本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種分泌抗大麥黃矮病毒PAV株系單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

由大麥黃矮病毒(Barley yellow dwarf viruses,BYDVs)引起的小麥黃矮病(Wheat yellow dwarf disease)是小麥上重要的病毒病害之一。該病害最早由Oswald和Houston于1951年在美國加利福尼亞州的大麥上發(fā)現(xiàn)。目前，小麥黃矮病毒在世界各地均有分布。1960年，BYDVs首次出現(xiàn)在我國西北地區(qū)，受到BYDVs侵染的小麥一般減產(chǎn)40％，嚴(yán)重的可達(dá)70％以上，因此BYDVs又被稱為“小麥癌癥”、“黃色瘟疫”。自首次發(fā)現(xiàn)以來，小麥黃矮病在20世紀(jì)60-80年代又大規(guī)模爆發(fā)流行了數(shù)次，給我國小麥生產(chǎn)和糧食安全帶來了重大威脅。

BYDVs在小麥秋苗期和春季返青后均可侵染植株，典型癥狀是新葉從葉尖開始發(fā)黃，植株變矮，葉片顏色為金黃色到鮮黃色，黃化部分約占全葉的1/3-1/2。秋苗期感病的植株矮化明顯，分蘗減少，一般不能安全越冬。即使能越冬存活，一般也不能抽穗。穗期感病的植株一般只旗葉發(fā)黃，呈鮮黃色，植株矮化不明顯，能抽穗，但千粒重減少，根系淺，易拔起。

BYDVs寄主范圍較廣，目前已知至少可以侵染150多種禾本科作物和雜草，其主要寄主作物既包括小麥、玉米和水稻世界三大糧食作物，也包括大麥、燕麥和黑麥等具有較高經(jīng)濟(jì)價值的糧食作物。雖然BYDVs寄主范圍廣泛，但都集中在單子葉植物范圍內(nèi)，在自然條件下尚未發(fā)現(xiàn)能夠被BYDVs侵染的雙子葉植物。根據(jù)寄主范圍、對寄主的毒性、蚜蟲傳播特異性與反應(yīng)類型等特點(diǎn)，Rochow 等將美國的BYDVs分為MAV、PAV、RPV、RMV和SGV 5個株系。在中國，周廣和等篩選鑒定出了4個BYDVs株系，即PAV、RMV、GPV和GAV。BYDVs屬黃癥病毒科(Luteoviridae)，是一種+ss RNA病毒。病毒粒子由正單鏈RNA和外殼蛋白組成，呈正二十面體(T＝3)，無包膜。目前，根據(jù)國際病毒分類委員會關(guān)于病毒的分類，BYDVs分布于黃癥病毒科(Luteoviridae)的2個屬8個種，且還有2個種未被劃分到屬。在10個種中，BYDV PAV、BYDV PAS、BYDV MAV、BYDV ker II和BYDV ker III這5個種屬于黃癥病毒屬(Luteovirus)；原RPV株系被升級為Cereal yellow dwarf virus-RPV(CYDV RPV)，并和CYDV RPS和MYDV RMV這2個種一起被劃分到馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus)中；另外，BYDV GPV和BYDV SGV兩個種未歸類。這些引起大麥黃矮病的各種病毒株系間的核酸同源性非常的低，其實(shí)是完全不同的病毒，由于命名的習(xí)慣現(xiàn)在還叫大麥黃矮病毒。

據(jù)統(tǒng)計，全世界至少有25種蚜蟲可以傳播BYDVs。而在中國，禾谷縊管蚜(R.padi)、麥長管蚜(S.avenae)、麥二叉蚜(S.graminum)和玉米蚜(R.maidis)是BYDVs的主要傳播介體。BYDVs在蚜蟲體內(nèi)以循回型非增殖方式傳播。

目前田間常常根據(jù)癥狀觀察判斷小麥黃矮病的發(fā)生情況，但相比真菌病害和細(xì)菌病害，病毒病的癥狀特點(diǎn)并不明顯，常與其他病毒病害相混淆，出現(xiàn)錯誤判斷的情況，而且通過癥狀并不能判斷病毒具體是哪個株系。電鏡觀察需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)人員，不適合基層應(yīng)用。RT-PCR等分子生物學(xué)方法雖然靈敏度高，但往往受儀器的限制，僅適用于實(shí)驗(yàn)室少樣品的檢測。相比較而言，血清學(xué)方法簡單易操作、快速、靈敏，成本較低，是目前植物病毒理想的檢測手段，但血清學(xué)方法必須依賴于特異、靈敏的優(yōu)質(zhì)抗體。因此，本發(fā)明專利主要針對大麥黃矮病毒PAV株系單克隆抗體的制備及其檢測應(yīng)用開展工作，利用常 規(guī)雜交瘤技術(shù)制備了1株能分泌抗BYDV PAV單抗雜交瘤細(xì)胞24G4，并用其分泌的單抗建立了檢測該病毒的血清學(xué)方法和檢測試劑盒，從而為我國大麥黃矮病毒PAV株系的檢測、診斷和科學(xué)指導(dǎo)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分泌抗大麥黃矮病毒PAV株系單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。

分泌抗大麥黃矮病毒(BYDV)PAV株系單抗雜交瘤細(xì)胞株24G4，它能分泌抗大麥黃矮病毒PAV株系的特異性單抗,雜交瘤細(xì)胞株24G4于2016年11月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.13298。

抗大麥黃矮病毒PAV株系的單克隆抗體腹水間接ELISA效價達(dá)10^-9，抗體類型及亞類為IgG1、Kappa鏈，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析發(fā)現(xiàn)該單抗檢測感染大麥黃矮病毒PAV株系的小麥病葉的靈敏度分別達(dá)到1:81 920和1:1 280倍稀釋(w/v,g/mL)。

抗大麥黃矮病毒PAV株系的單克隆抗體僅與大麥黃矮病毒PAV株系有特異性免疫反應(yīng)，而與小麥矮縮病毒、中國小麥花葉病毒、小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒、大麥黃矮病毒GPV株系和GAV株系以及健康小麥植物組織均不發(fā)生任何免疫反應(yīng)。

抗大麥黃矮病毒PAV株系的單克隆抗體在大麥黃矮病毒PAV株系檢測上的應(yīng)用是以單抗為核心建立的各種免疫學(xué)檢測方法和免疫學(xué)試劑盒。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果：1)提供的雜交瘤細(xì)胞株24G4分泌抗大麥黃矮病毒PAV株系特異性單克隆抗體，以該單抗為核心建立的dot-ELISA和ACP-ELISA等免疫學(xué)方法及用這些方法建立的試劑盒能高度特 異、準(zhǔn)確、靈敏地檢測大麥黃矮病毒PAV株系；2)利用本發(fā)明所制備的單抗檢測大麥黃矮病毒PAV株系，不需要昂貴的電子顯微鏡、PCR儀等設(shè)備；3)利用本發(fā)明所制備的單抗可有效地用于田間小麥樣品中大麥黃矮病毒PAV株系的檢測。

附圖說明

圖1是dot-ELISA方法檢測小麥BYDV PAV的靈敏度分析；

圖2是dot-ELISA方法檢測BYDV PAV的特異性分析：1列上下2個點(diǎn)為2個感染BYDV PAV的小麥樣品，2列上下2個點(diǎn)為2個感染小麥黃花葉病毒的樣品，3列上下2個點(diǎn)為2個感染中國小麥花葉病毒的樣品，4列上下2個點(diǎn)為2個感染大麥黃矮病毒GAV株系的樣品，5列上下2個點(diǎn)為2個感染大麥黃矮病毒GPV株系的樣品，6列上下2個點(diǎn)為感染小麥矮縮病毒的樣品，7列上下2個點(diǎn)為感染大麥黃花葉病毒的樣品，8列上下2個點(diǎn)為健康小麥植物組織樣品。

圖3是dot-ELISA方法檢測小麥田間樣品中BYDV PAV的代表性結(jié)果。

生物保藏

雜交瘤細(xì)胞株24G4保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編：100101，保藏日為2016年11月30日，保藏號為CGMCC No.13298。

具體實(shí)施方式

分泌抗大麥黃矮病毒PAV株系單抗的雜交瘤細(xì)胞株24G4于2016年11月30日保藏于中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.13298，它能分泌抗大麥黃矮病毒PAV株系的單克隆抗體。

抗大麥黃矮病毒PAV株系的單克隆抗體腹水間接ELISA效價達(dá)10^-9，抗體 類型及亞類為IgG1、Kappa鏈，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析發(fā)現(xiàn)該單抗檢測感染大麥黃矮病毒PAV株系的小麥病葉的靈敏度分別達(dá)到1:81 920和1:1 280倍稀釋(w/v,g/mL)。

抗大麥黃矮病毒PAV株系單克隆抗體僅與大麥黃矮病毒PAV株系有特異性免疫反應(yīng)，而與小麥矮縮病毒、中國小麥花葉病毒、小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒、大麥黃矮病毒GPV株系和GAV株系以及健康小麥植物組織均不發(fā)生任何免疫反應(yīng)。

抗大麥黃矮病毒PAV株系的單抗在該病毒檢測上的應(yīng)用是以單抗為核心建立的各種免疫學(xué)檢測方法和免疫學(xué)試劑盒。

本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株24G4能大量分泌抗大麥黃矮病毒PAV株系的單抗，且其分泌的單抗效價高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好。以該單抗為核心建立的檢測BYDV PAV的高通量的血清學(xué)方法及其檢測試劑盒可成功應(yīng)用于田間BYDV PAV的檢測，從而為我國大麥黃矮病毒PAV株系的檢測、預(yù)警和科學(xué)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

一、雜交瘤細(xì)胞的獲得及其單克隆抗體的制備

1.免疫原及檢測抗原的制備

用下面的操作步驟提純病毒粒子：

1)將大研缽和組織攪拌器預(yù)冷；

2)將500g感染BYDV PAV的小麥病葉于液氮中研磨成粉末；

3)加入含1％(v/v)巰基乙醇和2.5g崩潰酶的0.1M磷酸鹽緩沖液(PB緩沖液)1000mL，組織攪拌器中劇烈攪拌60s混勻。以后每隔15min，攪拌30s，勻漿3h以上；

4)加入Triton X-100至終濃度為0.5％(v/v)，室溫攪拌30min；

5)4到6層紗布過濾，濾液體積1100mL，加入220mL氯仿:正戊醇(2:1,v/v)，4℃攪拌30min；

6)8 000rpm離心15min，取上清；

7)所得上清加入NaCl至終濃度為0.25M，然后緩慢加入PEG(分子量6000)至終溶度為10％(w/v,g/mL)，溶解后冰浴放置90-120min；

8)10 000rpm離心20min后棄上清，將沉淀用30mL 0.1M PB懸浮，4℃攪拌過夜；

9)5 000rpm離心10min后棄沉淀，上清加到50mL厚壁離心管的30％的蔗糖(溶于0.1M PB中)墊上，蔗糖墊體積15mL；

10)Beckman Ti55型轉(zhuǎn)頭44 000rpm超速離心2h；

11)棄上清，沉淀溶于1.5mL無菌水中，4℃攪拌懸浮過夜，懸浮液即為病毒提純粒子；

12)用電子顯微鏡觀察提純樣品，發(fā)現(xiàn)大量高純度的大麥黃矮病毒粒子。

2.免疫動物

用提純的BYDV PAV株系的病毒粒子免疫六周齡BALB/c雌性小鼠。即病毒粒子提純液50μL/只與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)注射0.1mL/只，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射0.1mL/只，再過3周后用加倍劑量的抗原進(jìn)行腹腔注射，3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。

3.細(xì)胞融合

取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)按5:1的比例，在無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中混勻，1 500rpm離心5min去除培養(yǎng)基，用50％PEG(分 子量1 500)作為融合劑，在37℃水浴中加入1mL，使其融合2min，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止融合后1 500rpm離心5min，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔細(xì)胞板中，并置于37℃含5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4.雜交瘤細(xì)胞、陽性孔的篩選及其克隆

細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第11天用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底10-40％時，以感染BYDVs PAV株系的小麥組織粗提液為抗原包被ELISA板，用常規(guī)間接ELISA方法篩選分泌單抗的陽性孔，共獲35個陽性孔。選擇3個呈強(qiáng)陽性反應(yīng)的細(xì)胞孔，進(jìn)行3次有限稀釋法克隆，獲得1株能分泌抗BYDV PAV特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株24G4。經(jīng)6個月以上體外傳代和多次凍存復(fù)蘇后，細(xì)胞株均能良好生長，并穩(wěn)定分泌抗體。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，用于腹水制備和液氮保存。

5.單克隆抗體腹水制備及純化

取8周齡左右BALB/c小鼠，腹腔注射0.3mL降植烷(Sigma)，7-10d后腹腔注入6×10⁵個雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10d可見小鼠腹部明顯膨大，針頭采取腹水，3 000rpm離心3min，收集上清液即為單克隆抗體腹水。取1倍體積腹水加入2倍體積0.06M pH4.8醋酸緩沖液稀釋，室溫下邊攪邊加辛酸(30uL/mL腹水)，4℃澄清1h，12 000rpm離心20min，收集上清，再用50％飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4℃放置2h，3 000rpm離心20min，沉淀用2倍體積的PBS溶解，在4℃冰箱中流動透析24h后即獲純化的單抗，-70℃保存。

6.單克隆抗體的類型及亞類鑒定和腹水效價測定

將純化的單抗與Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)抗BALB/c小鼠IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgM、κ、λ抗體進(jìn)行DAS-ELISA分析，結(jié)果顯示，24G4單抗亞類為IgG1、Kappa鏈，以提純病毒為包被抗原用常規(guī)間接ELISA方法檢測單抗腹水效價，結(jié)果表 明24G4單抗腹水效價達(dá)到10^-9。

7.單克隆抗體的特異性檢測

用感染小麥矮縮病毒、中國小麥花葉病毒、小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒、大麥黃矮病毒GPV株系和GAV株系的病葉粗提液包被ELISA板，以小麥的健康葉片粗提液作陰性對照，以感染大麥黃矮病毒PAV株系的病葉粗提液為陽性對照，用ACP-ELISA方法測定單抗的特異性。ACP-ELISA方法的具體步驟為：上述病毒感染的病葉用液氮在研缽中研磨成粉末，按1:30(w/v,g/mL)加入包被緩沖液繼續(xù)研磨勻漿3min，5 000rpm離心3min后取上清，100μL/孔包被ELISA板，4℃過夜或37℃2h，使其吸附于ELISA聚苯乙烯板孔；PBST洗滌3次后用3％的脫脂奶粉封閉30-60min；加入適當(dāng)稀釋的單抗100μL/孔，37℃1-2h；PBST洗滌3次后加入適當(dāng)稀釋的堿性磷酸脂酶(AP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗(Sigma)100μL/孔，37℃1-2h；PBST洗滌4次后用PNPP底物顯色，2M氫氧化鈉終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀讀取OD₄₀₅的值，以與陰性O(shè)D值比值大于2.1為陽性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，24G4單抗只對BYDV PAV有特異性反應(yīng)，而與小麥矮縮病毒、中國小麥花葉病毒、小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒、大麥黃矮病毒GPV株系和GAV株系以及健康小麥植物組織均不發(fā)生任何免疫反應(yīng)。

二、檢測BYDV PAV的免疫學(xué)方法及其試劑盒的建立

1.檢測BYDV PAV的ACP-ELISA方法

1.1 ACP-ELISA方法的步驟：

1)植物組織稱重后用液氮在研缽中研磨成粉末，按1:30比例(w/v,g/mL)加入0.05M碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)繼續(xù)研磨勻漿3min，5 000rpm離心3min，上清100μL/孔加入ELISA板中，以BYDV PAV病葉為陽性對照，健康小麥葉為陰性對照，37℃2h或4℃過夜；

2)PBST洗滌3次后用3％脫脂奶粉封閉30min；

3)加入適當(dāng)稀釋后的單抗腹水，100μL/孔，37℃孵育1h；

4)PBST洗滌3次后加入適當(dāng)稀釋的堿性磷酸脂酶(AP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗(Sigma)，100μL/孔，37℃孵育1h；

5)用PBST洗滌后加入PNPP硝基磷酸鹽底物100μL/孔，室溫放置30min；

6)用肉眼觀察，底物顏色變成黃綠色的孔為陽性；或用2M氫氧化鈉終止反應(yīng)后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測OD₄₀₅，以P/N>2.1作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 ACP-ELISA方法檢測靈敏度和特異性的確定

用常規(guī)方陣試驗(yàn)確定ACP-ELISA方法中單抗和酶標(biāo)二抗的最適工作濃度，即ELISA板橫向加用封閉液倍比稀釋的單抗，縱向加用封閉液倍比稀釋AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗進(jìn)行ACP-ELISA。試驗(yàn)表明24G4單抗及酶標(biāo)二抗的最適工作濃度分別為1:5 000和1:8 000倍稀釋，以抗體的最適工作濃度建立檢測BYDV PAV的ACP-ELISA方法。對BYDV PAV病葉粗提液從1:160至655 360倍比稀釋，分別以相應(yīng)稀釋度的小麥健葉粗提液作陰性對照，分析ACP-ELISA方法的檢測靈敏度。結(jié)果表明ACP-ELISA方法對1:1:81 920倍稀釋(w/v,g/mL)的病葉粗提液仍呈陽性反應(yīng)，即對病葉的檢測靈敏度可達(dá)到1:1:81 920倍稀釋(w/v,g/mL)，表明ACP-ELISA方法具有很高的靈敏度。用建立的ACP-ELISA方法檢測BYDV PAV、大麥黃矮病毒GPV株系、大麥黃矮病毒GAV株系、中國小麥花葉病毒、小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒和健康小麥植物組織，檢測結(jié)果表明，建立的ACP-ELISA方法檢測BYDV PAV呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，而與小麥矮縮病毒、中國小麥花葉病毒、小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒、大麥黃矮病毒GPV株系和GAV株系以及健康小麥植物組織均呈陰性反應(yīng)，且陰陽性結(jié)果對比差異極顯著，說明該方法的特異性很好。

2.dot-ELISA方法的建立及田間檢測應(yīng)用

2.1 dot-ELISA方法檢測植物中BYDV PAV的操作步驟

將小麥植物樣品的葉片稱重后用液氮在研缽中研磨成粉末，按1:30的比例(w/v,g/mL)加入0.01M PBS(pH7.4)后研磨、勻漿3min；勻漿液5 000rpm離心3min；取2.5μL上清點(diǎn)到硝酸纖維素膜(NC)上，同時設(shè)置健康和感染BYDV PAV的小麥葉片分別作為陰性和陽性對照；室溫干燥10-20min；NC膜浸入到含5％脫脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01M PBS)封閉液中室溫封閉30min；NC膜放入適度稀釋的單抗中室溫孵育30-60min；用PBST洗膜3-4次，每次3min；NC膜放入適度稀釋的AP酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗中室溫孵育30-60min；PBST洗膜4-5次，每次3min；66μL NBT和33μL BCIP底物(Promega)加入到10ml底物緩沖液(0.1mol/L Tris Cl、0.1mol/L NaCl、0.025mol/L MgCl、pH9.5)中混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，顯色10-20min，肉眼觀察結(jié)果，待陽性對照顯色明顯紫色，而陰性對照沒有任何顯色時，在自來水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。

2.2 dot-ELISA方法檢測靈敏度和特異性的確定

用常規(guī)方陣試驗(yàn)確定dot-ELISA方法中BYDV PAV的單抗和酶標(biāo)二抗的最適工作濃度，試驗(yàn)表明24G4單抗及酶標(biāo)二抗的最適工作濃度分別為1:5 000和1:7 000倍稀釋。以上述抗體的最適工作濃度建立檢測BYDV PAV的dot-ELISA方法。靈敏度分析表明，當(dāng)感染BYDV PAV小麥病葉稀釋到1:1 280倍(w/v,g/mL)時，以24G4單抗建立的dot-ELISA方法檢測仍呈現(xiàn)紫色的陽性斑點(diǎn)，即其檢測病葉的靈敏度達(dá)到1:1 280倍稀釋(w/v,g/mL)(圖1)。特異性分析表明，該方法檢測感染BYDV PAV的小麥病葉呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，而檢測小麥矮縮病毒、中國小麥花葉病毒、小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒、大麥黃矮病毒GPV株系和GAV株系以及健康小麥植物組織均呈陰性反應(yīng)(圖2)。

2.3 dot-ELISA方法的應(yīng)用

用建立的dot-ELISA方法對2016年采自陜西省的田間疑似發(fā)病樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，23個檢測樣品中有12個樣品產(chǎn)生紫色的陽性斑點(diǎn)(圖3)，樣品同時用PCR方法進(jìn)行分析，結(jié)果表明所有dot-ELISA檢測到的陽性樣品中均能擴(kuò)增到BYDV PAV的特異性基因片段，而所有陰性樣品中均未擴(kuò)增到任何基因片段。PCR產(chǎn)物核酸測序表明dot-ELISA檢測陽性樣品確實(shí)感染BYDV PAV，說明該dot-ELISA方法能準(zhǔn)確、可靠地用于植物樣品中大麥黃矮病毒PAV株系的檢測。

3.大麥黃矮病毒PAV株系dot-ELISA檢測試劑盒

1)試劑盒主要成分：

以上試劑均保存于4℃下

硝酸纖維素膜(NC) 10張

2)檢測植物樣品檢測的操作步驟：

a.將植物樣品稱重后用液氮在研缽中研磨成粉末，按1:20的比例(w/v,g/mL)加入0.01M PBS(pH7.4)后繼續(xù)研磨、勻漿3min；

b.勻漿液5 000rpm離心3min；

c.取3μL上清點(diǎn)到NC上，同時設(shè)置健康和感染BYDV PAV的小麥植物組織粗提液分別作為陰性和陽性對照，室溫干燥10-20min；

d.NC膜浸入到含5％脫脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01M PBS)封閉液中室溫封閉30min；

e.NC膜放入1:5 000倍稀釋的單抗中室溫孵育30-60min；

f.用PBST洗膜3-4次，每次3min，然后將NC膜放入1:6 000倍稀釋的AP酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗中室溫孵育30-60min；

g.用PBST洗膜4-5次，每次3min，66μL NBT和33μL BCIP底物加入到10mL底物緩沖液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl₂，pH9.5)中并混勻，膜放入底物液中顯色，肉眼觀察結(jié)果；

h.待陽性對照顯色明顯紫色，而陰性對照沒有任何顯色時用自來水漂洗NC膜終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。

3)保存及有效期

于2-8℃避光保存，有效期12個月。

4)緩沖液配方：

磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01M，pH7.4)：

加蒸餾水950mL溶解后調(diào)pH至7.4，定容至1000mL

ELISA洗滌液(0.01M PBST)：

1000mL 0.01M PBS中加0.5mL Tween-20

ELISA封閉液：

0.01M PBST中加入脫脂奶粉至終濃度5％(w/v)。