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華蟾酥毒基和酯蟾毒配基在抑制腸道病毒71型感染中的新用圖

文檔序號:9797548閱讀:809來源:國知局
華蟾酥毒基和酯蟾毒配基在抑制腸道病毒71型感染中的新用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請涉及華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的新用途,具體地,涉及華蟾酥毒基和酯蟾 毒配基用于制備用于預(yù)防和治療手足口病的藥物的用途,尤其是用于制備抗腸道病毒71 型藥物的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 手足口病是一種常見的急性病毒性兒童傳染病,主要病原是腸道病毒71型 (Enterovirus 71,簡稱為 EV71)和柯薩奇病毒 A16 型(Coxsackievirus A16,簡稱為 CA16), 其中EV71型引發(fā)的病癥尤為嚴(yán)重。近年來,手足口病在亞太地區(qū)的頻繁爆發(fā)已經(jīng)成為了嚴(yán) 重的社會健康問題。據(jù)統(tǒng)計,我國從2008年至2012年,超過七百萬例的手足口病被報道, 并導(dǎo)致了 2443例死亡。
[0003] 目前仍沒有上市的疫苗來預(yù)防手足口病。在治療方面,目前臨床上常使用阿昔洛 韋、更昔洛韋、利巴韋林等常規(guī)抗病毒藥物,并結(jié)合板藍(lán)根、注射用雙黃連、清開靈沖劑等。 雖然以上藥物已經(jīng)用于治療手足口病,但是它們都屬于廣譜的清熱解毒藥物,直接作用機(jī) 制不明且針對性不強(qiáng)。仍缺乏專門針對EV71的特效治療藥物。
[0004] 雖然現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些天然化合物,如:貓眼草黃素(chrysosplenetin)和垂 葉黃素(penduletin)等均表現(xiàn)出抗EV71活性,對于人橫紋肌肉瘤細(xì)胞,貓眼草黃素的 IC5。(半數(shù)抑制濃度)為0. 20 μ M,垂葉黃素的IC5。為0. 37 μ M ;但是兩者的細(xì)胞毒性均 較大,對于人橫紋肌肉瘤細(xì)胞,貓眼草黃素的CC5。(細(xì)胞存活率為50 %時的藥物濃度)為 13. 9 μ Μ,垂葉黃素的CC5。為74. 18 μ M(Zhu et al.,2011)。所以仍然需要開發(fā)針對EV71的 低細(xì)胞毒性特效治療藥物。
[0005] 華蟾酥毒基(cinobufagin),化學(xué)式為C26H34O6,分子量為442. 54,其結(jié)構(gòu)式如下:
[0007] 酯蟾毒配基(resibufogenin),化學(xué)式為C24H32O 4,分子量為384,其結(jié)構(gòu)式如下:
[0008]
[0009] 華蟾酥毒基和酯蟾毒配基是傳統(tǒng)中藥蟾酥中的活性成分,屬于蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯 類化合物。研究表明,華蟾酥毒基和酯蟾毒配基具有抗炎、強(qiáng)心、鎮(zhèn)痛、抗癌的作用。另外, 華蟾酥毒基還可以抑制細(xì)胞內(nèi)乙肝病毒(HBV)的復(fù)制。但是尚未報道過華蟾酥毒基和酯蟾 毒配基對腸道病毒71型的抗病毒作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 發(fā)明人從天然產(chǎn)物單體庫中篩選獲得了兩個蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類化合物--華 蟾酥毒基、酯蟾毒配基,并驚訝地發(fā)現(xiàn)華蟾酥毒基和酯蟾毒配基對腸道病毒71型造成的細(xì) 胞病變效應(yīng)和空斑效應(yīng)有抑制作用,對EV71病毒衣殼蛋白的合成有濃度依賴性地抑制作 用,而且對細(xì)胞的毒性較低,因此華蟾酥毒基和酯蟾毒配基可以成為抗手足口病病毒的候 選藥物的先導(dǎo)化合物,可以用于預(yù)防或治療手足口病。
[0011] 本發(fā)明提供了華蟾酥毒基在制備用于預(yù)防或治療受試者中的手足口病的藥物中 的用途。優(yōu)選地,所述受試者是人。更優(yōu)選地,所述受試者為16歲以下的兒童。最優(yōu)選地, 所述受試者為5歲以下的兒童。
[0012] 優(yōu)選地,所述預(yù)防或治療手足口病的藥物是抗腸道病毒71型的藥物。
[0013] 優(yōu)選地,所述藥物包含活性成分華蟾酥毒基和一種或多種可藥用載體。
[0014] 優(yōu)選地,所述藥物還可包含其他用于治療手足口病的活性成分。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種用華蟾酥毒基抑制由腸道病毒71型引起的細(xì)胞病變效應(yīng)的 方法,所述方法包括使?jié)舛葹?-3000nM的華蟾酥毒基與細(xì)胞接觸。
[0016] 優(yōu)選地,華蟾酥毒基的濃度為10_250nM,更優(yōu)選地,華蟾酥毒基的濃度為15-70 nM〇
[0017] 優(yōu)選地,所述細(xì)胞是人細(xì)胞,更優(yōu)選地,所述細(xì)胞是人橫紋肌肉瘤細(xì)胞或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 腸道病毒71型受體hSCARB2的人橫紋肌肉瘤細(xì)胞。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種用華蟾酥毒基抑制由腸道病毒71型引起的空斑形成的方 法,所述方法包括使?jié)舛葹?-3000nM的華蟾酥毒基與細(xì)胞接觸。
[0019] 優(yōu)選地,華蟾酥毒基的濃度為10_500nM,更優(yōu)選地,華蟾酥毒基的濃度為 15-125nM。
[0020] 優(yōu)選地,所述細(xì)胞是人細(xì)胞,更優(yōu)選地,所述細(xì)胞是人橫紋肌肉瘤細(xì)胞或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 腸道病毒71型受體hSCARB2的人橫紋肌肉瘤細(xì)胞。
[0021] 本發(fā)明提供了酯蟾毒配基在制備用于預(yù)防或治療受試者中的手足口病的藥物中 的用途。優(yōu)選地,所述受試者是人。更優(yōu)選地,所述受試者為16歲以下的兒童。最優(yōu)選地, 所述受試者為5歲以下的兒童。
[0022] 優(yōu)選地,所述預(yù)防或治療手足口病的藥物是抗腸道病毒71型的藥物。
[0023] 優(yōu)選地,所述藥物包含活性成分酯蟾毒配基和一種或多種可藥用載體。
[0024] 優(yōu)選地,所述藥物還可包含其他用于治療手足口病的活性成分。
[0025] 本發(fā)明還提供了一種用酯蟾毒配基抑制由腸道病毒71型引起的細(xì)胞病變效應(yīng) 的方法,所述方法包括使?jié)舛葹?0-60000nM的酯蟾毒配基與細(xì)胞接觸。
[0026] 優(yōu)選地,酯蟾毒配基的濃度為98_12500nM,更優(yōu)選地,酯蟾毒配基的濃度為 195-3000nM,最優(yōu)選地,酯蟾毒配基的濃度為250-1500nM。
[0027] 優(yōu)選地,所述細(xì)胞是人細(xì)胞,更優(yōu)選地,所述細(xì)胞是人橫紋肌肉瘤細(xì)胞或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 腸道病毒71型受體hSCARB2的人橫紋肌肉瘤細(xì)胞。
[0028] 本發(fā)明還提供了一種用酯蟾毒配基抑制由腸道病毒71型引起的空斑形成的方 法,所述方法包括使?jié)舛葹?0-3000nM的酯蟾毒配基與細(xì)胞接觸。
[0029] 優(yōu)選地,酯蟾毒配基的濃度為100-1500nM。
[0030] 優(yōu)選地,所述細(xì)胞是人細(xì)胞,更優(yōu)選地,所述細(xì)胞是人橫紋肌肉瘤細(xì)胞或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 腸道病毒71型受體hSCARB2的人橫紋肌肉瘤細(xì)胞。
[0031] 在本發(fā)明中由腸道病毒71型引起的細(xì)胞病變效應(yīng)是指由腸道病毒71型病毒在宿 主細(xì)胞內(nèi)大量增殖,導(dǎo)致細(xì)胞病變甚至死亡的效應(yīng)。
[0032] 在本發(fā)明中由腸道病毒71型和/或柯薩奇病毒A16型引起的空斑形成是指腸道 病毒71型感染已形成致密單層狀態(tài)的細(xì)胞群體時,經(jīng)過一定培養(yǎng)時間使每個感染細(xì)胞周 圍的細(xì)胞逐漸感染、死亡、脫落,形成肉眼可見的空斑。所述細(xì)胞是人細(xì)胞,更優(yōu)選地,所述 細(xì)胞是人橫紋肌肉瘤細(xì)胞或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染腸道病毒71型受體hSCARB2的人橫紋肌肉瘤細(xì)胞。
【具體實施方式】
[0033] 除非另外說明,實施例中使用的各種儀器和試劑均為普通市售品。
[0034] 實施例1 :構(gòu)建RDS細(xì)胞
[0035] 將合成的兩端有EcoR I&Xba I酶切位點(diǎn)的EV71/CA16受體hSCARB2基因片段 (NCBI登錄號:NM_005506. 3,由上海捷瑞公司合成)插入慢病毒載體Lenti-X pLVX-Puro載 體(購自Clontech),并使用慢病毒載體試劑盒中的轉(zhuǎn)染試劑(購自Clontech)按說明書轉(zhuǎn) 染人橫紋肌肉瘤細(xì)胞(RD細(xì)胞,購自ATCC,登錄號#CCL-136),獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hSCARB2的RD 細(xì)胞,簡稱RDS細(xì)胞(RDS細(xì)胞的具體構(gòu)建方法參見Li et al. Virology Journal, 10:250)。
[0036] 實施例2 :華蟾酥毒基和酯蟾毒配基對細(xì)胞的細(xì)胞毒性以及對腸道病毒71型造成 的細(xì)胞病變效應(yīng)的抑制作用
[0037] 取對數(shù)生長期的RD細(xì)胞和RDS細(xì)胞,分別以3 X IO4個/孔和6 X IO4個/孔的濃 度接入96孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)24小時。RD細(xì)胞和RDS細(xì)胞均在37°C和5% CO2下培養(yǎng),,其中 培養(yǎng)RD細(xì)胞使用的培養(yǎng)液為補(bǔ)充有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(簡稱為10% FBS-DMEM, FBS (胎牛血清)和DMEM均購自Sigma),培養(yǎng)RDS細(xì)胞使用的培養(yǎng)液為含有0. 5 μ g/ml嘌 呤霉素(購自 Clontech)的 10% FBS-DMEM。
[0038] 向各孔加入50μ L含不同濃度的華蟾酥毒基或酯蟾毒配基(購自中國藥品生物制 品檢定所)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(購自Sigma),使華蟾酥毒基的終濃度為2000ηΜ,ΙΟΟΟηΜ, 500nM, 250nM, 125nM, 62. 50nM, 3L 25nM, 15. 62nM, 7· 81nM, 3· 91nM ;酯蟾毒配基的終濃度為 50000nM, 25000nM, 12500nM, 6250nM, 3125nM, 1563nM, 781nM, 391nM, 195nM, 98nM。每個濃度 設(shè)3個復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48小時,用熒光細(xì)胞活性檢測試劑盒(購自Promega公司)檢 測細(xì)胞活性。操作按照試劑盒說明書進(jìn)行,在多標(biāo)記微孔板檢測系統(tǒng)(Multilabel Plate Reader 2030,購自Perkin Elmer公司)上測定560nm下的熒光值,熒光值的大小反映細(xì)胞 的活性。
[0039] 在檢測華蟾酥毒基和酯蟾毒配基對由EV71造成的細(xì)胞病變效應(yīng)的抑制作用時, 加藥的同時各孔加入50yL EV71病毒(EV71-C4b,獲自吉林大學(xué)艾滋病疫苗國家工程實驗 室,參見Li et al. Virology Journal, 10:250)進(jìn)行感染(該病毒在RDS/RD細(xì)胞中的感染 復(fù)數(shù)為0. 008),繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48小時后,如上所述測定560nm下的熒光值。
[0040] 同時還設(shè)置了僅加入DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液處理的細(xì)胞對照及僅加入EV71進(jìn)行感染的 病毒對照,除了加入的物質(zhì)不同以外,其他操作同上。
[0041] 細(xì)胞毒性用CC5。(細(xì)胞存活率為50%時的藥物濃度)表示,細(xì)胞存活率=(給藥 組熒光值/細(xì)胞對照組熒光值)X 100% ;
[0042] EV71細(xì)胞病變效應(yīng)抑制率=[(感染EV71并給藥組熒光值-感染EV71對照組熒 光值)/細(xì)胞對照組熒光值]X 100% ;根據(jù)不同濃度的華蟾酥毒基和酯蟾毒配基對每孔細(xì) 胞病變效應(yīng)的抑制率分別算出抑制率為50%時的藥物濃度,用半數(shù)抑制濃度IC 5。表示;
[0043] 藥物抗EV71的效果以
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