專利名稱：一種皂苷類成分作為制備抗柯薩奇病毒藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從中藥知母中提取分離的皂苷類有效成分，經(jīng)藥理試驗(yàn)證明可顯著抑制柯薩奇B族病毒(Coxsackie Group B Virus)及治療病毒性心肌炎，更具體指從中藥知母中提取分離的有效成分知母皂苷Am，它可在制備抗柯薩奇病毒的藥物中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
柯薩奇病毒可引起多種疾病，如柯薩奇B族病毒主要引起病毒性心肌炎。病毒性心肌炎系以心肌細(xì)胞變性壞死、炎性細(xì)胞浸潤為主要病變的一種臨床常見病，在兒童和青少年中高發(fā)，嚴(yán)重危害人類健康。
目前，西醫(yī)臨床治療病毒性心肌炎的主要方法是使用普通抗病毒藥、免疫抑制劑、干擾素及心肌細(xì)胞營養(yǎng)劑等，但療效并不理想。
近年來，中醫(yī)藥在病毒性心肌炎的臨床治療中顯示出極大優(yōu)勢(shì)。目前臨床上針對(duì)病毒性心肌炎的中成藥只有個(gè)別品種，且均為粗提物制劑(如芪冬頤心口服液)，大多為醫(yī)生自擬的處方湯藥，急需開發(fā)出有針對(duì)性，有效成分和藥理作用清楚，劑型先進(jìn)，服用方便，質(zhì)量穩(wěn)定可控的中藥制劑。
中藥知母清熱瀉火，生津潤燥，主要具有抗菌、解熱、降血糖等作用，但未見其治療病毒性心肌炎的有效部位和有效成分的報(bào)道。知母皂苷AIII單體成分的藥理作用也未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服常規(guī)中藥存在的不足之處，從中藥中尋找一類結(jié)構(gòu)確定，具有抗病毒作用且在制備抗柯薩奇病毒和預(yù)防治療病毒性心肌炎藥物中應(yīng)用。采用化學(xué)方法從中藥知母中分離出有效成分——知母皂苷AIII，經(jīng)藥理試驗(yàn)，使該化合物在制備抗柯薩奇病毒和治療病毒性心肌炎的藥物中應(yīng)用。
本發(fā)明采用中藥知母藥材經(jīng)乙醇回流提取3次，將濾液減壓回收，制成知母浸膏，再以少量水溶解，用水飽和正丁醇萃取，正丁醇層用甲醇拌樣上硅膠柱，用正丁醇-氯仿(1∶1)洗脫，分離得到純化合物知母皂苷AIII。結(jié)構(gòu)式如下 它的分子式為C39H64O13，分子量為740，化學(xué)名為薩爾薩皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷。
知母皂苷AIII提取工藝參考“中藥化學(xué)成分提取分離手冊(cè)”，楊云主編，中國中醫(yī)藥出版社，1998年第一版。
本發(fā)明采用上述方法提取得到的知母皂苷AIII首先進(jìn)行常規(guī)的藥效試驗(yàn)。
體內(nèi)試驗(yàn)將Balb/c小鼠隨機(jī)分為3組。
1、正常對(duì)照組不給知母皂苷AIII，不接種病毒，只給等量蒸餾水；2、病毒對(duì)照組腹腔接種0.1mlCVB3病毒液(TCID50＝10-7.5，105倍稀釋)。
3、給藥組同上法接種CVB3病毒液，同日灌胃知母皂苷AIII(知母皂苷AIII溶于少量二甲亞砜，再用生理鹽水稀釋至8.35mg/ml)0.15mmol/kg·d，連續(xù)給藥7天，觀察15天；
觀察小鼠的飲食、毛色及活動(dòng)情況等，并統(tǒng)計(jì)死亡率。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，病毒組死亡50％，而本發(fā)明藥物能將由柯薩奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的死亡率顯著降低到7.1％。
本發(fā)明采用上述試驗(yàn)的劑量分組，連續(xù)給藥7天，觀察15天，然后將小鼠解剖，在解剖前秤小鼠體重，解剖后再秤取其心臟重量，然后計(jì)算出它的心指數(shù)。計(jì)算方法為心指數(shù)＝心重/體重當(dāng)動(dòng)物被病毒感染后，攝食量減少，體重降低，而心臟卻因此膨大，發(fā)生纖維化而變重，所以可以用心指數(shù)來衡量心臟的病變程度，心指數(shù)越大，心臟病變?cè)絿?yán)重。
結(jié)果顯示，本發(fā)明藥物能顯著降低由柯薩奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的心指數(shù)。
小鼠心臟置福爾馬林中固定后，做病理切片。然后在顯微鏡下觀察炎性細(xì)胞浸潤和心肌細(xì)胞壞死情況。每個(gè)標(biāo)本觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野病變0-25％記為1，25％-50％記為2，50％-75％記為3，75％-100％記為4，如無病變則記為0。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明藥物能有效改善由柯薩奇B3病毒引起的小鼠心臟的病變程度。
體外試驗(yàn)取SD大鼠1-3天的乳鼠，做心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)。24h后加入病毒液孵育1h，棄去病毒液，將本發(fā)明藥物溶解于生理鹽水中，用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后加入細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)。72h后將細(xì)胞培養(yǎng)板反復(fù)凍融3次，使病毒顆粒充分釋放，測(cè)定每個(gè)孔的病毒滴度。
結(jié)果顯示，本發(fā)明藥物可有效降低柯薩奇B3病毒感染細(xì)胞的病毒滴度，具有顯著的體外抗病毒效果。
注試驗(yàn)方法參考《現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法》(下冊(cè)，P1425，張均田主編，北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1998年版)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述，但不對(duì)其有任何限制。
實(shí)施例1本發(fā)明藥物對(duì)病毒性心肌炎小鼠死亡率的影響試驗(yàn)(體內(nèi))取Balb/c小鼠34只，隨機(jī)分為3組。
正常對(duì)照組6只，不給本發(fā)明藥物，也不接種病毒，只給等量蒸餾水。
病毒對(duì)照組14只，每只腹腔接種0.1mlCVB3病毒液(TCID50＝10-7.5，105倍稀釋)。
給藥組14只，同上法接種CVB3病毒液，同日按0.15mmol/kg·d灌胃給予本發(fā)明藥物，連續(xù)給藥7天，觀察至第15天。
觀察記錄給藥(飼養(yǎng))期間動(dòng)物的精神狀態(tài)、飲食、毛色及死亡等情況。
結(jié)果本發(fā)明藥物能顯著降低由柯薩奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的死亡率，見表1。
表1 本發(fā)明藥物對(duì)病毒性心肌炎小鼠死亡率的影響

注采用卡方檢驗(yàn)，給藥組與病毒組比較，**P＜0.01實(shí)施例2本發(fā)明藥物對(duì)病毒性心肌炎小鼠心指數(shù)的影響試驗(yàn)(體內(nèi))Balb/c小鼠分組及給藥劑量同實(shí)施例1。連續(xù)給藥7天，觀察到第15天，將所有小鼠全部解剖。在解剖前秤小鼠的體重，解剖后再秤取其心臟重量。
心指數(shù)＝心重/體重當(dāng)動(dòng)物被病毒感染后，攝食量減少，體重降低，而心臟卻因此膨大、發(fā)生纖維化而變重，所以可以用心指數(shù)來衡量心臟的病變程度，心指數(shù)越大，心臟病變?cè)絿?yán)重。
結(jié)果本發(fā)明藥物能顯著降低由柯薩奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的心指數(shù)，見表2。
表2本發(fā)明藥物對(duì)病毒性心肌炎小鼠心指數(shù)的影響組別 心指數(shù)(×10-3)正常對(duì)照組 5.80±0.60病毒對(duì)照組8.23±1.33給藥組 6.20±0.57*注給藥組與病毒組比較*p＜0.05，**p＜0.01
實(shí)施例3本發(fā)明藥物對(duì)病毒性心肌炎小鼠病理切片的影響試驗(yàn)(體內(nèi))Balb/c小鼠分組及給藥劑量同實(shí)施例1。給藥7天，觀察到第15天，解剖后將小鼠心臟置福爾馬林中固定，做病理切片。在顯微鏡下觀察心肌炎性細(xì)胞浸潤和心肌纖維壞死情況。每個(gè)標(biāo)本觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野病變0-25％記為1，25％-50％記為2，50％-75％記為3，75％-100％記為4，如無病變則記為0。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明藥物能有效改善由柯薩奇B3病毒引起的小鼠心臟的病變程度。
表2本發(fā)明藥物對(duì)病毒性心肌炎小鼠心臟病理切片的影響

注采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，給藥組與病毒組比較，*P＜0.05實(shí)施例4本發(fā)明藥物對(duì)病毒感染細(xì)胞病毒滴度的影響(體外)取SD大鼠新生1-3天的乳鼠，做心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)，用24孔培養(yǎng)板在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后棄去培養(yǎng)液，加入1∶60稀釋的病毒液孵育1h，棄去病毒液，將本發(fā)明藥物溶于生理鹽水中(10mg/ml)，再用培養(yǎng)液將藥物溶液1∶200稀釋，加入細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)。72h后，病變發(fā)展到適當(dāng)程度，將細(xì)胞培養(yǎng)板反復(fù)凍融3次，使病毒顆粒充分釋放，用hep-2細(xì)胞測(cè)定病毒滴度。
所得結(jié)果以負(fù)對(duì)數(shù)表示，稱為中和指數(shù)，可以表征病毒毒力。中和指數(shù)越大，表示病毒毒力越強(qiáng)。根據(jù)國家藥監(jiān)局發(fā)布的《新藥藥效學(xué)研究指導(dǎo)原則》中“抗病毒性心肌炎藥物”一章中所述，對(duì)于抗病毒藥物，病毒毒力降低1個(gè)指數(shù)，即中和指數(shù)降低1，就算有效。
結(jié)果顯示，本發(fā)明藥物可有效降低柯薩奇B3病毒感染細(xì)胞的病毒滴度，具有顯著的體外抗病毒效果。
表3本發(fā)明藥物對(duì)病毒感染細(xì)胞病毒滴度的影響

注根據(jù)《新藥藥效學(xué)研究指導(dǎo)原則》，*為有統(tǒng)計(jì)意義。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)構(gòu)式如下的知母皂苷AIII化合物的用途，它具有抗柯薩奇B族病毒作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的知母皂苷AIII化合物的用途，其特征在于在制備預(yù)防治療由柯薩奇B族病毒引起的疾病的藥物中應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的知母皂苷AIII化合物的用途，其特征在于制備預(yù)防、治療病毒性心肌炎藥物中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種知母皂苷A
文檔編號(hào)A61K31/7042GK1569015SQ03141639
公開日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2003年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月16日
發(fā)明者黃成鋼, 朱海燕, 張媛媛, 張振秋, 王新亮, 施松 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海藥物研究所