專利名稱：柯薩奇病毒b3型病毒樣顆粒的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒的制備方法，特別涉及利用經(jīng)過密碼子優(yōu)化的柯薩奇病毒B3型Pl (VP1、VP2、VP3和VP4)基因，通過酵母表達(dá)系統(tǒng)制備柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
病毒性心肌炎(vital myocarditis, VMC)是由多種病毒引起心肌的非特異性炎癥病變，病程較長，數(shù)月可康復(fù)，其中少數(shù)病人會(huì)轉(zhuǎn)變成慢性。能引起病毒性心肌炎的病毒中，最普遍的是腸道病毒與腺病毒(Yajima T, Knowlton KU. Viral myocarditis: from the perspective of the virus. Circulation. 2009，119 (19) : 2615-2624.),而腸道病毒中的柯薩奇病毒B3(Coxsackievirus B3，CVB3)是其主要病原體(Yuan J, Yu M, Lin Qff et al. Thl7cells contribute to viral replication in coxsackievirus B3_induced acute viralmyocarditis. J Tmmunol. 2010, 185(7) :4004-4010.)。在心肌炎與其晚期即擴(kuò)張型心肌病病例中，有 5-50% 是由 CVB3 感染引起的(Maisch B, Ristic AD, Hufnagel G, Pankuweit
S.Pathophysiology of viral myocarditis:the role of humoral immune response.Cardiovasc Pathol. 2002 ；11:112-22.)。另外，柯薩奇病毒B3型與很多人類其它疾病相關(guān)，無菌性腦炎與胰腺炎，并且調(diào)查顯示CVB或許與胰島素依賴型糖尿病的發(fā)病相關(guān)(Andreas Henke, Nadine Jaraschand Peter ffutzler.Coxsackievirus B3 vaccines:use as an expression vector forprevention of myocarditis. Expert Rev. Vaccines. 2008，7(10)，1557-1567. X柯薩奇病毒B3型屬小RNA病毒，其毒粒為二十面體形，立體對(duì)稱，呈球形狀，是裸露的核衣殼，直徑約為23-30nm，無包膜。病毒基因組為約7kb的單鏈RNA，其組成從5’端到3’端的方向依次為5’端非編碼區(qū)，Pl區(qū)、P2區(qū)、P3區(qū)和一段3’端非編碼區(qū)。Pl區(qū)編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，即衣殼蛋白(capsule protein),其轉(zhuǎn)錄及翻譯產(chǎn)物經(jīng)蛋白酶水解后，最終得到4個(gè)蛋白產(chǎn)物，分別為VP4 (1A)，VP2 (1B)，VP3 (IC)及VPl (ID)0主要的中和抗原位點(diǎn)就在Pl區(qū)的VPl上，VP2和VP3上也含有一些中和型的抗原決定簇，但它們存在的區(qū)域是在非保守序列中。VP4序列呈高度保守，不暴露在衣殼的外表面，所以不具有中和性抗原決定簇。P2區(qū)呈現(xiàn)P2A、P2B和P2C三個(gè)部分。P2A蛋白的這一區(qū)域是起抑制宿主細(xì)胞mRNA轉(zhuǎn)錄作用的。P2B的功能與轉(zhuǎn)膜作用有關(guān)，而P2C蛋白據(jù)推測(cè)其參與病毒RNA基因組的復(fù)制。P3區(qū)中，VPg (P3A)前體通過加工成為成熟的VPg。P3C是一個(gè)蛋白酶，可以自動(dòng)催化自我剪切釋放。3D是一個(gè)RNA合成酶，是在RNA復(fù)制過程中的依賴RNA的RNA多聚酶，它可以復(fù)制合成病毒的RNA。研究人員已采用多種方法研究相關(guān)疫苗，并且利用動(dòng)物模型證明了其預(yù)防急性感染或心肌炎的潛能，其中包括亞單位疫苗，滅活病毒疫苗，減毒活疫苗或DNA疫苗。然而，這些方法存在危險(xiǎn)性，甚至存在不能刺激機(jī)體產(chǎn)生理想的免疫反應(yīng)的可能。例如，減毒或滅活病毒疫苗存在逆轉(zhuǎn)成有毒力的形式的危險(xiǎn)或者不完全滅活，將導(dǎo)致接種者患病。目前，還沒有預(yù)防感染CVB3的特效藥或疫苗上市，因此，研制CVB3預(yù)防性疫苗對(duì)于控制病毒性心肌炎的流行具有重要意義。而病毒樣顆粒在形態(tài)上和真實(shí)的病毒類似，并且不含有潛在的致病病毒基因組，所以病毒樣顆粒為抗病毒預(yù)防性疫苗的開發(fā)提供了理想的備選方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種柯薩奇病毒B3病毒樣顆粒的制備方法。并且本方法可應(yīng)用于柯薩奇B型病毒 (B1-B6)的病毒樣顆粒制備。本發(fā)明所提供的柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒的制備方法具體可包括如下步驟I)將柯薩奇病毒B3型的VPl基因和VP4基因克隆到目的質(zhì)粒I中，得到重組表達(dá)載體1，將VP2基因和VP3基因克隆到目的質(zhì)粒2中，得到重組表達(dá)載體2 ；2)用步驟I)得到的重組表達(dá)載體I和重組表達(dá)載體2共轉(zhuǎn)化目的酵母細(xì)胞，得到表達(dá)所述VPl基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因的重組酵母細(xì)胞；3)裂解步驟2)得到的重組酵母細(xì)胞，分離得到柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒。上述步驟I)中，所述VPl基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因均為經(jīng)過密碼子優(yōu)化的基因；所述優(yōu)化為在不改變野生型柯薩奇病毒B3型VPl蛋白、VP2蛋白、VP3蛋白和VP4蛋白的前提下，將野生型柯薩奇病毒B3型VPl基因、VP2基因、VP3基因和VP4基因的密碼子替換為酵母細(xì)胞偏好(高頻使用)的密碼子。所述優(yōu)化還包括對(duì)VPl基因、VP2基因、VP3基因和VP4基因序列的其他改造，以適合在酵母細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明中使用的術(shù)語“偏好的密碼子”具有本領(lǐng)域公知的含義，也稱為密碼子的偏好性(CodonPreference)，是指某些生物體更偏愛使用某些同義三聯(lián)密碼子(即編碼相同氨基酸的密碼子)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，上述步驟I)中所述VPl基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因(經(jīng)過密碼子優(yōu)化的基因，命名為CVB3VP1Y、CVB3VP2Y、CVB3VP3Y和CVB3VP4Y)的核苷酸序列為序列表中序列2、序列3、序列4和序列5所示。為適合在酵母細(xì)胞中表達(dá)，根據(jù)本發(fā)明描述的方法對(duì)柯薩奇病毒B3型的VPl基因、VP2基因、VP3基因和VP4基因進(jìn)行改造獲得的其他基因序列也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述步驟2)中，所述目的酵母細(xì)胞可為釀酒酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述目的酵母細(xì)胞具體為釀酒酵母INVSCl。所述VPl基因和所述VP4基因在所述重組表達(dá)載體I中各由一個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄，驅(qū)動(dòng)所述VPl基因的啟動(dòng)子方向和驅(qū)動(dòng)所述VP4基因的啟動(dòng)子方向相反。所述VP2基因和所述VP3基因在所述重組表達(dá)載體2中各由一個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄，驅(qū)動(dòng)所述VP2基因的啟動(dòng)子方向和驅(qū)動(dòng)所述VP3基因的啟動(dòng)子方向相反。在本發(fā)明中，所述VPl基因在所述重組表達(dá)載體I中由GALlO啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄,所述VP4基因在所述重組表達(dá)載體I中由GALl驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄。所述VP2基因在所述重組表達(dá)載體2中由GALlO啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄，所述VP3基因在所述重組表達(dá)載體2中由GALl啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組表達(dá)載體I為將所述VPl基因和所述VP4基因分別插入到pESC-URA的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)處，得到的所述VPl基因和所述VP4基因各由一個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的重組質(zhì)粒；所述重組表達(dá)載體2為將所述VP2基因和所述VP3基因分別插入到PESC-HIS的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)處，得到的所述VP2基因和所述VP3基因各由一個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的重組質(zhì)粒。具體地，將所述VPl基因插入到所述pESC-URA的多克隆位點(diǎn)I(MCSI/FLAG)的Spe I和Pac I之間，得到中間質(zhì)粒I，再將所述VP4基因插入到所述中間質(zhì)粒I的多克隆位點(diǎn)2 (MCS2/myc)的BamH I和Kpn I之間，即得到所述重組表達(dá)載體I。將所述VP2基因插入到所述pESC-HIS的多克隆位點(diǎn)I (MCS1/FLAG)的Spe I和Pac I之間，得到中間質(zhì)粒2，再將所述VP3基因插入到所述中間質(zhì)粒2的多克隆位點(diǎn)2 (MCS2/myc)的BamH I和Xho I之間，即得到所述重組表達(dá)載體2。利用本發(fā)明所提供的方法制備得到的柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供密碼子優(yōu)化型的柯薩奇病毒B3型的VPl基因、VP2基因、VP3基因和VP4基因中的至少一種。本發(fā)明所提供的密碼子優(yōu)化型的柯薩奇病毒B3型的VPl基因、VP2基因、VP3基因和VP4基因(CVB3VP1Y、CVB3VP2Y、CVB3VP3Y和CVB3VP4Y)的核苷酸序列依次為序列表·中序列2-序列5所示。這四個(gè)基因均來自于密碼子優(yōu)化型的柯薩奇病毒B3型的Pl基因(CVB3P1Y基因，其核苷酸序列為序列表中序列I所示)。為適合在酵母細(xì)胞中表達(dá)，根據(jù)本發(fā)明描述的方法對(duì)柯薩奇病毒B3型的VPl基因、VP2基因、VP3基因和VP4基因中的至少一種進(jìn)行改造獲得的其他基因序列也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。其中，序列I由2565個(gè)核苷酸組成，為優(yōu)化后柯薩奇病毒B3型Pl基因的編碼序列，其編碼所得的蛋白為序列表中序列7所示的蛋白，序列7由854個(gè)氨基酸組成；序列2由858個(gè)核苷酸組成，為優(yōu)化后柯薩奇病毒B3型VPl基因的編碼序列，其編碼所得的蛋白為Met (起始密碼子ATG編碼)+序列表中序列7的第571-854位所示的蛋白，由285個(gè)氨基酸組成；序列3由795個(gè)核苷酸組成，為優(yōu)化后的柯薩奇病毒B3型VP2基因的編碼序列，其編碼所得的蛋白為Met (起始密碼子ATG編碼)+序列表中序列7的第70-332位所示的蛋白，由264個(gè)氨基酸組成；序列4由720個(gè)核苷酸組成，為優(yōu)化后的柯薩奇病毒B3型VP3基因的編碼序列，其編碼所得的蛋白為Met (起始密碼子ATG編碼)+序列表中序列7的第333-570位所示的蛋白，由239個(gè)氨基酸組成；序列5由210個(gè)核苷酸組成，為優(yōu)化后的柯薩奇病毒B3型VP4基因的編碼序列，其編碼所得的蛋白為序列表中序列7的第1-69位所示的蛋白，由69個(gè)氨基酸組成。含有上述密碼子優(yōu)化型的柯薩奇病毒B3型的所述VPl基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因中的至少一種的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。在本發(fā)明中，所述重組表達(dá)載體具體為將所述VPl基因和所述VP4基因分別插入到pESC-URA質(zhì)粒的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)處得到的重組質(zhì)粒；以及將所述VP2基因和所述VP3基因分別插入到pESC-HIS質(zhì)粒的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)處，得到的重組質(zhì)粒。所述重組菌可為攜帶有上述密碼子優(yōu)化型的柯薩奇病毒B3型的所述VPl基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因中的至少一種的重組酵母細(xì)胞。所述酵母細(xì)胞可為釀酒酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述酵母細(xì)胞具體為釀酒酵母INVSC1。所述表達(dá)盒由能夠啟動(dòng)所述密碼子優(yōu)化型的柯薩奇病毒B3型的所述VPl基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因中的至少一種表達(dá)的啟動(dòng)子，所述密碼子優(yōu)化型的柯薩奇病毒B3型的所述VPl基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因中的至少一種，以及轉(zhuǎn)錄終止子組成。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述啟動(dòng)子具體為釀酒酵母GALl和GALlO啟動(dòng)子，當(dāng)然也可以使用其他公知的酵母啟動(dòng)子的任何一種，如GAL7、ADHU ADH3和PGK啟動(dòng)子，或者其他真核基因啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述轉(zhuǎn)錄終止子具體為ADHl和CYCl終止子。上述密碼子優(yōu)化型的柯薩奇病毒B3型的所述VPl基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因中的至少一種在制備下述a)或b)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍a)柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒；b)以柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒為活性成分的預(yù)防性疫苗。 本發(fā)明還涉及并提供了在重組宿主細(xì)胞中同時(shí)分別表達(dá)CVB3VP1蛋白、CVB3VP2蛋白、CVB3VP3蛋白和CVB3VP4蛋白的方法，該方法包括(I)將含有所述CVB3VP1蛋白、所述CVB3VP2蛋白、所述CVB3VP3蛋白和所述CVB3VP4蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入重組宿主細(xì)胞，如重組的酵母細(xì)胞(釀酒酵母INVSC1)。(2)在允許所述CVB3VP1蛋白、CVB3VP2蛋白、CVB3VP3蛋白和CVB3VP4蛋白同時(shí)表達(dá)的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，如重組的酵母細(xì)胞(釀酒酵母INVSCl )。本發(fā)明對(duì)野生型的柯薩奇病毒B3型(Coxsackievirus B3, CVB3)的Pl基因進(jìn)行了酵母細(xì)胞偏好型密碼子優(yōu)化，并以此為模板擴(kuò)增出CVB3VP1、CVB3VP2、CVB3VP3和CVB3VP4四種基因，從而提高CVB3VPI蛋白、CVB3VP2蛋白、CVB3VP3蛋白和CVB3VP4蛋白在酵母細(xì)胞中的表達(dá)水平。在本發(fā)明中，CVB3VP1蛋白、CVB3VP2蛋白、CVB3VP3蛋白和CVB3VP4蛋白四種結(jié)構(gòu)蛋白在酵母細(xì)胞中同時(shí)分別表達(dá)。這四種結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)而自行組裝成柯薩奇病毒B3型的病毒樣顆粒(CVB3 VLPs )。實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明所提供的方法，在酵母表達(dá)系統(tǒng)(釀酒酵母INVSC1)中成功的制備了 CVB3 VLPs0所述CVB3 VLPs可以用于制備基于VLP的CVB3預(yù)防性疫苗。


圖I為CVB3VP1Y基因和CVB3VP2Y基因PCR擴(kuò)增回收產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，用泳道A為15000bp DNA Marker ;泳道8為CVB3VP1Y基因PCR產(chǎn)物；泳道C為CVB3VP2Y基因PCR產(chǎn)物。圖2為pESC-URA-VPlY質(zhì)粒的Spe I及Pac I酶切鑒定結(jié)果。其中，用泳道A為15000bp DNA Marker ;泳道B為pESC_URA_VPlY質(zhì)粒的Spe I及Pac I酶切鑒定結(jié)果；泳道C為pESC-URA-VPlY質(zhì)粒對(duì)照。圖3為pESC-HIS-VP2Y質(zhì)粒的Spe I及Pac I酶切鑒定結(jié)果。其中，用泳道A為15000bp DNA Marker ;泳道B和泳道C為pESC_HIS_VP2Y質(zhì)粒的Spe I及Pac I酶切鑒定結(jié)果。圖4為CVB3VP3Y基因和CVB3VP4Y基因PCR擴(kuò)增回收產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，用泳道A為100-6000bp DNA Marker ；泳道B為CVB3VP3Y基因PCR產(chǎn)物；泳道C為CVB3VP4Y基因PCR產(chǎn)物。圖5為PESC-URA-VP1Y-VP4Y質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，用泳道A為15000bpDNA Marker ;泳道 B 為 pESC_URA_VPlY 質(zhì)粒對(duì)照；泳道 C 為 pESC-URA_VPlY_VP4Y 質(zhì)粒。圖6為pESC-HIS-VP2Y-VP3Y質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，用泳道A為15000bpDNA Marker ;泳道 B 和泳道 C 為 pESC_HIS-VP2Y_VP3Y 質(zhì)粒；泳道 D 為 pESC_HIS_VP2Y 質(zhì)粒對(duì)照。圖7為pESC-URA-VPlY-VP4Y質(zhì)粒的BamH I及Kpn I酶切鑒定結(jié)果。其中，泳道A 為 2000bp DNA Marker ;泳道 B 為 pESC-URA_VPlY_VP4Y 質(zhì)粒的 BamH I 及 Kpn I 酶切鑒定結(jié)果。圖8為pESC-HIS-VP2Y-VP3Y質(zhì)粒的BamH I及Xho I酶切鑒定結(jié)果。其中，泳道A 為 15000bp DNA Marker ;泳道 B 為 pESC-HIS-VP2Y_VP3Y 質(zhì)粒的 BamH I 及 Xho I 酶切鑒
定結(jié)果。
圖9為Western Blot鑒定重組CVB3衣殼蛋白的表達(dá)。其中，泳道A為蛋白分子量對(duì)照；泳道B為INVSCl/pESC-4VP蛋白提取物；泳道C為INVSCl/pESC酵母蛋白提取物。圖10為通過透射電鏡技術(shù)顯現(xiàn)的CVB3病毒樣顆粒(VLPs)的代表樣品。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I、CVB3 Pl基因的密碼子優(yōu)化及全基因合成以下按分步驟詳細(xì)描述CVB3 Pl基因的密碼子優(yōu)化及全基因合成的流程。I、CVB3 Pl基因的密碼子優(yōu)化根據(jù)野生型CVB3 Pl基因序列(命名為CVB3P1W基因，如序列表中序列6所示)，經(jīng)過設(shè)計(jì)和反復(fù)驗(yàn)證得到適合于在酵母細(xì)胞中表達(dá)的優(yōu)化型CVB3 Pl基因序列(命名為CVB3P1Y基因，如序列表中序列I所示)，即將CVB3病毒的Pl基因序列在不改變氨基酸序列的前提下轉(zhuǎn)變成含有如 Sharp PM 等(Sharp PM, Cowe E. Synonymous Codon UsageinSaccharomyces cerevisiae. Yeast, 1991, 7 (7) : 657-678.)所描述的酵母優(yōu)選密碼子的優(yōu)化序列，從而提高CVB3 VP1、VP2、VP3和VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白在酵母細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中的表達(dá)水平。根據(jù)上述方法，最終獲得按酵母密碼子偏好設(shè)計(jì)的優(yōu)化型CVB3 Pl基因(CVB3P1Y基因)，其基因序列為序列表中序列I。CVB3P1Y基因(序列I)編碼的蛋白與序列6所示野生型CVB3P1W基因編碼的蛋白一致，均為序列表中序列7所示氨基酸序列組成的蛋白。2、密碼子優(yōu)化型CVB3 Pl基因的全基因合成使用序列重疊延伸PCR法全基因合成CVB3P1Y基因，具體方法如下根據(jù)優(yōu)化CVB3PlY基因序列合成多條IOObp的上下游片段，兩片段間3’端互補(bǔ)重疊15bp，所述上下游片段互為模板、引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用凝膠回收試劑盒回收擴(kuò)增片段，再以此相鄰的回收片段互為引物、模板進(jìn)行下一輪PCR擴(kuò)增，得到拼接序列，再以相鄰拼接序列互為模板、引物進(jìn)行PCR拼接，回收拼接序列片段，在依此序列互為模板、引物進(jìn)行PCR拼接，依此類推最終合成全長的密碼子優(yōu)化型CVB3 Pl基因，即CVB3P1Y基因。本實(shí)驗(yàn)中CVB3 PlY基因由公司(北京博邁德科技發(fā)展有限公司)進(jìn)行全基因合成并構(gòu)建到PGH質(zhì)粒載體上交付保存使用。
實(shí)施例2、攜帶CVB3 VP1、VP2、VP3和VP4基因的酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建I、大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備從37°C培養(yǎng)16 20h的新鮮平板上挑取DH5a單菌落(Takara公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為D9057S)，接種于5ml不含抗菌素的LB培養(yǎng)基中，37°C 劇烈振蕩培養(yǎng)過夜(12 16h)。次日從上述培養(yǎng)物中吸取O. 5ml按體積比1:100轉(zhuǎn)入50ml LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)約3h，至菌液的0D600值為3時(shí)，在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一無菌、用冰預(yù)冷的50ml離心管中，冰浴30min。在4°C條件下,4000rpm離心IOmin,棄上清,將管倒置Imin,使殘留培養(yǎng)液流盡，以IOml用冰預(yù)冷的IOOmM的CaCl2溶液重懸細(xì)菌沉淀，冰浴30min。4°C, 4000rpm離心IOmin,棄上清，每50ml初始培養(yǎng)物用2ml預(yù)冷的含15%甘油的IOOmM的CaCl2溶液重懸細(xì)菌沉淀，分裝成200 μ I每管，_80°C保存?zhèn)溆谩?、pESC-URA 與 pESC-HIS 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化用無菌吸頭分別吸取I μ g pESC-URA質(zhì)?；騪ESC_HIS質(zhì)粒(具有雙向啟動(dòng)子的酵母表達(dá)質(zhì)粒，均購自Angilent technologies, pESC-URA質(zhì)粒的產(chǎn)品目錄號(hào)為217454,pESC-HIS質(zhì)粒的產(chǎn)品目錄號(hào)為217451)加入200 μ I上述步驟I制備的DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30min。將管移入42°C水浴箱中水浴90s，然后將管快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻I 2min。每管加入800 μ I不含抗生素的LB培養(yǎng)基(蛋白胨、酵母提取物、氨芐青霉素購自北京欣經(jīng)科公司，NaCl購自國藥化學(xué)試劑有限公司)，將管轉(zhuǎn)移至37°C搖床上，溫育45min(轉(zhuǎn)速< 150rpm)。取50 μ I已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞,用一無菌的彎頭玻棒輕輕涂到含相應(yīng)抗生素的LB平板表面，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養(yǎng)12 16h。3、pESC-URA質(zhì)?；騪ESC-HIS質(zhì)粒的小量制備挑取經(jīng)上述步驟2轉(zhuǎn)化培養(yǎng)所得的單菌落接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)物移入I. 5ml Eppendorf管中，12000rpm離心30_60s，倒去培養(yǎng)液，倒置離心管，使上清流盡，用100 μ I預(yù)冷的溶液I (終濃度為50mmol/L的葡萄糖，終濃度為25mmol/L的Tris-HCl，終濃度為10mmol/L的EDTA，pH8. 0)重懸菌體，劇烈振蕩混勻；加入200 μ I新鮮配制的溶液11(終濃度為0. 2mol/L的NaOH，終濃度為質(zhì)量百分含量1%的SDS)，溫和混勻，冰浴3min，至液體清亮；加入150 μ I預(yù)冷的溶液III (配制IOOml溶液 III 5mol/L KAc 60ml，冰乙酸 11. 5ml，水 28. 5ml)溫和混勻，冰浴 IOmin, 12000rpm離心lOmin，小心吸取上清，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入2倍體積的無水乙醇室溫沉淀30min, 12000rpm離心IOmin,棄上清,沉淀用70%乙醇洗一次，室溫晾干后，用30 μ I含RNaseA (100μ g/ml)的 TE (pH 8.0)溶解沉淀，37°C水浴 3(T60min 后置 _20°C保存?zhèn)溆谩?、酵母重組表達(dá)載體pESC-URA-VPlY質(zhì)粒與pESC-HIS_VP2Y質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)實(shí)施例I得到的CVB3P1Y基因序列(序列I)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，并利用實(shí)施例I得到的CVB3P1Y基因?yàn)槟０宸謩e擴(kuò)增出CVB3 VPlY基因和CVB3VP2Y基因。再將所述CVB3VP1Y基因克隆到pESC-URA質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)I (MCS1/FLAG)的Spe I和Pac I之間，得到酵母重組表達(dá)載體ESC-URA-VPIY ;將所述CVB3VP2Y基因克隆到pESC-HIS質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)I(MCS1/FLAG)的Spe I和Pac I之間，得到酵母重組表達(dá)載體pESC-HIS_VP2Y。具體按照如下步驟進(jìn)行I)根據(jù)實(shí)施例I得到的CVB3P1Y基因序列(序列I)設(shè)計(jì)擴(kuò)增CVB3VP1Y基因和CVB3VP2Y基因的兩對(duì)引物，將所述CVB3 VPlY基因和所述CVB3VP2Y基因在5’端均引入限制性內(nèi)切酶SpeI的識(shí)別位點(diǎn)，3’端均引入限制性內(nèi)切酶Pac I的識(shí)別位點(diǎn)(限制性內(nèi)切酶Spe I及Pac I購自大連寶生物工程有限公司)。具體操作如下(I)以實(shí)施例I得到的CVB3P1Y基因(如序列表中序列I所示)為模板，用引物VPl-UP和VPl-DOWN進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到5’端和3’端分別引入限制性內(nèi)切酶Spe I和Pac I酶切位點(diǎn)的CVB3VP1Y基因片段(圖I)。(2)以實(shí)施例I得到的CVB3P1Y基因(如序列表中序列I所示)為模板，用引物VP2-UP和VP2-D0WN進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到5’端和3’端分別引入限制性內(nèi)切酶Spe I和Pac I酶切位點(diǎn)的CVB3VP2Y基因片段(圖I)。VPl-UP 5，-GGACTAGTACCATGGGTCCAGTTGAAGATGCTG-3，(下劃線處為限制性內(nèi)切酶Spe I酶切位點(diǎn)的序列，該序列的第15-33位為序列I的第1711-1729位)VPl-DOffN 5，-CCTTAATTAATTAGAAAGCACCAGTATTAGT-3，(下劃線處為限制性內(nèi)切酶Pac I酶切位點(diǎn)的序列，其后的序列為序列I的第2545-2565位的反向互補(bǔ)序列) VP2-UP:5’ -GGACTAGTACCATGTCTCCAACTGTTGAAGAATG-3> (下劃線處為限制性內(nèi)切酶Spe I酶切位點(diǎn)的序列，該序列的第15-34位為序列I的第208-227位)VP2-D0WN :5’-CCTTAATTAATTATTGATGACCAGCCAATCTCA-3’(下劃線處為限制性內(nèi)切酶Pac I酶切位點(diǎn)的序列，該序列的第14-33位為序列I的第977-996位的反向互補(bǔ)序列)2)使用限制性內(nèi)切酶Spe I和Pac I酶切上述步驟3制備的pESC-URA質(zhì)粒和pESC-HIS質(zhì)粒，回收骨架載體(大片段，由于小片段大小僅約為45bp，瓊脂糖凝膠電泳時(shí)經(jīng)常無法顯示)，與經(jīng)同樣酶切的CVB3VP1Y基因(或CVB3VP2Y基因)片段按摩爾比I :4比例混合，依次加入10XT4 DNA連接酶緩沖液和T4 DNA連接酶(T4 DNA連接酶及10XT4 DNA連接酶緩沖液購自大連寶生物工程有限公司)，反應(yīng)體積為20μ 1，16°C連接過夜，取10μ I連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。從接種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的LB瓊脂平板上挑取若干個(gè)單菌落，接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)過夜，按步驟3所述質(zhì)粒的快速小量制備方法提取重組質(zhì)粒。并用內(nèi)切酶Spe I及Pac I對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖2和圖3所示，圖2中分別得到大小約為6600bp和860bp (CVB3VP1Y基因)的兩個(gè)條帶，圖3中分別得到大小約為6700bp和800bp (CVB3VP2Y基因)的兩個(gè)條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，進(jìn)一步經(jīng)酶切鑒定后的重組質(zhì)粒送公司測(cè)序，將測(cè)序證實(shí)含有CVB3VP1Y基因(序列2)的重組質(zhì)粒命名為pESC-URA-VPlY，含有CVB3VP2Y基因(序列3)的重組質(zhì)粒命名為pESC-HIS-VP2Y。其中，序列2編碼Met (起始密碼子ATG編碼)+序列表中序列7的第571-854位所示的由285個(gè)氨基酸組成的蛋白；序列3編碼Met (起始密碼子ATG編碼)+序列表中序列7的第70-332位所示的由264個(gè)氨基酸組成的蛋白。5、酵母重組表達(dá)載體 pESC-URA-VPlY-VP4Y 與 pESC_HIS-VP2Y_VP3Y 的構(gòu)建根據(jù)實(shí)施例I得到的CVB3P1Y基因序列(序列I)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，并利用實(shí)施例I得到的CVB3P1Y基因?yàn)槟０宸謩e擴(kuò)增出CVB3 VP3Y基因和CVB3VP4Y基因。再將所述CVB3VP4Y基因克隆到上述步驟4制備的酵母重組表達(dá)載體pESC-URA-VPlY的多克隆位點(diǎn)2 (即為pESC-URA質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)2，MCS2/myc)的BamH I和Kpn I之間，得到酵母重組表達(dá)載體PESC-URA-VP1Y-VP4Y。將所述CVB3VP3Y基因克隆到上述步驟4制備的酵母重組表達(dá)載體PESC-HIS-VP2Y的多克隆位點(diǎn)2 (即為pESC-HIS質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)2，MCS2/myc)的BamH I和Xho I之間，得到酵母重組表達(dá)載體pESC-HIS-VP2Y-VP3Y。具體按照如下步驟進(jìn)行
I)根據(jù)實(shí)施例I得到的CVB3P1Y基因序列(序列I)設(shè)計(jì)擴(kuò)增CVB3VP3Y基因和CVB3VP4Y基因的兩對(duì)引物，將所述CVB3VP3Y基因在5’端引入限制性內(nèi)切酶BamH I的識(shí)另IJ位點(diǎn)，3’端引入限制性內(nèi)切酶Xho I的識(shí)別位點(diǎn)(限制性內(nèi)切酶BamH I及Xho I購自大連寶生物工程有限公司)，所述CVB3VP4Y基因在5’端引入限制性內(nèi)切酶BamH I的識(shí)別位點(diǎn)，3’端引入限制性內(nèi)切酶Kpn I的識(shí)別位點(diǎn)(限制性內(nèi)切酶BamH I及Kpn I購自大連寶生物工程有限公司)。具體操作如下(I)以實(shí)施例I得到的CVB3P1Y基因(如序列表中序列I所示)為模板，用引物VP3-UP和VP3-D0WN進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到5’端和3’端分別弓I入限制性內(nèi)切酶BamH I及Xho I酶切位點(diǎn)的CVB3VP3Y基因片段(圖4)。(2)以實(shí)施例I得到的CVB3P1Y基因(如序列表中序列I所示)為模板，用引物VP4-UP和VP4-D0WN進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到5’端和3’端分別引入限制性內(nèi)切酶BamH I及Kpn I酶切位點(diǎn)的CVB3VP4Y基因片段(圖4)。VP3-UP:5’ -CGGGATCCACCATGGGTTTGCCAACTATGAATAC-3> (下劃線處為限制性內(nèi)切 酶BamH I酶切位點(diǎn)的序列，該序列的第15-34位為序列I的第997-1016位)VP3-D0WN:5’ -CCGCTCGAGTTATTGAAAAAAATTAACTTGAGAA-3’ (下劃線處為限制性內(nèi)切酶Xho I酶切位點(diǎn)的序列，該序列的第13-34位為序列I的第1689-1710位的反向互補(bǔ)序列)VP4-UP 5 ’ -CGGGATCCACCATGGGTGCTCAAGTTTCTAC-3 ’(下劃線處為限制性內(nèi)切酶BamH I酶切位點(diǎn)的序列，該序列的第12-31位為序列I的第1_20位)VP4-D0WN:5’ -GGGGTACCTTAATTCAAAGCTGGCAAAGATTT-3’ (下劃線處為限制性內(nèi)切酶Kpn I酶切位點(diǎn)的序列，該序列的第12-32位為序列I的第187-207位的反向互補(bǔ)序列)。2)使用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I酶切上述步驟4制備的酵母重組表達(dá)載體PESC-HIS-VP2Y，限制性內(nèi)切酶BamH I和Kpn I酶切上述步驟4制備的酵母重組表達(dá)載體pESC-URA-VPlY。pESC-HIS_VP2Y的回收骨架載體(大片段)與經(jīng)同樣酶切的CVB3VP3Y基因(BamH I和Xho I酶切)按摩爾比I 4比例混合(DNA Marker和DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自大連寶生物工程有限公司)；pESC-URA-VPlY的回收骨架載體(大片段)與經(jīng)同樣酶切的CVB3VP4Y基因(BamH I和Kpn I)按摩爾比I 4比例混合(DNA Marker和DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自大連寶生物工程有限公司)；在上述兩個(gè)混合體系中再分別依次加入10XT4 0嫩連接酶緩沖液和了40嫩連接酶，反應(yīng)體積為2(^1，161連接過夜，取1(^1連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。從接種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的LB瓊脂平板上挑取若干個(gè)單菌落，接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)過夜，按步驟3所述質(zhì)粒的快速小量制備方法提取重組質(zhì)粒(圖5、圖6)。并用內(nèi)切酶BamH I及Kpn I對(duì)圖5所示重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖7所示，得到大小約為7500bp和210bp(CVB3VP4Y基因)的兩個(gè)條帶；內(nèi)切酶BamH I及Xho I對(duì)圖6所示重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖8所示，得到大小約為7500bp和720bp (CVB3VP3Y基因)的兩個(gè)條帶；兩個(gè)重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果均與預(yù)期結(jié)果相符，進(jìn)一步經(jīng)酶切鑒定后的重組質(zhì)粒送公司測(cè)序，將測(cè)序證實(shí)含有CVB3VP3Y基因(序列4)的重組質(zhì)粒命名為pESC-HIS-VP2Y-VP3Y，含有CVB3VP4Y基因(序列5)的重組質(zhì)粒命名為PESC-URA-VP1Y-VP4Y。其中，序列4編碼Met (起始密碼子ATG編碼)+序列表中序列7的第333-570位所示的由239個(gè)氨基酸組成的蛋白；序列5編碼序列表中序列7的第1-69位所示的由69個(gè)氨基酸組成的蛋白。酵母重組表達(dá)載體中，啟動(dòng)所述CVB3VP1Y基因和CVB3VP2Y基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為釀酒酵母GALlO啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄終止子為ADHl終止子；啟動(dòng)所述CVB3VP3Y基因和CVB3VP4Y基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為釀酒酵母GALl啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄終止子為CYCl終止子。實(shí)施例3、重組CVB3病毒樣顆粒在酵母細(xì)胞中的大量表達(dá)及純化I、釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備在釀酒酵母平板中挑取單克隆菌落INVScl (Saccharomyces cerevisiae,產(chǎn)品目錄號(hào)C81000，購自Invitrogen)接種于IOml YPD培養(yǎng)液(購自北京欣經(jīng)科公司)中，30°C振搖培養(yǎng)16h，取合適體積的培養(yǎng)物加入48ml YB)培養(yǎng)液中混勻，使其0D600值為O. 5，30°C振搖培養(yǎng)Ih后0D600值為O. 7，繼續(xù)培養(yǎng)30min后，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入50ml無菌的離心管中，室溫1500rpm 離心 5min,棄上清，用 IOml Sc EasyComp transformation kit(購自 Invitrogen)中的溶液I (試劑盒自帶)重懸沉淀，室溫1500rpm離心5min,小心棄上清,用Iml溶液II(試劑盒自帶)重懸沉淀，50 μ I/管分裝滅菌的I. 5ml離心管中，置_70°C保存。·
2、酵母重組表達(dá)載體pESC-URA-VPlY-VP4Y與pESC-HIS-VP2Y_VP3Y共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞將實(shí)施例2制備的酵母重組表達(dá)載體PESC-URA-VP1Y-VP4Y與PESC-HIS-VP2Y-VP3Y各3 μ I共同加入到上述步驟I制備的酵母INVSCl感受態(tài)細(xì)胞中，力口A500 μ I Sc EasyComp transformation kit(購自 Invitrogen)中的溶液 III,在潤旋振蕩器上劇烈振蕩混勻，得到DNA/酵母混合物。將DNA/酵母混合物置30°C水浴中孵育lh，每隔15min在渦旋振蕩器上劇烈振蕩混勻。取100 μ I涂布HIS選擇平板(選擇性培養(yǎng)液(His-)YNB 6. Ig,酵母His營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基粉末(Sigma公司，Y1501) I. 92g，如制平板加入20g瓊脂粉，溶于900ml去離子水中，高壓滅菌，冷卻至50°C，加入IOOml無菌的20%葡萄糖。)，置30°C孵箱中倒置培養(yǎng)2-4天。隨機(jī)挑取5個(gè)單克隆菌落接種于IOml HIS選擇培養(yǎng)液中，30°C振搖培養(yǎng)16h。取上述適量菌液涂布URA選擇平板(選擇性培養(yǎng)液(Ura-) YNB 6. 7g，酵母Ura營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基粉末(Sigma公司，Y1501 )1. 92g，如制平板加入20g瓊脂粉，溶于900ml去離子水中，高壓滅菌，冷卻至50°C，加入IOOml無菌的20%葡萄糖。)，置30°C孵箱中倒置培養(yǎng)2-4天。隨機(jī)挑取5個(gè)單克隆菌落接種于10ml URA選擇培養(yǎng)液中，30°C振搖培養(yǎng)16h。將經(jīng)過鑒定表明成功轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體PESC-URA-VP1Y-VP4Y與pESC-HIS-VP2Y_VP3Y的酵母INVSCl細(xì)胞命名為INVSCl/pESC-4VP。同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)入pESC-URA和pESC-HIS空載體的酵母INVSCl細(xì)胞的對(duì)照，將該酵母細(xì)胞命名為INVSCl/pESC。3、重組CVB3病毒樣顆粒在酵母細(xì)胞中的大量表達(dá)及純化I)重組CVB3病毒樣顆粒在酵母細(xì)胞中的大量表達(dá)將經(jīng)過上述步驟2獲得的INVSCl/pESC-4VP(實(shí)驗(yàn)組)和INVSCl/pESC(陰性對(duì)照組)的培養(yǎng)液取適量，分別接種于IOOmlURA選擇培養(yǎng)液(選擇性培養(yǎng)液(Ura-):YNB 6. 7g，酵母Ura營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基粉末(Sigma公司，Y1501) I. 92g,溶于900ml去離子水中，高壓滅菌，冷卻至50°C,加入IOOml無菌的20%(20g/100ml)葡萄糖。)中，30°C振搖培養(yǎng)8h，取合適體積的培養(yǎng)液接種于500ml URA選擇培養(yǎng)液中，使0D600值為0. 4，30°C振搖培養(yǎng)4h，取合適體積的培養(yǎng)液接種3L URA誘導(dǎo)培養(yǎng)液(YNB 6. 7g，酵母Ura營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基粉末(Sigma公司，Y1501) I. 92g，溶于800ml去離子水中，高壓滅菌，冷卻至50°C，加入IOOml無菌的20% (20g/100ml)半乳糖)，使0D600值為0. 4，30°C振搖培養(yǎng)48h，8000g離心15min收集菌體沉淀，用PBS緩沖液重懸，APV高壓均質(zhì)儀以1500bar循環(huán)破碎3次，4°C 12000g離心30min，收集上清(破碎菌液上清)，置_70°C保存。將I倍體積的50%PEG溶液(50%PEG溶液50g PEG6000 (Ameresco公司)溶于IOOmlddH20)緩慢加入到4倍體積的上述破碎菌液上清中，4°C攪拌過夜。第二日，40C 12000rpm,30min離心，去除上清，收集沉淀。用無菌PBS重懸沉淀，濃縮至樣品原體積的1/10，得到濃縮樣品(實(shí)驗(yàn)組濃縮樣品和陰性對(duì)照組濃縮樣品)。2)重組CVB3病毒樣顆粒的純化在離心管中由下至上依次小心加入I. 4g/ml、I. 34g/ml、l. 29g/ml和I. 25g/ml的CsCl溶液各7ml，取酵母破碎上清液(上述步驟I)中得到的濃縮樣品)置CsCl不連續(xù)密度梯度(CsCl購自北京欣經(jīng)科公司)，4 °C用BeckmanSW32Ti轉(zhuǎn)頭IOOOOOg離心21h，PBS緩沖液重懸沉淀，4°C 13000g離心15min，收集上清液置_70°C保存，得到待測(cè)樣品(實(shí)驗(yàn)組待測(cè)樣品和陰性對(duì)照組待測(cè)樣品)。實(shí)施例4、重組CVB3病毒樣顆粒的鑒定及電鏡觀察對(duì)實(shí)施例3制備的待測(cè)樣品(實(shí)驗(yàn)組待測(cè)樣品和陰性對(duì)照組待測(cè)樣品)進(jìn)行Western Blot鑒定和電鏡觀察。Uffestern Blot鑒定重組CVB3衣殼蛋白的表達(dá)利用碧云天公司的BCA蛋白定量試劑盒(增強(qiáng)型)(P0010S)，按照說明書操作步驟，對(duì)實(shí)施例3得到的純化后的待測(cè)樣品(實(shí)驗(yàn)組待測(cè)樣品和陰性對(duì)照)進(jìn)行蛋白定量。根據(jù)定量結(jié)果，對(duì)兩種待測(cè)樣品各取適量的懸液(保證兩種樣品的上樣蛋白總量相等)進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳。用識(shí)別CVB5 VPl的鼠單克隆抗體為一抗(一抗購自Dako公司，產(chǎn)品編號(hào)為M7064)，(由于CVB病毒的VPl蛋白具有高度的保守性，故此處使用CVB5 VPl單抗驗(yàn)證，參見CVB5 VPl的鼠單克隆抗體說明書)熒光標(biāo)記羊抗鼠抗體為二抗(二抗購自KPL，產(chǎn)品目錄號(hào)為072-07-18-06)進(jìn)行Western Blot分析(蛋白Marker購自Fermentas公司)。結(jié)果如圖9所示，實(shí)驗(yàn)組待測(cè)樣品檢測(cè)到大小約為34KD (VPl)的CVB3特異性條帶；而陰性對(duì)照組待測(cè)樣品未檢測(cè)到CVB3的特異性條帶。2、重組CVB3病毒樣顆粒的電鏡觀察將實(shí)施例3得到的純化后的兩個(gè)待測(cè)樣品(實(shí)驗(yàn)組待測(cè)樣品和陰性對(duì)照)調(diào)整蛋白濃度一致，各取10μ I懸液滴加在覆蓋鍍碳支持膜上靜止lmin，吸干鍍碳支持膜(購自中鏡科儀，編號(hào)BZ110223)表面殘余液體，用2%磷鎢酸(購自中鏡科儀，編號(hào)GZ02536)染色lmin，吸干鍍碳支持膜表面殘液，室溫放置干燥后用透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組待測(cè)樣品(圖10)在電鏡下均可見直徑約30nm左右的病毒樣顆粒的存在而陰性對(duì)照組(空載體)測(cè)樣品則沒有在電鏡下觀察到病毒樣顆粒的存在。本實(shí)施例的結(jié)果表明，攜帶有密碼子優(yōu)化后的CVB3 VP1、VP2、VP3和VP4基因的重組表達(dá)載體在酵母系統(tǒng)中，成功的包裝出CVB3的病毒樣顆粒。
權(quán)利要求
1.柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒的制備方法，包括如下步驟 1)將柯薩奇病毒B3型的VPl基因和VP4基因克隆到目的質(zhì)粒I中，得到重組表達(dá)載體1，將VP2基因和VP3基因克隆到目的質(zhì)粒2中，得到重組表達(dá)載體2 ； 2)用步驟I)得到的重組表達(dá)載體I和重組表達(dá)載體2共轉(zhuǎn)化目的酵母細(xì)胞，得到表達(dá)所述VPl基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因的重組酵母細(xì)胞； 3)裂解步驟2)得到的重組酵母細(xì)胞，分離得到柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述VPl基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因均為經(jīng)過密碼子優(yōu)化的基因；所述優(yōu)化為在不改變野生型柯薩奇病毒B3型VPl蛋白、野生型柯薩奇病毒B3型VP2蛋白、野生型柯薩奇病毒B3型VP3蛋白和野生型柯薩奇病毒B3型VP4蛋白氨基酸序列的前提下，將野生型柯薩奇病毒B3型VPl基因、野生型柯薩奇病毒B3型VP2基因、野生型柯薩奇病毒B3型VP3基因和野生型柯薩奇病毒B3型VP4基因的密碼子均替換為酵母細(xì)胞偏好的密碼子。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述VPl基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因的核苷酸序列分別為序列表中序列2、序列3、序列4和序列5所/Jn ο
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述目的酵母細(xì)胞為釀酒酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述VPl基因和所述VP4基因在所述重組表達(dá)載體I中各由一個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄，驅(qū)動(dòng)所述VPl基因的啟動(dòng)子方向和驅(qū)動(dòng)所述VP4基因的啟動(dòng)子方向相反；所述VP2基因和所述VP3基因在所述重組表達(dá)載體2中各由一個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄，驅(qū)動(dòng)所述VP2基因的啟動(dòng)子方向和驅(qū)動(dòng)所述VP3基因的啟動(dòng)子方向相反。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述重組表達(dá)載體I為將所述VPl基因和所述VP4基因分別插入到pESC-URA的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)處，得到的所述VPl基因和所述VP4基因各由一個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的重組質(zhì)粒；所述重組表達(dá)載體2為將所述VP2基因和所述VP3基因分別插入到pESC-HIS的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)處，得到的所述VP2基因和所述VP3基因各由一個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的重組質(zhì)粒。
7.利用權(quán)利要求1-6中任一所述方法制備得到的柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒。
8.密碼子優(yōu)化型的柯薩奇病毒B3型的VPl基因，其特征在于所述VPl基因的核苷酸序列為序列表中序列2所示；或 密碼子優(yōu)化型的柯薩奇病毒B3型的VP2基因，其特征在于所述VP2基因的核苷酸序列為序列表中序列3所示；或 密碼子優(yōu)化型的柯薩奇病毒B3型的VP3基因，其特征在于所述VP3基因的核苷酸序列為序列表中序列4所示；或 密碼子優(yōu)化型的柯薩奇病毒B3型的VP4基因，其特征在于所述VP4基因的核苷酸序列為序列表中序列5所示。
9.含有權(quán)利要求8所述VPl基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因中至少一種的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
10.權(quán)利要求8所述VPl基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因中至少一種在制備下述a)或b)廣品中的應(yīng)用a)柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒； b)以柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒為活性成分的預(yù)防性疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒的制備方法。本發(fā)明所提供的方法包括如下步驟1)將柯薩奇病毒B3型的VP1基因和VP4基因克隆到目的質(zhì)粒1中，得到重組表達(dá)載體1，將VP2基因和VP3基因克隆到目的質(zhì)粒2中，得到重組表達(dá)載體2；2)用步驟1)得到的重組表達(dá)載體1和重組表達(dá)載體2共轉(zhuǎn)化目的酵母細(xì)胞，得到表達(dá)所述VP1基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因的重組酵母細(xì)胞；3)裂解步驟2)得到的重組酵母細(xì)胞，分離得到柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒。實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明所提供的方法，在酵母表達(dá)系統(tǒng)中成功的制備了柯薩奇病毒B3型的病毒樣顆粒，可將其進(jìn)一步用于病毒性心肌炎與I型糖尿病候選預(yù)防性疫苗和藥物組合物。
文檔編號(hào)C12N15/41GK102899336SQ20121034998
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者盛望, 張瀟, 趙淼, 王曉雯, 曾毅, 李澤琳, 劉偉 申請(qǐng)人:北京工業(yè)大學(xué)