寡聚化的多肽的方法也可以包括下面的步驟b-1)標(biāo)記所述的多肽融合構(gòu)建體；和c-1)監(jiān)測對標(biāo)記的多肽融合構(gòu)建體的細(xì)胞攝取。
另外，通過用標(biāo)記肽顯示NEMO在體內(nèi)與肽相結(jié)合的破壞試驗(pull down experiment)，本領(lǐng)域人員也能將NF-κB途徑抑制與NEMO寡聚化的調(diào)控相關(guān)聯(lián)?？梢悦枋雠c該肽相結(jié)合的NEMO蛋白的寡聚化狀態(tài)(交聯(lián)、凝膠過濾)。在體外，熒光Antennapedia標(biāo)記的CC2或LZ肽與CC2或LZ肽相結(jié)合(模擬NEMO寡聚化)所造成的各向異性抑制的增加也能被用于測試在體內(nèi)抑制NF-κB途徑的化合物。
已經(jīng)概括地描述了本發(fā)明，通過參照某些特殊的實施例可以獲得更多的了解，除非有其他的說明，實施例在此僅僅是作為舉例說明的目的，其無意于限制本發(fā)明。
實施例材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和細(xì)胞株在Courtois等(1997Mol.cell.Biol.)中描述了小鼠前B 70Z/3的生長條件。如在Courtois等中所述的，用質(zhì)粒cx12lacZ-kB(G.R.Crabtree的饋贈)經(jīng)電穿孔制備70Z3-C3穩(wěn)定細(xì)胞株，在其IL-2啟動子上攜帶有三個串連拷貝的NF-κB位點(diǎn)(Fiering et al.，1990)，人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Y79購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫(Manassas，VA)，并將其培養(yǎng)在加有100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和10％胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培養(yǎng)基中。
FACS分析將0.5ml 0.5×106個70Z/3-C3細(xì)胞和如圖示中所示的不同濃度的肽在37℃下培養(yǎng)不同的時間。將細(xì)胞懸浮液在室溫下1000xg離心，然后用PBS緩沖液(1ml)洗滌細(xì)胞沉淀物3次，并最后將其重新懸浮在500μl含有0.1％疊氮鈉的PBS緩沖液中。用FACSabliur(BD生物科學(xué))進(jìn)行熒光分析，選擇每個標(biāo)本的最小15,000個事件。所有試驗都進(jìn)行兩次。
肽的分析和純化如Mousson等在2002年(Biochemistry，41 p13611-p13616)中所述的那樣，利用連續(xù)流式Fmoc/tBu化學(xué)(Chan，WC，and White，P.D.(2000)；Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis.A pratical approach)在AppliedBiosystems(Foster City，CA)Pioneer肽合成器上合成肽。所有化學(xué)試劑都購自Applied Biosystems。用乙?；钄嚯牡腘末端，并用氨基阻斷C末端。為了隨后的特異性標(biāo)記(見表1)，將單個額外的半胱氨酸殘基結(jié)合到肽的N末端。
表1NEMO衍生肽的序列
(1)在所有的肽中，N末端都含有一個半胱氨酸，以便于特異肽與馬來酰亞胺基團(tuán)的結(jié)合，如在“材料和方法”中所述的那樣。用黑體突出顯示與NEMO序列(純文本)融合的Antennapedia、TAT和多精氨酸(R7或R9)的序列?？赡苌婕熬砬菪蛄械臍埢孟聞澗€標(biāo)出，用黑體及下劃線標(biāo)出在CC2和LZ突變體中以及在NLM-DR中被取代的殘基。B＝Bodipy(C末端的Bodipy修飾已經(jīng)被從在序列列表中所示的序列中刪除)。在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，可以去除并如在此所述的施用Bodipy和/或N末端半胱氨酸。
利用逆相中壓液相層析法，用0.08％三氟醋酸(TFA)水溶液(pH2.0)中的線性梯度的乙腈(1％/分鐘)以18ml/min的流速進(jìn)行60分鐘，在Nucleoprep 20μM C18 100制備柱上直接對粗肽進(jìn)行純化。利用0.08％TFA水溶液(pH2.0)中的線性梯度的乙腈(0.5％/分鐘)以1ml/min的流速進(jìn)行20分鐘，在Nucleosil 20μM C18 300分析柱上驗證肽的純度。熒光團(tuán)bodipyFL N-(2氨乙基)馬來酰亞胺(Molecular Probes)與巰基的綴合是在等摩爾條件下(pH6)和50mM乙酸銨緩沖液中進(jìn)行30分鐘(暗處)。然后將混和物裝柱到Nucleoprep 20μM C18 100制備柱上以純化BOPIDY綴合的肽。在細(xì)胞死亡試驗中，用碘乙酰胺處理所有的沒有被BODIPY標(biāo)記的肽以阻止半胱氨酸殘基的任何氧化。然后用氨基酸分析定量所有的純化肽，并用陽離子電噴霧電離質(zhì)譜法(ES+)最終鑒定。一旦用質(zhì)譜法驗證了肽的完整性以及綴合效率，在505nm或在280nm處(當(dāng)肽含有芳香族殘基時)測定肽的消光系數(shù)(見表1)。通過測定肽在280nm和在505nm處的吸光度以及計算吸光率定期地監(jiān)測標(biāo)記的穩(wěn)定性。將所有的肽溶解在水中，儲存濃度為2mM。
NF-κB抑制撿測法在第一種操作中，將220μl加有10％胎牛血清(FCS)和50μM β-巰基乙醇的RPMI 1640的2.2×105個70Z/3-C3細(xì)胞放置在96孔板中，并與不同濃度的肽(0到20μM)在37℃、5％CO2孵箱中一起孵育。在兩個小時之后，將相等部分的(100μl)每種細(xì)胞樣本都轉(zhuǎn)移到兩個孔中，每個孔都含有105個各種細(xì)胞。然后用終濃度為0.5μg/ml的來自流產(chǎn)沙門氏菌(Salmonella abortus)的脂多糖(Sigma)處理一部分細(xì)胞5個小時，而另一部分細(xì)胞并不被處理。在5個小時之后，將細(xì)胞在室溫下400xg離心5分鐘，然后通過離心用冷PBS(250μl)洗滌細(xì)胞沉淀物3次。然后將細(xì)胞裂解在裂解緩沖液(25mM三磷酸緩沖液，pH值為7.8，其含有8mM氯化鎂、1mM二硫赤蘚糖醇、1％Triton X-100、15％甘油和蛋白酶抑制劑混和物(Roche))中，并將樣本在4℃下離心20分鐘以澄清裂解液。然后將上清保存在冰中，然后將30μl上清用于檢測，利用galacton-star作為化學(xué)發(fā)光底物(BD Biosciences Clontech，Bronstein et al.，1989)，用板發(fā)光計(Berthold)測定β-半乳糖苷酶活性。通過將30μl裂解液與反應(yīng)緩沖液(196μl)以及BD Biosciences所提供的Galacton-star底物(4μl)混和1個小時，以便測定反應(yīng)的背景。在第二種操作以及一種更嚴(yán)格的檢測法中，在內(nèi)吞肽2個小時之后，將70Z/3-C3細(xì)胞(220μl培養(yǎng)基中的2.2×105個細(xì)胞)在室溫下400xg離心，然后通過離心用200μlPBS洗滌細(xì)胞沉淀物3次。然后用完全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞三倍，并容許細(xì)胞生長至少24個小時。下面的步驟與第一種操作一樣。
細(xì)胞死亡檢測法利用Promega所提供的MTS檢測法(CellTiter 96AQueousonesolution cell proliferation assay)進(jìn)行對細(xì)胞死亡的檢測。簡單地，在37℃，450μl 0.3×106個Y79細(xì)胞被用50μl野生型Ant-CC2和Ant-LZ肽(0.1到20μM)或它們的突變型Ant-CC2(Mu)、Ant-LZ(Mu)或Ant處理，或留在無血清的RPMI培養(yǎng)基中未處理。在孵育1或14個小時之后，然后將一部分細(xì)胞懸浮液(200μl，0.12×106個細(xì)胞)轉(zhuǎn)移到96孔板中，并與含有MTS化合物和phenazine ethosulfate的MTS溶液(40μl)混和。在兩個小時之后，利用自動化酶標(biāo)儀(Bio-TeK Instruments，INC)在490nm處的吸光率測定活細(xì)胞所生成的甲(formazan)的量。在顯微鏡下觀察細(xì)胞存活，并將其估計為未處理對照值的百分比。通過混和MTS溶液與無細(xì)胞的RPMI培養(yǎng)基確定出反應(yīng)的背景。為了增加細(xì)胞死亡檢測法的敏感性，本發(fā)明者使用無BODIPY標(biāo)記的肽，因為熒光團(tuán)的吸收譜與甲產(chǎn)物的吸收譜相重疊。所有的試驗都重復(fù)兩次，在每個試驗中，在復(fù)孔中重復(fù)每種試驗條件。
分析凝膠過濾試驗如在Traincard等(2003)所述的那樣，用過濾法確定肽的寡聚化狀態(tài)。簡單的，將500μl樣本以0.4ml/min的恒定流速裝柱到經(jīng)含有200mM NaCl和0.1mM DDM的50mM Tris-HCl(pH8.0)平衡過的Superdex 75HR 10/30柱中。在平衡緩沖液中所加入的DDM去污劑的存在使得肽在柱中的吸收被最小化，并增加了肽的回收。在相同的平衡緩沖液中，用藍(lán)dextran 2000(空體積)、二硫赤蘚糖醇(總體積)、牛血清白蛋白(67kDa，Rs＝35.2)、卵白蛋白(ovalbumine)(43kDa，Rs＝27.5)，胰糜蛋白酶原A(25kDa，Rs＝21.1)、核糖核酸酶A(13.7kDa，Rs＝16.4)、細(xì)胞色素C(12.4kDa，Rs＝17.7)和抑肽酶(6.5KDa，Rs＝13.5)標(biāo)定柱。
熒光各向異性測定用裝配有激發(fā)和發(fā)射束的起偏振鏡的PTI Quantamaster熒光計進(jìn)行各向異性測定。該裝置施用L構(gòu)型的PMT。分別用495nm和520nm的激發(fā)和發(fā)射波長在22℃，在1cm徑長的cuvette中進(jìn)行所有的試驗。將激發(fā)和發(fā)射單色器的通帶分別設(shè)定在2和4nm。將穩(wěn)態(tài)熒光各向異性表示為毫各向異性(mA)，并根據(jù)下面的公式計算(1)A＝(IVV-GIVH)/(IVV+2GIVH)；(2)G＝IHV/IHH；其中A為各向異性，G是波長依賴性扭曲(distortion)的校正系數(shù)以及I是熒光強(qiáng)度組分(下標(biāo)分別指的是在激發(fā)和發(fā)射起偏振鏡中的垂直和水平位置)。至少進(jìn)行試驗兩次，以及每個數(shù)據(jù)都是在2分鐘內(nèi)的20個記錄值的結(jié)果。在50mM含有150mM KCl的Tris-HCl緩沖液(pH8)中進(jìn)行所有的測定。本發(fā)明者驗證了在所用的BODIPY-Ant-CC2和BODIPY-Ant-LZ濃度上，濾過作用是可忽略不計的。在各向異性測定之前，將BODIPY-Ant-CC2肽在22℃單獨(dú)或與漸增濃度(1-125μM)的CC2預(yù)先孵育過夜。在各向異性測定之前，將BODIPY-Ant-LZ肽在22℃單獨(dú)或與10μM和100μM濃度的CC2預(yù)先孵育過夜(見圖7說明)。利用Kaleidagraph非線性回歸軟件(Synergy軟件，reading PA)，通過將各向異性數(shù)據(jù)全部整合到如Agou等描述的等溫結(jié)合方程(2004，J Biol Chem.)中，可估計出解離常數(shù)參數(shù)。從經(jīng)各向異性數(shù)據(jù)的下降區(qū)和平臺區(qū)所劃出的直線(圖7中的虛線)的交點(diǎn)可估計出結(jié)合化學(xué)計量。
結(jié)果對陽斷NF-κB活化的NEMO衍生肽的合理設(shè)計本發(fā)明者先前已經(jīng)證實NEMO的最小三聚體化區(qū)包括序列251到337(圖1A)。該區(qū)域可能含有兩個約35個殘基的卷曲螺旋序列，位于N末端和C末端分別被稱為CC2(殘基253-285)和LZ(301-337)。盡管還沒有確定出最小寡聚化結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，但是一些與熒光偏振聯(lián)合的生化研究提示我們提出CC2/LZ三聚體可能形成了一個六鏈的螺旋束，其包括緊密扎捆的反向平行定位的CC2和LZ卷曲螺旋(Traincard，2003)，待發(fā)表)。此外PSI-BLAST搜索發(fā)現(xiàn)NEMO的這個區(qū)域含有一個被叫做“NEMO樣基序”(NLM)的20個殘基的保守基序，四種其他的蛋白共享該保守基序包括ABIN-1(Heyninck，1999，J.Cell.Biol.)、ABIN-2/NAF(Van Huffel，2001，J.Biol.Chem)、ABIN-3/LIND(Staege，2001，Immunogenetics)和NRP/optineurin(Schwamborn，2000，J.Biol.Chem)(圖1B)。有趣的是，當(dāng)絕大多數(shù)這些包含ABIN-1(Heyninck，2003，F(xiàn)EBSLetters)、NEMO的C末端結(jié)構(gòu)域(Le Page，2001，Virology)和ABIN-2(Liu WK，2003，Biochemical Journal)或ABIN-3/LIND(Heyninck，2003，F(xiàn)EBS letters)蛋白的保守基序的蛋白在細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)時，它們都顯示出以顯性負(fù)向的方式抑制NF-κB活化。兩個其他的闡述與NF-κB相互作用的ABIN肽的參考文獻(xiàn)也都提到了這一點(diǎn)WO 99/57133和WO03/00280。
因為破壞NEMO寡聚化代表了一種用于抑制NF-κB活化的潛在的治療策略，本發(fā)明者設(shè)計了模擬CC2或LZ序列的NEMO衍生的配體肽(表1)。注意到，與CC2肽不同，LZ肽在其N末端的極遠(yuǎn)端也含有NLM基序。為了介導(dǎo)所有的肽被攝取到細(xì)胞內(nèi)，本發(fā)明者在肽的N末端綴合了一個功能性類似物，它包括來自Antennapedia/penetratin蛋白(Ant)的第三螺旋的16個氨基酸序列。該雙向螺旋作用為一種內(nèi)吞載體(Prochiantz，2000，Curr.Opin.Cell Biol.)。絕大多數(shù)Antennapedia融合肽被BODIPY熒光團(tuán)所標(biāo)記，以分析每種肽被轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)的能力。通過在N末端的極遠(yuǎn)端添加單個半胱氨酸殘基進(jìn)行特異的標(biāo)記，并用質(zhì)譜法驗證序列的完整性(見“材料和方法”以及表1)。
Antennapedia融合肽介導(dǎo)的對NEMO衍生肽的細(xì)胞攝取通過熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)監(jiān)測活細(xì)胞對BODIPY標(biāo)記的NEMO肽的攝取，這是一種用于定量細(xì)胞內(nèi)吞作用的常用方法。圖2A顯示了對經(jīng)Ant-CC2(WT)、Ant-CC2(Mu)、Ant-LZ(WT)或Ant-LZ(Mu)BODIPY-肽在37℃處理過2小時的細(xì)胞的FACS分析，并將其與那些未處理細(xì)胞以及用相同濃度的游離BODIPY或用BODIPY綴合的BSA處理的對照細(xì)胞的各向異性進(jìn)行比較。與Antennapedia肽將肽和蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)到哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的作用一致，100％70Z3-C3細(xì)胞株被四種不同的NEMO肽相似地轉(zhuǎn)導(dǎo)，說明在經(jīng)處理的細(xì)胞群內(nèi)所有的細(xì)胞都具有近似相同的細(xì)胞內(nèi)濃度的NEMO衍生的BODIPY肽。比較分析說明未處理細(xì)胞和經(jīng)BODIPY-BSA或游離BSA處理的細(xì)胞表現(xiàn)出相似的細(xì)胞熒光，驗證了我們的在FACS分析之前的充分洗滌方案能將表面結(jié)合肽在測定NEMO肽內(nèi)吞作用中的作用最小化(見“材料和方法”)。因此，這些數(shù)據(jù)說明所觀察到的細(xì)胞熒光信號主要反映了所轉(zhuǎn)導(dǎo)的NEMO肽的細(xì)胞內(nèi)濃度，并不是在細(xì)胞膜表面上的非特異性吸附。
本發(fā)明者接下來研究了細(xì)胞攝取Ant-CC2 BODIPY肽的動力學(xué)和濃度依賴性，要牢記其他NEMO肽的轉(zhuǎn)導(dǎo)也應(yīng)當(dāng)以相似的方式進(jìn)行(圖2B和2C)。在加入經(jīng)0.2、2或20μM BODIPY-Ant-CC2肽在37℃處理過的70Z3-C3細(xì)胞5個小時后的FACS分析證實了細(xì)胞內(nèi)濃度的線性依賴性是一種在文獻(xiàn)中被廣泛報道的Antennapedia融合肽的孵育濃度的函數(shù)(Lindsay，2002，Current Opinion in Pharmacology)。值得注意的是，經(jīng)20μM Ant-CC2在37℃下處理過的細(xì)胞在30分鐘時就已經(jīng)達(dá)到了最大的細(xì)胞內(nèi)濃度，并仍保持不變直到5個小時。因為，誘導(dǎo)應(yīng)答于LPS的強(qiáng)的NF-κB活化的時間需要3-5個小時的細(xì)胞處理，這些結(jié)果說明每種肽的細(xì)胞內(nèi)濃度在LPS刺激期間仍保持恒定。
細(xì)胞可通透性CC2和LZ對LPS誘導(dǎo)的NF-κB活化的特異性抑制為了分析細(xì)胞可通透性BODIPY-Ant-CC2和BODIPY-Ant-LZ肽對LPS誘導(dǎo)的NF-κB活化的抑制能力，本發(fā)明者用p12XlacZ-kB穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染了小鼠的前B 70Z3細(xì)胞株，它攜帶有在NF-κB轉(zhuǎn)錄因子控制下的β-半乳糖糖苷酶報道基因。當(dāng)用LPS(3μg/ml)處理所形成的70Z3-C3細(xì)胞株5個小時時，觀察到了LacZ基因的100倍活化，這說明我們的細(xì)胞檢測法以極好的敏感性監(jiān)測著應(yīng)答于LPS的NF-κB活化(圖3A，對照“無肽”)。有趣的是，細(xì)胞與20μM兩種NEMO衍生肽的孵育顯著地降低了NF-κB活化。這種下降在BODIPY-Ant-LZ中比在BODIPY-Ant-CC2中更為強(qiáng)烈。抑制作用是因為NEMO序列，因為含有或不含有N末端BODIPY標(biāo)記的分離的和/或純化的Antennapedia肽(BODIPY-Ant或Ant)誘導(dǎo)了與對照相同水平的NF-κB活化(圖3A)。注意在沒有LPS時所測定到的基礎(chǔ)NF-κB活性在所有的樣品中都是非常相似的，這說明CC2和LZ肽都消除了對LPS的應(yīng)答性而不影響內(nèi)在的基礎(chǔ)的NF-κB活性。這對于最小化體內(nèi)的細(xì)胞毒性是重要的，體內(nèi)的細(xì)胞毒性主要是對NF-κB抑制所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡所引起的(Chen，2003，Nature Med.)。
為了確定是否BODIPY-Ant-LZ或BODIPY-Ant-CC2肽是最有效的抑制劑，本發(fā)明者接下來測定了每種肽的濃度依賴性抑制。如在圖3B中所示，兩種NEMO肽都表現(xiàn)出對應(yīng)答于LPS的NF-κB的NF-κB劑量依賴性抑制。BODIPY-Ant-LZ比BODIPY-Ant-CC2抑制NF-κB的作用更強(qiáng)，其IC50值分別是3μM和22μM(圖3C)。這種驚人的差異可以被LZ序列中所含有的NLM基序所解釋。與NEMO靶點(diǎn)的細(xì)胞內(nèi)性質(zhì)相同，沒有與Antennapedia蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)融合的LZ和CC2肽都表現(xiàn)出與對照相同水平的活化(圖3D)，證實為了抑制NF-κB，NEMO衍生肽必須跨過細(xì)胞膜?？偠灾?，這些結(jié)果說明模擬NEMO寡聚化結(jié)構(gòu)域的兩種卷曲螺旋序列的肽是應(yīng)答于LPS的NF-κB活化的有效的肽抑制劑。
LZ和CC2卷曲螺旋的疏水核心的突變破壞了它們對NF-κB信號途徑的特異性抑制。
理論上，如果BODIPY-Ant-LZ或BODIPY-Ant-CC2肽通過與NEMO寡聚化結(jié)構(gòu)域的特異結(jié)合而抑制NF-κB活化，破壞卷曲螺旋聯(lián)系的突變因此應(yīng)當(dāng)表現(xiàn)出喪失了抑制NF-κB活化的能力。-螺旋的卷曲-螺旋相互作用已經(jīng)被廣泛地研究，并已經(jīng)很好地證實了絕大多數(shù)控制它們的特異組裝的規(guī)律(Vinson，2002，Mol.Cell.Biol.)。七個重復(fù)的第一(a)和第四位點(diǎn)(d)所代表的卷曲螺旋界面通常被疏水性氨基酸所占據(jù)。大量地排除脯氨酸或甘氨酸以保持螺旋結(jié)構(gòu)。核心的極性殘基對亮氨酸的取代是失穩(wěn)態(tài)的，尤其是變化發(fā)生在d位點(diǎn)時。考慮到這些原則，本發(fā)明者合成了一種BODIPY-Ant-LZ的變體(BODIPY-Ant-LZ(Mu))，其在d位點(diǎn)含有兩個突變L→S；以及一種BODIPY-Ant-CC2的變體(BODIPY-Ant-CC2(Mu))，其在a位點(diǎn)含有兩個突變L→G以及一個突變I→G(圖4A和4B和表1)。為了測試這些突變對對NF-κB活化的潛在抑制的作用，本發(fā)明者開發(fā)出了一種更為嚴(yán)格的細(xì)胞檢測法，它包括內(nèi)吞肽2個小時，隨后充分洗滌70Z3-C3細(xì)胞以去除細(xì)胞外培養(yǎng)基中的任何的殘余肽。容許細(xì)胞在用LPS誘導(dǎo)NF-κB活化之前生長至少24個小時。通過這種方法，排除了與受體結(jié)合的LPS相互作用的肽。與上面所述的細(xì)胞檢測法一樣，BODIPY-Ant-CC2(WT)和BODIDY-Ant-LZ(WT)也抑制了NF-κB活化，分別降低1.7和5.8倍(圖4A和4B)，當(dāng)使用的濃度為10μM時。這說明肽沒有競爭性地作用于LPS的受體結(jié)合。如預(yù)計的一樣，CC2變體(BODIPY-Ant-CC2(Mu))的存在并沒有影響NF-κB活化，因為β-半乳糖糖苷酶活性與對照中的活性相等(圖4A，無肽)。應(yīng)答于LPS，NF-κB在BODIPY-Ant LZ突變體中的活化比在野生型中更為強(qiáng)烈。但是，與BODIPY-Ant-CC2(Mu)不同，當(dāng)與對照比較時，觀察到了LZ突變體的輕微的抑制作用(15％)?？傊@些數(shù)據(jù)證實CC2和LZ突變體不能與野生型一樣有效地抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB活化。
對NF-κB活化的抑制是由LZ肽的特異性卷曲螺旋相互作用介導(dǎo)的。
利用程序MULTICOIL(Wolf，1997，Protein Science)的計算分析預(yù)測5％在排序基因組中所發(fā)現(xiàn)的所有推測的ORFs被預(yù)測都含有卷曲螺旋基序(Newman，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，以及估計蛋白中的近2-4％氨基酸都采用卷曲螺旋折疊(Berger，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA)。這種豐度帶來了一個問題，就是是否NEMO衍生的LZ肽在體內(nèi)保持了其卷曲螺旋相互作用配體的特異性。為了回答這個問題，本發(fā)明者合成了另外一種卷曲螺旋肽，其模擬GCN4亮氨酸拉鏈的序列，并測試了其抑制NF-κB活化的能力。BODIPY-Ant-GCN4在其N末端含有Antennapedia序列以及與CC2序列相同的短的SKGMQ連接子(SEQ IDNO9)，以便于肽的轉(zhuǎn)運(yùn)(表1)。在其N末端也用BODIPY標(biāo)記以使得用FACS監(jiān)測它的細(xì)胞攝取(數(shù)據(jù)沒有顯示)。GCN4肽表現(xiàn)出與NEMO的LZ序列的低的序列相似性(22％)，但是相同殘基主要都是在d位點(diǎn)上的亮氨酸(圖5)。這些殘基決定了絕大多數(shù)的影響卷曲螺旋寡聚化穩(wěn)定性的能量(Vinson，2002，Mol.Cell.Biol.)注意對卷曲螺旋特異性是重要的a位點(diǎn)(Vinson，2002，Mol.Cell.Biol)包括一組不同的氨基酸。雖然GCN4包括疏水性殘基以及常用的精氨酸殘基，而NEMO的LZ含有兩個帶電荷的氨基酸R和K(圖4B和圖5A)。因此位于卷曲螺旋界面上的這些殘基似乎決定了卷曲螺旋相互作用的選擇性。
圖5B顯示了10μM濃度的BODIPY-Ant-GCN4抑制應(yīng)答于LPS的NF-κB活化的作用。為了比較卷曲螺旋序列的作用，本發(fā)明者使用了上面所述的嚴(yán)格的細(xì)胞檢測法。與BODPY-Ant-LZ不同，BODIPY-Ant-GCN4沒有抑制NF-κB活化的能力，因為NF-κB活化的水平接近于無肽的對照的水平?？偠灾?，這些結(jié)果強(qiáng)烈地支持NEMO的LZ肽通過選擇性卷曲螺旋相互作用而抑制NF-κB活化的假說。
Antennapedia序列誘導(dǎo)NF-κB肽抑制劑的單聚體化Antennapedia序列是一種蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)，它采用了α螺旋的雙相結(jié)構(gòu)(Prochiantz，2000，Curr.Opin.Cell Biol.)。當(dāng)與象CC2或LZ的卷曲螺旋序列的N末端融合時，Antennapedia能通過經(jīng)分子內(nèi)相互作用覆蓋卷曲螺旋的疏水性界面而改變卷曲螺旋聯(lián)系。為了檢驗Antennapedia肽的N-融合對CC2和LZ肽的寡聚化性能的作用，本發(fā)明者通過凝膠過濾法分析了在其N末端含有或不含有Antennapedia序列的肽。如圖6所示，當(dāng)與球蛋白標(biāo)記物比較時，所有含有N末端融合Antennapedia的肽以對應(yīng)于它們的單體形式的洗脫體積共洗脫。注意，本發(fā)明者必須在緩沖液中加入去污劑以降低其cmc，以便提高肽回收率。當(dāng)以相同的10μM濃度被注射時，沒有Antennapedia N融合的CC2野生型和LZ野生型肽都被寡聚化。如最近所報道的(Traincard et al)，CC2(WT)形成了三聚體，而LZ(WT)形成了二聚體。和預(yù)期的一樣，當(dāng)用甘氨酸殘基取代其中三個脂肪族殘基而化學(xué)地獲得CC2突變體時，其喪失了寡聚化的能力(底下部分，虛線)。對于LZ(突變體)，在d位點(diǎn)的兩個L→S突變的作用是較弱的。但是，本發(fā)明者仍能檢測到10μM濃度的LZ突變體的二聚體化(虛線)，盡管與野生型LZ(實線)比較，突變已經(jīng)顯著地降低了二聚體的結(jié)合能力?？傊?，這些數(shù)據(jù)說明Antennapedia序列與CC2和LZ肽的N-融合改變了同型的卷曲螺旋相互作用，促進(jìn)了NEMO衍生肽的單聚體化。此外，這些數(shù)據(jù)也顯示在a和d位點(diǎn)上的殘基變化改變了LZ和CC2肽的寡聚化。因此，這可能是合成肽形成了螺旋的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。
具有和不具有N融合的Antennapedia序列的CC2和LZ肽的同型和異型相互作用。
因為N融合的Antennapedia修飾了CC2和LZ肽的寡聚化性能，本發(fā)明者接下來用熒光偏振研究了用BODIPY標(biāo)記的Ant-CC2和Ant-LZ單體是否能與缺乏Antennapedia序列的NEMO衍生肽結(jié)合。這些CC2和LZ肽也可以被認(rèn)作為細(xì)胞可通透性BODIPY-Ant-CC2和BODIPY-Ant-LZ(NF-κB抑制劑)的體內(nèi)的結(jié)合靶點(diǎn)。圖7顯示了不同濃度的CC2肽與固定濃度的BODIPY-Ant-CC2的相互作用的典型的結(jié)合等溫線。結(jié)合曲線的形狀不是S形的，說明CC2與BODIPY-Ant-CC2的結(jié)合沒有協(xié)同性。從各向異性的起始部分的切線和漸近線之間的截距中計算出的化學(xué)計量等于0.8。結(jié)合這個化學(xué)計量，解離常數(shù)KD為15.2μM。如本發(fā)明者先前所報道的(插入圖7，Traincard等)，當(dāng)用各種濃度的CC2肽滴定固定濃度的BODIPY-Ant-LZ時，也獲得了相似的結(jié)果。總之，這些數(shù)據(jù)證實Ant-CC2和Ant-LZ單體在體外都能與包括NEMO的最小寡聚化結(jié)構(gòu)域的CC2肽結(jié)合。
NF-κB抑制劑Ant-CC2和Ant-LZ能誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞死亡，而它們的突變體Ant-CC2(Mu)和Ant-LZ(Mu)卻不能。
組成性活化的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子與腫瘤形成的一些方面有關(guān)已經(jīng)變得非常清楚(Karin綜述)，這包括幾乎所有的六種導(dǎo)致正常人體細(xì)胞轉(zhuǎn)化成癌細(xì)胞的細(xì)胞生理學(xué)的基本改變(Hanahan，2000，Cell for review)。這造成了對NF-κB抑制劑用作新的抗癌治療的用途的極大關(guān)注。最近已經(jīng)報告了極有前途的結(jié)果，它們利用蛋白酶體抑制劑或SN50肽阻斷核轉(zhuǎn)移(Orlowski，2002，Trends in Molecular Medicine；Mitsiades，2002，Blood)。但是，這些藥物對NF-κB抑制的特異性已經(jīng)被置疑。Poulaki等(2002，Am J Pathol.)最近顯示用SN50肽處理人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Rb)細(xì)胞株Y79誘導(dǎo)了癌細(xì)胞的凋亡。小鼠和人NEMO蛋白的序列對比說明NEMO的最小寡聚化結(jié)構(gòu)域是嚴(yán)格保守的，提示可以在嚙齒類動物和人體細(xì)胞中觀察到相似的NF-κB抑制作用。
假定特異的NF-κB抑制可以觸發(fā)癌細(xì)胞的凋亡，本發(fā)明者檢測了細(xì)胞可通透性Ant-LZ和Ant-CC2肽對人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞存活率的作用。在這些試驗中，本發(fā)明者使用沒有N末端的BODIPY標(biāo)記的NEMO衍生多肽，以避免對MTS檢測法的任何干擾(見“材料和方法”)。如圖7所示，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了Y79細(xì)胞存活率的劑量依賴性，當(dāng)用Ant-CC2(圖8A)或Ant-LZ(圖8B)處理細(xì)胞3個小時時。Ant-LZ肽對細(xì)胞死亡的作用比Ant-CC2的作用更強(qiáng)。對細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)是明顯的，因為當(dāng)用20μM濃度的Ant-LZ和Ant-CC2肽分別處理癌細(xì)胞3個小時時，Rb細(xì)胞存活率分別是20％和65％。值得注意的是，用Ant-CC2(Mu)(圖8A)或用Ant-CC2(Mu)(圖8B)處理相同的細(xì)胞沒有誘導(dǎo)出與WT肽一樣強(qiáng)的細(xì)胞死亡。這些對細(xì)胞死亡的作用基本上要?dú)w功于NEMO序列，因為用Antennapedia肽處理Y79細(xì)胞株更長的時間也不影響細(xì)胞存活(圖8C)。相反地，當(dāng)存在5μM濃度的Ant-LZ和Ant-CC2時，分別有80％和55％的Y79細(xì)胞死亡(圖8C)?？傊@些結(jié)果說明Ant-CC2和Ant-LZ肽的特異的NF-κB抑制誘導(dǎo)了Rb細(xì)胞株的細(xì)胞死亡，確認(rèn)了特異性NF-κB抑制劑用作抗腫瘤化療的用途。
在缺乏促炎性信號時，根據(jù)MTS檢測法、在顯微鏡下的直接觀察以及從FACS分析中推論出的前向散射-FSC和側(cè)向散射-SSC參數(shù)，直到濃度為30μM時，被檢測的所有的肽對于所檢測的淋巴細(xì)胞B都沒有可檢測到的細(xì)胞毒性。但是，本發(fā)明者可以用FACS檢測到濃度依賴性方式的輕微的細(xì)胞死亡，當(dāng)在存在NEMO衍生多肽并用LPS刺激前B淋巴細(xì)胞時。在沒有刺激時，20μM濃度的Ant-CC2造成的細(xì)胞死亡的比例為9％，而在LPS刺激之后，細(xì)胞死亡的比例增加到了13％(數(shù)據(jù)沒有顯示)。這與NF-κB途徑在保護(hù)細(xì)胞避免凋亡上的作用是一致的。已經(jīng)報告具有組成性NF-κB活性的Rb細(xì)胞株Y79中的細(xì)胞死亡是更為顯著和快速的(Poulaki，2002，Am J Pathol.)。本發(fā)明在此沒有用AnnexinV標(biāo)記和TUNEL方法證實NEMO肽誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡就是真正的凋亡。然而考慮到NF-κB途徑在調(diào)節(jié)凋亡中的作用，NEMO衍生多肽所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡在其本質(zhì)上就是凋亡是有可能的。
根據(jù)上面所得到的結(jié)果，不論未來NF-κB抑制劑的性質(zhì)如何(有機(jī)的或模擬肽化合物)，靶向于NEMO寡聚化的抑制劑仍是比那些靶向于IKK激酶活性和NEMO激酶結(jié)合的抑制劑更為吸引人的和有前途的策略，因為該分子事件嚴(yán)格地依賴于促炎癥信號。因此，這些藥物將更少地干擾正常細(xì)胞中細(xì)胞存活所必需的基礎(chǔ)的NF-κB活性。
衍生自野生型NEMO的N末端結(jié)構(gòu)域的肽本發(fā)明者研究了野生型NEMO的N末端結(jié)構(gòu)域，特別是在圖1A中所展示的NLM保守基序(SEQ ID NO12的293-322位殘基)。至今，生成了下面的序列(相應(yīng)的序列見表1)NLM-DR(SEQ ID NO30)Ant.NLM-DR(SEQ ID NO31)Tat NLM-DR(SEQ ID NO32)R7-NLM-DR(SEQ ID NO33)R9-NLM-DR(SEQ ID NO34)NLM-DR是一種從在圖1A中所設(shè)定的更大的30個氨基酸的保守NLM基序中衍生出的21個氨基酸的“基序”(以及相應(yīng)的覆蓋相同的氨基酸范圍的野生型NLM)。NLM-DR是從野生型NLM序列中突變得到的，其中野生型序列中的第11位天冬氨酸殘基已經(jīng)被精氨酸所取代(見表1和SEQ ID NO30)。
本發(fā)明者通過測定相應(yīng)的協(xié)同性指數(shù)比較了NLM-DR和相應(yīng)的NLM肽，這證實了NLM-DR突變肽優(yōu)于野生型肽。
以Hill系數(shù)的方式對“協(xié)同性指數(shù)”的計算依據(jù)于下面的公式Boundmax×Ln/(KDn+Ln)其中，Boundmax是結(jié)合配體的最大濃度；
L是游離配體的濃度；n是協(xié)同性指數(shù)以及KD是蛋白對配體的親和常數(shù)。
通過Hill系數(shù)計算的方式所計算出的協(xié)同性指數(shù)是■對于突變的NLM肽(NLM-DR)-解離常數(shù)為170μM以及協(xié)同性指數(shù)為1.4(1326μM)；■對于野生型NLM肽(NLM)-解離常數(shù)Kd為240μM以及協(xié)同性指數(shù)為2.1(99642μM)；如果將這些數(shù)值與從沒有考慮到協(xié)同性的曲線中所得到的數(shù)值進(jìn)行比較，NLM-DR肽的親和力將比野生型NLM肽的親和力高75倍。
本發(fā)明者也評價了上面所提及的NLM-DR形式的生物學(xué)相關(guān)性結(jié)果(IC50和毒性結(jié)果)(FACS)，當(dāng)它們被應(yīng)用于抑制NF-κB活化途徑時。在表2中顯示了這些結(jié)果表2NLM-DR衍生肽的性能
*將用所標(biāo)明的技術(shù)所分析的細(xì)胞毒性分級為無毒性(無)到高毒性(++++)；MTS細(xì)胞增殖檢測法來自Promega；n.d.＝未確定。
對于上面的描述，對本發(fā)明的多種修飾和變異都是可能的。因此，要明白在所附的權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)，可以不同于在此所具體描述的其他方式實踐本發(fā)明。
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序列表<110>巴斯德研究院國家健康與醫(yī)學(xué)研究院國立科學(xué)研究中心<120>被設(shè)計用于破壞NEMO寡聚化的肽對NF-kB活化的選擇性抑制<150>US 60/530,418<151>2003-12-18<150>US 60/505,161<151>2003-09-24<160>39<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>17<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetic Peptide<400>1Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys1 5 10 15Lys<210>2<211>57<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
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20 25 30Arg His Ala Arg Glu Lys Leu Val Glu Lys Lys Glu Tyr Ser Gln Glu35 40 45Gln Leu Glu Gln Ser Gln Arg Glu Phe Asn Lys Leu50 55 60<210>9<211>43<212>PRT<213>Arti ficial Sequence<220>
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atgaacaagc acccctggaa gaaccagctg agtgagacgg tgcagcccag tggtggccca60gcagaggacc aggacatgct gggtgaagaa tcttctctgg ggaagcctgc aatgctacat120ctgccttcag agcagggtac tcctgagacc ctccagcgct gcctggaaga gaatcaagag180ctccgagacg ctatccggca gagcaatcag atgctgaggg aacgctgtga ggagctgctg240catttccagg tcagccagcg ggaggagaag gagttcctta tgtgcaaatt ccaggaagcc300cggaagctgg tggagagact gagcttggag aagcttgatc ttcggagtca gagggaacag360gccttaaagg agttggagca actgaagaaa tgccaacagc agatggctga ggacaaggcc420tctgtgaaag ctcaggtgac atcattgctc ggagaactcc aggagagcca gagccgtttg480gaggctgcca ccaaggatcg gcaagcttta gagggaagga ttcgagcagt tagtgagcag540gtcagacagc tggagagtga gcgggaggtg ctacagcagc agcacagcgt ccaggtggac600cagctgcgta tgcagaacca gagcgtggag gctgccttgc gaatggagcg gcaggctgct660tcagaggaga agcggaagct ggctcagttg caggcagcct atcaccaact cttccaagac720tacgacagcc acattaagag cagcaagggc atgcagctgg aagatctgag gcaacagctc780cagcaagctg aggaggccct ggtagccaaa caggaattga ttgataagct gaaagaggag840gctgagcagc acaagattgt gatggagact gtgccagtct tgaaggccca ggcggatatc900tacaaggctg acttccaagc tgagaggcat gcccgggaga agctggtgga gaagaaggag960tatttgcagg agcagctgga gcagctgcag cgcgagttca acaagctgaa agttggctgc1020catgagtcag ccaggattga ggatatgagg aagcggcatg tagagactcc ccagcctcct1080ttactccctg ctccagctca ccactccttt catttggcct tgtccaacca gcggaggagc1140cctcctgaag aacctcctga cttctgttgt ccgaagtgcc agtatcaggc tcctgatatg1200gacactctac agatacatgt catggagtgc atagagtag 1239<210>12<211>412<212>PRT<213>Mus musculus<400>12Met Asn Lys His Pro Trp Lys Asn Gln Leu Ser Glu Thr Val Gln Pro1 5 10 15Ser Gly Gly Pro Ala Glu Asp Gln Asp Met Leu Gly Glu Glu Ser Ser20 25 30Leu Gly Lys Pro Ala Met Leu His Leu Pro Ser Glu Gln Gly Thr Pro35 40 45Glu Thr Leu Gln Arg Cys Leu Glu Glu Asn Gln Glu Leu Arg Asp Ala50 55 60
Ile Arg Gln Ser Asn Gln Met Leu Arg Glu Arg Cys Glu Glu Leu Leu65 70 75 80His Phe Gln Val Ser Gln Arg Glu Glu Lys Glu Phe Leu Met Cys Lys85 90 95Phe Gln Glu Ala Arg Lys Leu Val Glu Arg Leu Ser Leu Glu Lys Leu100 105 110Asp Leu Arg Ser Gln Arg Glu Gln Ala Leu Lys Glu Leu Glu Gln Leu115 120 125Lys Lys Cys Gln Gln Gln Met Ala Glu Asp Lys Ala Ser Val Lys Ala130 135 140Gln Val Thr Ser Leu Leu Gly Glu Leu Gln Glu Ser Gln Ser Arg Leu145 150 155 160Glu Ala Ala Thr Lys Asp Arg Gln Ala Leu Glu Gly Arg Ile Arg Ala165 170 175Val Ser Glu Gln Val Arg Gln Leu Glu Ser Glu Arg Glu Val Leu Gln180 185 190Gln Gln His Ser Val Gln Val Asp Gln Leu Arg Met Gln Asn Gln Ser195 200 205Val Glu Ala Ala Leu Arg Met Glu Arg Gln Ala Ala Ser Glu Glu Lys210 215 220Arg Lys Leu Ala Gln Leu Gln Ala Ala Tyr His Gln Leu Phe Gln Asp225 230 235 240Tyr Asp Ser His Ile Lys Ser Ser Lys Gly Met Gln Leu Glu Asp Leu245 250 255Arg Gln Gln Leu Gln Gln Ala Glu Glu Ala Leu Val Ala Lys Gln Glu260 265 270Leu Ile Asp Lys Leu Lys Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val Met275 280 285Glu Thr Val Pro Val Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp290 295 300Phe Gln Ala Glu Arg His Ala Arg Glu Lys Leu Val Glu Lys Lys Glu305 310 315 320
Tyr Leu Gln Glu Gln Leu Glu Gln Leu Gln Arg Glu Phe Asn Lys Leu325 330 335Lys Val Gly Cys His Glu Ser Ala Arg Ile Glu Asp Met Arg Lys Arg340 345 350His Val Glu Thr Pro Gln Pro Pro Leu Leu Pro Ala Pro Ala His His355 360 365Ser Phe His Leu Ala Leu Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Pro Glu Glu370 375 380Pro Pro Asp Phe Cys Cys Pro Lys Cys Gln Tyr Gln Ala Pro Asp Met385 390 395 400Asp Thr Leu Gln Ile His Val Met Glu Cys Ile Glu405 410<210>13<211>57<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetic Peptide<400>13Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys1 5 10 15Lys Ser Lys Gly Met Gln Leu Glu Asp Leu Lys Gln Gln Leu Gln Gln20 25 30Ala Glu Glu Ala Leu Val Ala Lys Gln Glu Val Ile Asp Lys Leu Lys35 40 45Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val50 55<210>14<211>40<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetic Peptide<400>14Ser Lys Gly Met Gln Leu Glu Asp Leu Lys Gln Gln Leu Gln Gln Ala1 5 10 15Glu Glu Ala Leu Val Ala Lys Gln Glu Val Ile Asp Lys Leu Lys Glu
20 25 30Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val35 40<210>15<211>60<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetic Peptide<400>15Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys1 5 10 15Lys Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu20 25 30Arg Gln Ala Arg Glu Lys Leu Ala Glu Lys Lys Glu Leu Leu Gln Glu35 40 45Gln Leu Glu Gln Leu Gln Arg Glu Tyr Ser Lys Leu50 55 60<210>16<211>43<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetic Peptide<400>16Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu Arg1 5 10 15Gln Ala Arg Glu Lys Leu Ala Glu Lys Lys Glu Leu Leu Gln Glu Gln20 25 30Leu Glu Gln Leu Gln Arg Glu Tyr Ser Lys Leu35 40<210>17<211>2035<212>DNA<213>Homo sapiens<400>17cgagctggac tgtttctact cctccctcct cctccactgc ggggtctgac cctactcctt60gtgtgaggac tcctctagtt cagagacata ttctgttcac caaacttgac tgcgctctat120
cgaggtcgtt aaattcttcg gaaatgcctc acatatagtt tggcagctag cccttgccct180gttggatgaa taggcacctc tggaagagcc aactgtgtga gatggtgcag cccagtggtg240gcccggcagc agatcaggac gtactgggcg aagagtctcc tctggggaag ccagccatgc300tgcacctgcc ttcagaacag ggcgctcctg agaccctcca gcgctgcctg gaggagaatc360aagagctccg agatgccatc cggcagagca accagattct gcgggagcgc tgcgaggagc420ttctgcattt ccaagccagc cagagggagg agaaggagtt cctcatgtgc aagttccagg480aggccaggaa actggtggag agactcggcc tggagaagct cgatctgaag aggcagaagg540agcaggctct gcgggaggtg gagcacctga agagatgcca gcagcagatg gctgaggaca600aggcctctgt gaaagcccag gtgacgtcct tgctcgggga gctgcaggag agccagagtc660gcttggaggc tgccactaag gaatgccagg ctctggaggg tcgggcccgg gcggccagcg720agcaggcgcg gcagctggag agtgagcgcg aggcgctgca gcagcagcac agcgtgcagg780tggaccagct gcgcatgcag ggccagagcg tggaggccgc gctccgcatg gagcgccagg840ccgcctcgga ggagaagagg aagctggccc agttgcaggt ggcctatcac cagctcttcc900aagaatacga caaccacatc aagagcagcg tggtgggcag tgagcggaag cgaggaatgc960agctggaaga tctcaaacag cagctccagc aggccgagga ggccctggtg gccaaacagg1020aggtgatcga taagctgaag gaggaggccg agcagcacaa gattgtgatg gagaccgttc1080cggtgctgaa ggcccaggcg gatatctaca aggcggactt ccaggctgag aggcaggccc1140gggagaagct ggccgagaag aaggagctcc tgcaggagca gctggagcag ctgcagaggg1200agtacagcaa actgaaggcc agctgtcagg agtcggccag gatcgaggac atgaggaagc1260ggcatgtcga ggtctcccag gcccccttgc cccccgcccc tgcctacctc tcctctccCc1320tggccctgcc cagccagagg aggagccccc ccgaggagcc acctgacttc tgctgtccca1380agtgccagta tcaggcccct gatatggaca ccctgcagat acatgtcatg gagtgcattg1440agtagggccg gccagtgcaa ggccactgcc tgccgaggac gtgcccggga ccgtgcagtc1500tgcgctttcc tctcccgcct gcctagccca ggatgaaggg ctgggtggcc acaactggga1560tgccacctgg agccccaccc aggagctggc cgcggcacct tacgcttcag ctgttgatcc1620gctggtcccc tcttttgggg tagatgcggc cccgatcagg cctgactcgc tgctcttttt1680gttcccttct gtctgctcga accacttgcc tcgggctaat ccctccctct tcctccaccc1740ggcactgggg aagtcaagaa tggggcctgg ggctctcagg gagaactgct tcccctggca1800gagctgggtg gcagctcttc ctcccaccgg acaccgaccc gcccgctgct gtgccctggg1860agtgctgccc tcttaccatg cacacgggtg ctctcctttt gggctgcatg ctattccatt1920ttgcagccag accgatgtgt atttaaccag tcactattga tggacatttg ggttgtttcc1980catctttttg ttaccataaa taatggcata gtaaaaatcc ttgtgcatta aaaaa 2035
<210>18<211>419<212>PRT<213>Homo sapiens<400>18Met Asn Arg His Leu Trp Lys Ser Gln Leu Cys Glu Met Val Gln Pro1 5 10 15Ser Gly Gly Pro Ala Ala Asp Gln Asp Val Leu Gly Glu Glu Ser Pro20 25 30Leu Gly Lys Pro Ala Met Leu His Leu Pro Ser Glu Gln Gly Ala Pro35 40 45Glu Thr Leu Gln Arg Cys Leu Glu Glu Asn Gln Glu Leu Arg Asp Ala50 55 60Ile Arg Gln Ser Asn Gln Ile Leu Arg Glu Arg Cys Glu Glu Leu Leu65 70 75 80His Phe Gln Ala Ser Gln Arg Glu Glu Lys Glu Phe Leu Met Cys Lys85 90 95Phe Gln Glu Ala Arg Lys Leu Val Glu Arg Leu Gly Leu Glu Lys Leu100 105 110Asp Leu Lys Arg Gln Lys Glu Gln Ala Leu Arg Glu Val Glu His Leu115 120 125Lys Arg Cys Gln Gln Gln Met Ala Glu Asp Lys Ala Ser Val Lys Ala130 135 140Gln Val Thr Ser Leu Leu Gly Glu Leu Gln Glu Ser Gln Ser Arg Leu145 150 155 160Glu Ala Ala Thr Lys Glu Cys Gln Ala Leu Glu Gly Arg Ala Arg Ala165 170 175Ala Ser Glu Gln Ala Arg Gln Leu Glu Ser Glu Arg Glu Ala Leu Gln180 185 190Gln Gln His Ser Val Gln Val Asp Gln Leu Arg Met Gln Gly Gln Ser195 200 205Val Glu Ala Ala Leu Arg Met Glu Arg Gln Ala Ala Ser Glu Glu Lys210 215 220Arg Lys Leu Ala Gln Leu Gln Val Ala Tyr His Gln Leu Phe Gln Glu225 230 235 240
Tyr Asp Asn His Ile Lys Ser Ser Val Val Gly Ser Glu Arg Lys Arg245 250 255Gly Met Gln Leu Glu Asp Leu Lys Gln Gln Leu Gln Gln Ala Glu Glu260 265 270Ala Leu Val Ala Lys Gln Glu Val Ile Asp Lys Leu Lys Glu Glu Ala275 280 285Glu Gln His Lys Ile Val Met Glu Thr Val Pro Val Leu Lys Ala Gln290 295 300Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu Arg Gln Ala Arg Glu305 310 315 320Lys Leu Ala Glu Lys Lys Glu Leu Leu Gln Glu Gln Leu Glu Gln Leu325 330 335Gln Arg Glu Tyr Ser Lys Leu Lys Ala Ser Cys Gln Glu Ser Ala Arg340 345 350Ile Glu Asp Met Arg Lys Arg His Val Glu Val Ser Gln Ala Pro Leu355 360 365Pro Pro Ala Pro Ala Tyr Leu Ser Ser Pro Leu Ala Leu Pro Ser Gln370 375 380Arg Arg Ser Pro Pro Glu Glu Pro Pro Asp Phe Cys Cys Pro Lys Cys385 390 395 400Gln Tyr Gln Ala Pro Asp Met Asp Thr Leu Gln Ile His Val Met Glu405 410 415Cys Ile Glu<210>19<211>51<212>PRT<213>Mus musculus<400>19Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val1 5 10 15Met Glu Thr Val Pro Val Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala20 25 30
Asp Phe Gln Ala Glu Arg His Ala Arg Glu Lys Leu Val Glu Lys Lys35 40 45Glu Tyr Leu50<210>20<211>51<212>PRT<213>Homo sapiens<400>20Glu Val Ile Asp Lys Leu Lys Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val1 5 10 15Met Glu Thr Val Pro Val Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala20 25 30Asp Phe Gln Ala Glu Arg Gln Ala Arg Glu Lys Leu Ala Glu Lys Lys35 40 45Glu Leu Leu50<210>21<211>51<212>PRT<213>Bos taurus<400>21Glu Val Ile Asp Lys Leu Lys Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val1 5 10 15Met Glu Thr Val Pro Val Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala20 25 30Asp Phe Gln Ala Glu Arg Gln Ala Arg Glu Lys Leu Ala Glu Lys Lys35 40 45Glu Phe Leu50<210>22<211>55<212>PRT<213>Drosophila melanogaster<400>22Glu Leu Ile Lys Lys Met Gln Leu Asp Ile Asn Glu Leu Lys Ala Arg1 5 10 15
Asp Ile Gln Lys Gln Glu Val Ile Lys Gly Leu Gln Ile Gln Asn Asp20 25 30Ile Tyr Arg Arg Asp Phe Glu Met Glu Arg Ala Asp Arg Glu Lys Asn35 40 45Ala Gly Glu Lys Asp Gln Tyr50 55<210>23<211>51<212>PRT<213>Mus musculus<400>23Leu Gln Met Asp Glu Met Lys Gln Thr Leu Ala Lys Gln Glu Glu Asp1 5 10 15Leu Glu Thr Met Ala Val Leu Arg Ala Gln Met Glu Val Tyr Cys Ser20 25 30Asp Phe His Ala Glu Arg Ala Ala Arg Glu Lys Ile His Glu Glu Lys35 40 45Glu Gln Leu50<210>24<211>51<212>PRT<213>Homo sapiens<400>24Leu Gln Met Asp Glu Met Lys Gln Thr Ile Ala Lys Gln Glu Glu Asp1 5 10 15Leu Glu Thr Met Thr Ile Leu Arg Ala Gln Met Glu Val Tyr Cys Ser20 25 30Asp Phe His Ala Glu Arg Ala Ala Arg Glu Lys Ile His Glu Glu Lys35 40 45Glu Gln Leu50<210>25<211>59<212>PRT<213>Mus musculus<400>25
Ser Pro Ser Ser Pro Pro Ala Ala Phe Gly Ser Pro Glu Gly Val Gly1 5 10 15Gly His Leu Arg Lys Gln Glu Leu Val Thr Gln Asn Glu Leu Leu Lys20 25 30Gln Gln Val Lys Ile Phe Glu Glu Asp Phe Gln Arg Glu Arg Ser Asp35 40 45Arg Glu Arg Met Asn Glu Glu Lys Glu Glu Leu50 55<210>26<211>59<212>PRT<213>Homo sapiens<400>26Pro Pro Ser Ser Pro Pro Thr Ala Phe Gly Ser Pro Glu Gly Ala Gly1 5 10 15Ala Leu Leu Arg Lys Gln Glu Leu Val Thr Gln Asn Glu Leu Leu Lys20 25 30Gln Gln Val Lys Ile Phe Glu Glu Asp Phe Gln Arg Glu Arg Ser Asp35 40 45Arg Glu Arg Met Asn Glu Glu Lys Glu Glu Leu50 55<210>27<211>51<212>PRT<213>Mus musculus<400>27Glu Ala Asn Gln Glu Leu Thr Ala Met Arg Met Ser Arg Asp Thr Ala1 5 10 15Leu Glu Arg Val Gln Met Leu Glu Gln Gln Ile Leu Ala Tyr Lys Asp20 25 30Asp Phe Lys Ser Glu Arg Ala Asp Arg Glu Arg Ala His Ser Arg Ile35 40 45Gln Glu Leu50<210>28<211>51<212>PRT
<213>Homo sapiens<400>28Glu Val Lys Gln Glu Leu Ala Ala Ser Arg Thr Ala Arg Asp Ala Ala1 5 10 15Leu Glu Arg Val Gln Met Leu Glu Gln Gln Ile Leu Ala Tyr Lys Asp20 25 30Asp Phe Met Ser Glu Arg Ala Asp Arg Glu Arg Ala Gln Ser Arg Ile35 40 45Gln Glu Leu50<210>29<211>54<212>PRT<213>Homo sapiens<400>29Ser Phe Ser Glu Asp Cys Leu Arg Lys Ser Arg Val Glu Phe Cys His1 5 10 15Glu Glu Met Arg Thr Glu Met Glu Val Leu Lys Gln Gln Val Gln Ile20 25 30Tyr Glu Glu Asp Phe Lys Lys Glu Arg Ser Asp Arg Glu Arg Leu Asn35 40 45Gln Glu Lys Glu Glu Leu50<210>30<211>21<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetic Peptide<400>30Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu Arg1 5 10 15His Ala Arg Glu Lys20<210>31<211>38<212>PRT<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic Peptide<400>31Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys1 5 10 15Lys Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu20 25 30Arg His Ala Arg Glu Lys35<210>32<211>33<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetic Peptide<400>32Cys Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Lys Ala Gln1 5 10 15Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu Arg His Ala Arg Glu20 25 30Lys<210>33<211>29<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetic Peptide<400>33Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr1 5 10 15Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu Arg His Ala Arg Glu Lys20 25<210>34<211>31<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Synthetic Peptide
<400>34Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu Lys Ala Gln Ala Asp1 5 10 15Ile Tyr Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu Arg His Ala Arg Glu Lys20 25 30<210>35<211>21<212>PRT<213>Homo sapiens<400>35Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu Arg1 5 10 15Gln Ala Arg Glu Lys20<210>36<211>38<212>PRT<213>Homo sapiens<400>36Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys1 5 10 15Lys Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu20 25 30Arg Gln Ala Arg Glu Lys35<210>37<211>33<212>PRT<213>Homo sapiens<400>37Cys Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Lys Ala Gln1 5 10 15Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu Arg Gln Ala Arg Glu20 25 30Lys<210>38
<211>29<212>PRT<213>Homo sapiens<400>38Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr1 5 10 15Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu Arg Gln Ala Arg Glu Lys20 25<210>39<211>31<212>PRT<213>Homo sapiens<400>39Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu Lys Ala Gln Ala Asp1 5 10 15Ile Tyr Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu Arg Gln Ala Arg Glu Lys20 25 30
權(quán)利要求
1.一種編碼抑制NF-κB信號途徑的多肽的純化的多核苷酸，所述多核苷酸選自以下一組(a)一種編碼一種包括選自由SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO30、SEQ ID NO31、SEQ IDNO32、SEQ ID NO33、SEQ ID NO34、SEQ ID NO35、SEQ ID NO36、SEQ ID NO37、SEQ ID NO38、和SEQ ID NO39組成的組中的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)一種與在(a)中定義的多核苷酸互補(bǔ)的純化的多核苷酸；(c)一種與在(a)中定義的多核苷酸具有至少70％相同性的純化的多核苷酸；(d)一種與在(a)中定義的多核苷酸具有至少80％相同性的純化的多核苷酸；(e)一種與在(a)中定義的多核苷酸具有至少90％相同性的純化的多核苷酸；和(f)一種在嚴(yán)格條件下能與在(a)中定義的多核苷酸雜交的純化的多核苷酸，其中所述嚴(yán)格條件包括在從50℃到68℃的溫度下在5XSSC中進(jìn)行洗滌。
2.權(quán)利要求1的純化的多核苷酸，其中所述多核苷酸抑制NF-κB途徑。
3.權(quán)利要求2的純化的多核苷酸，其中所述多核苷酸破壞NEMO寡聚化。
4.一種包括權(quán)利要求1的純化的多核苷酸的載體。
5.一種包括權(quán)利要求1的純化的多核苷酸的宿主細(xì)胞。
6.一種抑制NF-κB途徑的純化的多肽，其選自以下一組a)一種具有選自由SEQ ID NO3、SEQ ID NO7、SEQ IDNO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO30、SEQ ID NO31、SEQ ID NO32、SEQ ID NO33、SEQ ID NO34、SEQ ID NO35、SEQ ID NO36、SEQ ID NO37、SEQ ID NO38、和SEQ ID NO39組成的組中的氨基酸序列的NEMO型多肽；b)一種與在a)中定義的多肽具有至少70％相同性的純化的多肽；c)一種與在a)中定義的多肽具有至少80％相同性的純化的多肽；d)一種與在a)中定義的多肽具有至少90％相同性的純化的多肽；e)一種與在a)中定義的多肽具有至少95％相同性的純化的多肽。
7.權(quán)利要求6的純化的多肽，其中所述多肽抑制NF-κB途徑。
8.權(quán)利要求7的純化的多肽，其中所述多肽破壞NEMO寡聚化。
9.一種抑制NF-κB途徑的多肽融合構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包括選自以下一組的氨基酸序列a)一種包括選自由SEQ ID NO3、SEQ ID NO7、SEQ IDNO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO30、SEQ ID NO31、SEQ ID NO32、SEQ ID NO33、SEQ ID NO34、SEQ ID NO35、SEQ ID NO36、SEQ ID NO37、SEQ ID NO38、和SEQ ID NO39組成的組中的氨基酸序列的多肽融合構(gòu)建體，且所述氨基酸序列與一種具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的多肽相連接；b)一種包括與在a)中定義的氨基酸序列具有至少80％相同性的氨基酸序列的多肽融合構(gòu)建體；c)一種包括與在a)中定義的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列的多肽融合構(gòu)建體；d)一種包括與在a)中定義的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序列的多肽融合構(gòu)建體；e)一種包括與選自由SEQ ID NO3、SEQ ID NO7、SEQ IDNO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO30、SEQ ID NO31、SEQ ID NO32、SEQ ID NO33、SEQ ID NO34、SEQ ID NO35、SEQ ID NO36、SEQ ID NO37、SEQ ID NO38、和SEQ ID NO39組成的組中的氨基酸序列具有至少70％相同性的氨基酸序列的多肽融合構(gòu)建體，所述氨基酸序列與一種具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的多肽相連接。
10.權(quán)利要求9的多肽，其中所述多肽融合構(gòu)建體破壞NEMO寡聚化。
11.權(quán)利要求9的多肽，其中所述連接是通過一種長度為1到35個氨基酸范圍內(nèi)的氨基酸間隔序列。
12.權(quán)利要求11的多肽，其中所述氨基酸間隔序列選自由SEQ IDNO9和SEQ ID NO10組成的組。
13.權(quán)利要求9的多肽，其中所述具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的多肽具有SEQID NO1的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求13的多肽，其中所述多肽融合構(gòu)建體具有選自由SEQ ID NO2、SEQ ID NO6、SEQ ID NO13和SEQ ID NO15組成的組中的氨基酸序列。
15.一種抑制NF-κB信號途徑的方法，其包括在體外將一種真核細(xì)胞與權(quán)利要求9到14中任一項的多肽融合構(gòu)建體接觸。
16.一種破壞NEMO寡聚化的方法，其包括在體外將所述NEMO與權(quán)利要求9到14中任一項的多肽融合構(gòu)建體接觸。
17.一種有效量的包括權(quán)利要求9到14中任一項的多肽融合構(gòu)建體和一種或多種可藥用載體或賦形劑的組合物在制備用于調(diào)控或治療有此需求的對象中的由NF-κB信號途徑所調(diào)節(jié)的疾病的藥物中的用途。
18.權(quán)利要求17的用途，其中所述對象是人。
19.權(quán)利要求17或18的用途，其中所述的有效量的范圍是從0.1mg/Kg/天到30mg/Kg/天。
20.權(quán)利要求17到19中任一項的用途，其中所述的由NF-κB信號途徑調(diào)節(jié)的疾病選自由炎癥應(yīng)答、腫瘤形成、和病毒感染組成的組。
21.權(quán)利要求17到20中任一項的用途，其中所述組合物的施用方式選自口服、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、腸外、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹腔內(nèi)、舌下、局部和口腔內(nèi)施用。
22.權(quán)利要求17到21中任一項的用途，其中所述組合物優(yōu)選地通過靜脈內(nèi)施用。
23.一種有效量的包括權(quán)利要求9到14中任一項的多肽融合構(gòu)建體和一種或多種可藥用載體或賦形劑的組合物在制備用于調(diào)節(jié)有此需求的對象中的細(xì)胞增殖或凋亡的藥物中的用途。
24.權(quán)利要求23的用途，其中所述對象是人。
25.權(quán)利要求23或24的用途，其中所述的有效量的范圍是從0.1mg/Kg/天到30mg/Kg/天。
26.權(quán)利要求23到25中任一項的用途，其中所述組合物的施用方式選自口服、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、腸外、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹腔內(nèi)、舌下、局部和口腔內(nèi)施用。
27.權(quán)利要求23到26中任一項的用途，其中所述組合物優(yōu)選地通過靜脈內(nèi)施用。
28.一種有效量的包括權(quán)利要求9到14中任一項的多肽融合構(gòu)建體和一種或多種可藥用載體或賦形劑的組合物在制備用于調(diào)節(jié)有此需求的對象中的抗原刺激的B或T淋巴細(xì)胞的藥物中的用途。
29.權(quán)利要求28的用途，其中所述對象是人。
30.權(quán)利要求28或29的用途，其中所述的有效量的范圍是從0.1mg/Kg/天到30mg/Kg/天。
31.權(quán)利要求28到30中任一項的用途，其中所述組合物的施用方式選自口服、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、腸外、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹腔內(nèi)、舌下、局部和口腔內(nèi)施用。
32.權(quán)利要求28到31中任一項的用途，其中所述組合物優(yōu)選地通過靜脈內(nèi)施用。
33.一種鑒定調(diào)控NEMO寡聚化的多肽的方法，其包括a)鑒定出侯選多肽序列；b)通過一種間隔序列連接所述侯選多肽序列與一種具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的多肽，由此生成一種多肽融合構(gòu)建體；c)將細(xì)胞培養(yǎng)物與多肽融合構(gòu)建體接觸；和d)監(jiān)測NF-κB信號途徑的活性；e)將存在所述多肽融合構(gòu)建體時的NF-κB信號途徑的活性與沒有所述多肽融合構(gòu)建體時的NF-κB信號途徑的活性進(jìn)行比較，以確定所述多肽融合構(gòu)建體造成的相對抑制；和f)將所述多肽融合構(gòu)建體造成的相對抑制與NEMO寡聚化相關(guān)聯(lián)。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述侯選多肽序列具有卷曲螺旋或螺旋結(jié)構(gòu)。
35.權(quán)利要求33或權(quán)利要求34的方法，其中所述侯選多肽序列具有20到60個氨基酸。
36.權(quán)利要求33到35中任一項的方法，其中所述侯選多肽序列衍生自NEMO。
37.權(quán)利要求33到36中任一項的方法，其中所述間隔序列的長度范圍是從1到35個氨基酸。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述間隔序列選自由SEQ ID NO9和SEQ ID NO10組成的組。
39.權(quán)利要求33的方法，其中所述具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO1。
40.權(quán)利要求33的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物包括已經(jīng)被NF-κB依賴性β-半乳糖糖苷酶報道基因所轉(zhuǎn)染的前B 70Z/3淋巴細(xì)胞，其在2003年4月1日保藏于法國微生物保藏中心(CNCM，28 rue du DocteurRoux，75724 PARIS Cedex 15，法國)，保藏號為I-3004。
41.權(quán)利要求33的方法，其中所述多肽融合構(gòu)建體還包括N末端的半胱氨酸殘基。
42.權(quán)利要求39的方法，其還包括b-1)標(biāo)記所述多肽融合構(gòu)建體；和c-1)監(jiān)測標(biāo)記的多肽融合構(gòu)建體的細(xì)胞攝取。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述標(biāo)記包括半胱氨酸殘基與熒光團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述熒光團(tuán)是BODIPY。
45.權(quán)利要求42的方法，其中通過FACS監(jiān)測所述的細(xì)胞攝取。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制NF－κB信號途徑的多肽和編碼相同多肽的多核苷酸。本發(fā)明還提供了通過給有需要的對象施用本發(fā)明的多肽而調(diào)控和/或治療炎癥應(yīng)答、腫瘤形成、病毒感染；調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡；以及調(diào)節(jié)抗原刺激的B或T淋巴細(xì)胞的方法。最后，本發(fā)明提供了鑒定調(diào)控NEMO寡聚化的多肽的方法。
文檔編號C07H21/04GK1886148SQ200480034697
公開日2006年12月27日 申請日期2004年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月24日
發(fā)明者法布里斯·阿古, 吉勒·庫爾圖伊斯, 阿蘭·伊斯拉埃爾, 米歇爾·韋榮, 弗朗索瓦·特蘭卡德, 山岡小路, 伊夫-馬里·夸克, 弗朗索瓦·巴勒克斯 申請人:巴斯德研究院, 國家健康與醫(yī)學(xué)研究院, 國立科學(xué)研究中心