專利名稱：重組柯薩奇病毒b3型病毒樣顆粒的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒的制備方法，特別涉及利用經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的柯薩奇病毒B3型Pl基因和3CD基因，通過(guò)酵母表達(dá)系統(tǒng)制備重組柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒的方法。
背景技術(shù)：
病毒性心肌炎(vital myocarditis, VMC)是由多種病毒引起心肌的非特異性炎癥病變，病程較長(zhǎng)，數(shù)月可康復(fù)，其中少數(shù)病人會(huì)轉(zhuǎn)變成慢性。能引起病毒性心肌炎的病毒中，最普遍的是腸道病毒與腺病毒(Yajima T, Knowlton KU. Viral myocarditis:fromthe perspective ofthe virus. Circulation. 2009，119 (19) : 2615-2624.),而腸道病毒中的柯薩奇病毒B3 (Coxsackievirus B3, CVB3)是其主要病原體(Yuan J, Yu M, Lin Qffet al. Thl7cells contribute to viral replication in coxsackievirus B3_induced acute viral myocarditis. J Immunol. 2010, 185(7) :4004-4010. ) 在心肌炎與其晚期即擴(kuò)張型心肌病病例中，有5-50%是由CVB3感染引起的(Maisch B，Ristic AD, Hufnagel G，Pankuweit S.Pathophysiology of viral myocarditis:the role of humoral immuneresponse. CardiovascPathoI. 2002;11:112-22.)。另外，柯薩奇病毒B3型與很多人類其它疾病相關(guān)，無(wú)菌性腦炎與胰腺炎，并且調(diào)查顯示CVB或許與胰島素依賴型糖尿病的發(fā)病相關(guān)(Andreas Henke, Nadine JaraschandPeter ffutzler. Coxsackievirus B3vaccines:use as an expression vector forprevention of myocarditis. Expert Rev. Vaccines. 2008，7(10)，1557-1567. X柯薩奇病毒B3型屬小RNA病毒，其毒粒為二十面體形，立體對(duì)稱，呈球形狀，是裸露的核衣殼，直徑約為23-30nm，無(wú)包膜。病毒基因組為約7kb的單鏈RNA，其組成從5’端到3’端的方向依次為5’端非編碼區(qū)，Pl區(qū)、P2區(qū)、P3區(qū)和一段3’端非編碼區(qū)。Pl區(qū)編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，即衣殼蛋白(capsule protein),其轉(zhuǎn)錄及翻譯產(chǎn)物經(jīng)蛋白酶水解后，最終得到4個(gè)蛋白產(chǎn)物，分別為VP4 (IA)，VP2(1B), VP3 (IC)及VPl (ID)。主要的中和抗原位點(diǎn)就在Pl區(qū)的VPl上，VP2和VP3上也含有一些中和型的抗原決定簇，但它們存在的區(qū)域是在非保守序列中。VP4序列呈高度保守，不暴露在衣殼的外表面，所以不具有中和性抗原決定簇。P2區(qū)呈現(xiàn)P2A、P2B和P2C三個(gè)部分。P2A蛋白的這一區(qū)域是起抑制宿主細(xì)胞mRNA轉(zhuǎn)錄作用的。P2B的功能與轉(zhuǎn)膜作用有關(guān)，而P2C蛋白據(jù)推測(cè)其參與病毒RNA基因組的復(fù)制。P3區(qū)中，VPg (P3A)前體通過(guò)加工成為成熟的VPg。P3C是一個(gè)蛋白酶，可以自動(dòng)催化自我剪切釋放。3D是一個(gè)RNA合成酶，是在RNA復(fù)制過(guò)程中的依賴RNA的RNA多聚酶，它可以復(fù)制合成病毒的RNA。研究人員已采用多種方法研究相關(guān)疫苗，并且利用動(dòng)物模型證明了其預(yù)防急性感染或心肌炎的潛能，其中包括亞單位疫苗，滅活病毒疫苗，減毒活疫苗或DNA疫苗。然而，這些方法存在危險(xiǎn)性，甚至存在不能刺激機(jī)體產(chǎn)生理想的免疫反應(yīng)的可能。例如，減毒或滅活病毒疫苗存在逆轉(zhuǎn)成有毒力的形式的危險(xiǎn)或者不完全滅活，將導(dǎo)致接種者患病。目前，還沒(méi)有預(yù)防感染CVB3的特效藥或疫苗上市，因此，研制CVB3預(yù)防性疫苗對(duì)于控制病毒性心肌炎的流行具有重要意義。而病毒樣顆粒在形態(tài)上和真實(shí)的病毒類似，并且不含有潛在的致病病毒基因組，所以病毒樣顆粒為抗病毒預(yù)防性疫苗的開(kāi)發(fā)提供了理想的備選方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒的制備方法。并且本方法可應(yīng)用于柯薩奇B型病毒(B1-B6)的病毒樣顆粒制備。本發(fā)明所提供的柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒的制備方法包括如下步驟I)將柯薩奇病毒B3型的Pl基因和3⑶基因克隆到目的質(zhì)粒中，得到重組表達(dá)載體；2)用步驟I)得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化目的酵母細(xì)胞，得到表達(dá)所述Pl基因和所述3⑶基因的重組酵母細(xì)胞； 3)裂解步驟2)得到的重組酵母細(xì)胞，分離得到重組的柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒。上述步驟I)中，所述Pl基因和所述3⑶基因均為經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的基因；所述優(yōu)化為在不改變野生型柯薩奇病毒B3型Pl蛋白和野生型柯薩奇病毒B3型3CD蛋白氨基酸序列的前提下，將野生型柯薩奇病毒B3型Pl基因和野生型柯薩奇病毒B3型3CD基因的密碼子替換為酵母細(xì)胞偏好(高頻使用)的密碼子。所述優(yōu)化還包括對(duì)Pl基因序列和3CD基因序列的其他改造，以適合在酵母細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“偏好的密碼子”具有本領(lǐng)域公知的含義，也稱為密碼子的偏好性(CodonPreference),是指某些生物體更偏愛(ài)使用某些同義三聯(lián)密碼子(即編碼相同氨基酸的密碼子)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，上述步驟I)中所述Pl基因(經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的基因，命名為CVB3P1Y)的核苷酸序列為序列表中序列I所示；所述3CD基因(經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的基因，命名為CVB33CDY)的核苷酸序列為序列表中序列2所示。為適合在酵母細(xì)胞中表達(dá)，根據(jù)本發(fā)明描述的方法對(duì)柯薩奇病毒B3型的Pl基因或3CD基因進(jìn)行改造獲得的其他基因序列也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述步驟2)中，所述目的酵母細(xì)胞可為釀酒酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述目的酵母細(xì)胞具體為釀酒酵母INVSCl。所述Pl基因和3⑶基因在所述重組表達(dá)載體中各由一個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄，驅(qū)動(dòng)所述Pl基因的啟動(dòng)子方向和驅(qū)動(dòng)所述3CD基因的啟動(dòng)子方向相反。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組表達(dá)載體為將所述Pl基因和所述3CD基因分別插入到pESC-URA的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)處。具體可將所述Pl基因插入到所述PESC-URA的多克隆位點(diǎn)I (MCS1/FLAG)的SpeI和Pac I之間，得到中間質(zhì)粒，同時(shí)將所述3CD基因插入到所述中間質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)2 (MCS2/myc)的BamH I和Xho I之間，得到所述的重組表達(dá)載體。利用本發(fā)明所提供的方法制備得到的柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供密碼子優(yōu)化型的柯薩奇病毒B3型的Pl基因或3CD基因。
本發(fā)明所提供的密碼子優(yōu)化型的柯薩奇病毒B3型的Pl基因(CVB3P1Y基因)的核苷酸序列為序列表中序列I所示；本發(fā)明所提供的密碼子優(yōu)化型的柯薩奇病毒B3型的3CD基因(CVB33CDY基因)的核苷酸序列為序列表中序列2所示。為適合在酵母細(xì)胞中表達(dá)，根據(jù)本發(fā)明描述的方法對(duì)柯薩奇病毒B3型的Pl基因或3CD基因進(jìn)行改造獲得的其他基因序列也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。其中，序列I由2565個(gè)核苷酸組成，為優(yōu)化后柯薩奇病毒B3型Pl基因的編碼序列，其編碼所得的蛋白為序列表中序列5所示的蛋白，序列5由854個(gè)氨基酸組成；序列2由1941個(gè)核苷酸組成，為優(yōu)化后的柯薩奇病毒B3型3CD基因的編碼序列，其編碼所得的蛋白為序列表中序列6所示的蛋白，序列6由646個(gè)氨基酸組成。含有上述密碼子優(yōu)化型的柯薩奇病毒B3型的所述Pl基因和/或所述3CD基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組表達(dá)載體可為將所述Pl基因和所述3⑶基因分別插入到pESC-URA質(zhì)粒的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)處，得到的重組質(zhì)粒。所述重組菌可為攜帶有上述密碼子優(yōu)化型的柯薩 奇病毒B3型的Pl基因或3CD基因的重組酵母細(xì)胞。所述酵母細(xì)胞可為釀酒酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述酵母細(xì)胞具體為釀酒酵母INVSCl。所述表達(dá)盒由能夠啟動(dòng)所述密碼子優(yōu)化型的柯薩奇病毒B3型的所述Pl基因和/或所述3CD基因表達(dá)的啟動(dòng)子，所述密碼子優(yōu)化型的柯薩奇病毒B3型的所述Pl基因和/或所述3CD基因，以及轉(zhuǎn)錄終止子組成。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述啟動(dòng)子具體為釀酒酵母GALl和GALlO啟動(dòng)子，當(dāng)然也可以使用其他公知的酵母啟動(dòng)子的任何一種，如GAL7、ADHl、ADH3和PGK啟動(dòng)子，或者其他真核基因啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述轉(zhuǎn)錄終止子具體為ADHl和CYCl終止子。上述密碼子優(yōu)化型的柯薩奇病毒B3型的所述Pl基因和/或3CD基因在制備下述a)或b)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍a)柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒；b)以柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒為活性成分的預(yù)防性疫苗。本發(fā)明還涉及并提供了在重組宿主細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)CVB3P1蛋白和CVB33⑶蛋白的方法，該方法包括(1)將含有編碼所述CVB3P1蛋白和所述CVB33CD蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入重組宿主細(xì)胞，如重組的酵母細(xì)胞(釀酒酵母INVSCl)。(2)在允許所述CVB3P1蛋白和所述CVB33⑶蛋白同時(shí)表達(dá)的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，如重組的酵母細(xì)胞(釀酒酵母INVSCl )。本發(fā)明對(duì)野生型的柯薩奇病毒B3型(Coxsackievirus B3, CVB3)的Pl基因或3CD基因進(jìn)行了酵母細(xì)胞偏好型密碼子優(yōu)化，從而提高了 CVB3P1蛋白和CVB33CD蛋白在酵母細(xì)胞中的表達(dá)水平。在本發(fā)明中，CVB3P1蛋白和CVB33⑶蛋白在酵母細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)，CVB33CD蛋白對(duì)CVB3PI蛋白進(jìn)行酶切后得到VPI、VP2、VP3、VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白(3CD是3C的前體，由3⑶蛋白產(chǎn)生的3C蛋白為一種蛋白酶，可將Pl蛋白水解為VP1、VP2、VP3、VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白)。這四種結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)而自行組裝成柯薩奇病毒B3型的病毒樣顆粒(CVB3VLPs)。實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明所提供的方法，在酵母表達(dá)系統(tǒng)(釀酒酵母INVSC1)中成功的制備了 CVB3VLPS。所述CVB3VLPS可以用于制備基于VLP的CVB3預(yù)防性疫苗。


圖I為pESC-PlY質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，用泳道A為15000bpDNAMarker ;泳道B為pESC-URA質(zhì)粒對(duì)照；泳道C為pESC-PlY質(zhì)粒。圖2為pESC-PlY質(zhì)粒的Hind III酶切鑒定結(jié)果。其中，用泳道A為15000bpDNAMarker ;泳道B為pESC-PlY質(zhì)粒的Hind III酶切鑒定結(jié)果。圖3為PESC-P1Y-3CDY質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，用泳道A為15000bpDNAMarker ;泳道B為pESC-PlY質(zhì)粒對(duì)照；泳道C為pESC_PlY_3CDY質(zhì)粒。圖4為pESC-PlY-3⑶Y質(zhì)粒的BamHI及Xho I酶切鑒定結(jié)果。其中，用泳道A為15000bp DNA Marker ;泳道 B 為 pESC_PlY_3CDY 質(zhì)粒的 BamH I 及 Xho I 酶切鑒定結(jié)果。圖5為Western Blot鑒定重組CVB3衣殼蛋白的表達(dá)。其中，泳道A為蛋白分子量對(duì)照；泳道B為INVSCl/pESC-PlY-3CDY蛋白提取物；泳道C為INVSCl/pESC-URA酵母蛋 白提取物；泳道D為CVB3病毒陽(yáng)性對(duì)照。圖6為通過(guò)透射電鏡技術(shù)顯現(xiàn)的CVB3病毒樣顆粒(VLPs)的代表樣品。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I、CVB3P1基因和CVB33CD基因的密碼子優(yōu)化及全基因合成(公司合成)以下按分步驟詳細(xì)描述CVB3P1基因和CVB33CD基因的密碼子優(yōu)化及全基因合成的流程。I、CVB3P1基因和CVB33⑶基因的密碼子優(yōu)化根據(jù)野生型CVB3P1基因序列(如序列表中序列3所示)和野生型CVB33⑶基因序列(如序列表中序列4所示)，經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)和反復(fù)驗(yàn)證得到適合于在酵母細(xì)胞中表達(dá)的優(yōu)化型CVB3P1基因序列和優(yōu)化型CVB33CD基因序列，即將CVB3病毒的Pl基因序列和3CD基因序列在不改變氨基酸序列的前提下轉(zhuǎn)變成含有如Sharp PM等(Sharp PM, Cowe E. SynonymousCodon Usage in Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 1991，7 (7) : 657-678.)所描述的酵母優(yōu)選密碼子的優(yōu)化序列，從而提高CVB3P1蛋白和CVB33CD蛋白在酵母細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中的表達(dá)水平。根據(jù)上述方法，最終獲得按酵母密碼子偏好設(shè)計(jì)的優(yōu)化型CVB3P1基因和CVB33⑶基因，分別命名為CVB3P1Y和CVB33CDY，其基因序列分別為序列表中序列I和序列2。CVB3P1Y基因(序列I)編碼的蛋白與序列3所示野生型CVB3P1基因編碼的蛋白一致，均為序列表中序列5所不氣基酸序列組成的蛋白；CVB33CDY基因(序列2)編碼的蛋白與序列4所示野生型CVB33CD基因編碼的蛋白一致，均為序列表中序列6所示氨基酸序列組成的蛋白。2、密碼子優(yōu)化型CVB3P1基因和CVB33⑶基因的全基因合成使用序列重疊延伸PCR法全基因合成CVB3P1Y基因和CVB33⑶Y基因，具體方法如下根據(jù)優(yōu)化CVB3P1Y基因和CVB33⑶Y基因的序列合成多條IOObp的上下游片段，兩片段間3’端互補(bǔ)重疊15bp，所述上下游片段互為模板、引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用凝膠回收試劑盒回收擴(kuò)增片段，再以此相鄰的回收片段互為引物、模板進(jìn)行下一輪PCR擴(kuò)增，得到拼接序列，再以相鄰拼接序列互為模板、引物進(jìn)行PCR拼接，回收拼接序列片段，在依此序列互為模板、引物進(jìn)行PCR拼接，依此類推最終合成全長(zhǎng)的密碼子優(yōu)化型CVB3P1基因和CVB33CD基因，即CVB3P1Y基因和CVB33CDY基因。本實(shí)驗(yàn)中CVB3P1Y基因與CVB33⑶Y基因由公司(北京博邁德科技發(fā)展有限公司)進(jìn)行全基因合成并構(gòu)建到PGH質(zhì)粒載體上交付保存使用。實(shí)施例2、攜帶CVB3P1Y和CVB33⑶Y的酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建I、大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備從37°C培養(yǎng)16 20h的新鮮平板上挑取DH5a單菌落(Takara公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為D9057S)，接種于5ml不含抗菌素的LB培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)過(guò)夜(12 16h)。次日從上述培養(yǎng)物中吸取0. 5ml按體積比1:100轉(zhuǎn)入50ml LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)約3h，至菌液的0D600值為3時(shí)，在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一無(wú)菌、用冰預(yù)冷的50ml離心管中，冰浴 30min。在4°C條件下,4000rpm離心IOmin,棄上清,將管倒置Imin,使殘留培養(yǎng)液流盡，以IOml用冰預(yù)冷的IOOmM的CaCl2溶液重懸細(xì)菌沉淀，冰浴30min。4°C, 4000rpm離心IOmin,棄上清，每50ml初始培養(yǎng)物用2ml預(yù)冷的含15%甘油的IOOmM的CaCl2溶液重懸細(xì)菌沉淀，分裝成200 ill每管，_80°C保存?zhèn)溆谩?、pESC-URA 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化用無(wú)菌吸頭分別吸取I U g pESC-URA質(zhì)粒(一種具有雙向啟動(dòng)子的酵母表達(dá)質(zhì)粒，購(gòu)自Angilent technologies，產(chǎn)品目錄號(hào)為217454)加入200 U I上述步驟I制備的DH5 a感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30min。將管移入42°C水浴箱中水浴90s，然后將管快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻I 2min。每管加入800 ill不含抗生素的LB培養(yǎng)基(蛋白胨、酵母提取物、氨芐青霉素購(gòu)自北京欣經(jīng)科公司，NaCl購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司)，將管轉(zhuǎn)移至37°C搖床上，溫育45min (轉(zhuǎn)速<150rpm)。取50 已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，用一無(wú)菌的彎頭玻棒輕輕涂到含相應(yīng)抗生素的LB平板表面，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養(yǎng)12 16h。3、pESC-URA質(zhì)粒的小量制備挑取經(jīng)上述步驟2轉(zhuǎn)化培養(yǎng)所得的單菌落接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)物移入I. 5ml Eppendorf管中，12000rpm離心30_60s，倒去培養(yǎng)液，倒置離心管，使上清流盡，用100 ill預(yù)冷的溶液I (終濃度為50mmol/L的葡萄糖，終濃度為25mmol/L的Tris-HCl，終濃度為10mmol/L的EDTA，pH8. 0)重懸菌體，劇烈振蕩混勻；加入200 u I新鮮配制的溶液11(終濃度為0. 2mol/L的NaOH，終濃度為質(zhì)量百分含量1%的SDS)，溫和混勻，冰浴3min，至液體清亮；加入150 U I預(yù)冷的溶液III (配制IOOml溶液 III 5mol/L KAc 60ml，冰乙酸 11. 5ml，水 28. 5ml)溫和混勻，冰浴 IOmin, 12000rpm離心lOmin，小心吸取上清，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入2倍體積的無(wú)水乙醇室溫沉淀30min, 12000rpm離心IOmin,棄上清,沉淀用70%乙醇洗一次，室溫晾干后，用30 y I含RNaseA (IOOu g/ml)的 TE (pH 8.0)溶解沉淀，37°C水浴 3(T60min 后置 _20°C保存?zhèn)溆谩?、酵母重組表達(dá)載體pESC-PlY的構(gòu)建將實(shí)施例I得到的CVB3P1Y基因克隆到pESC-URA質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)I (MCS1/FLAG)的SpeI和Pac I之間，得到酵母重組表達(dá)載體pESC_PlY。具體按照如下步驟進(jìn)行
I)在實(shí)施例I得到的CVB3P1Y基因(如序列表中序列I所示)的5’端和3’端分別引入限制性內(nèi)切酶SpeI和Pac I (限制性內(nèi)切酶SpeI及Pac I購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)的酶切位點(diǎn)。具體操作如下以實(shí)施例I得到的CVB3P1Y基因(如序列表中序列I所示)為模板，用引物Pl-UP和Pl-DOWN進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到5’端和3’端分別引入限制性內(nèi)切酶SpeI和Pac I酶切位點(diǎn)的CVB3P1Y基因片段。Pl-UP :5’ -GGACTAGTACCATGGGTGCTCAAGTTTCTACTC-3> (下劃線處為限制性內(nèi)切酶SpeI酶切位點(diǎn)的序列，該序列的第12-33位為序列I的第1_22位)；Pl-DOWN :5’ -CCTTAATTAATTAGAAAGCACCAGTATTAGTCATAGC-3，(下劃線處為限制性內(nèi)切酶Pac I酶切位點(diǎn)的序列，其后的序列為序列I的第2539-2565位的反向互補(bǔ)序列)。2)使用限制性內(nèi)切酶SpeI和Pac I酶切上述步驟3制備的pESC_URA質(zhì)粒，回收 骨架載體(大片段，由于小片段大小僅約為45bp，瓊脂糖凝膠電泳時(shí)經(jīng)常無(wú)法顯示)與經(jīng)同樣酶切的CVB3P1Y基因片段按摩爾比I :4比例混合，依次加入10XT4DNA連接酶緩沖液和T4DNA連接酶(T4DNA連接酶及10 X T4DNA連接酶緩沖液購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)，反應(yīng)體積為2(^1，161連接過(guò)夜，取1(^1連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌0冊(cè)(1感受態(tài)細(xì)胞。從接種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的LB瓊脂平板上挑取若干個(gè)單菌落，接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按步驟3所述質(zhì)粒的快速小量制備方法提取重組質(zhì)粒(圖I)。并用內(nèi)切酶Hind III對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，CVB3P1Y基因含有兩個(gè)Hind III酶切位點(diǎn)，pESC-URA骨架載體含有一個(gè)Hind III酶切位點(diǎn)，鑒定結(jié)果如圖2所示，得到三個(gè)條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，進(jìn)一步經(jīng)酶切鑒定后的重組質(zhì)粒送公司測(cè)序，將測(cè)序證實(shí)含有CVB3P1Y基因(序列I)的重組質(zhì)粒命名為pESC-ΡΙΥ。其中，序列I編碼序列表中序列5所示的蛋白。5、酵母重組表達(dá)載體PESC-P1Y-3CDY的構(gòu)建將實(shí)施例I制備的所述CVB33⑶Y基因克隆到上述步驟4制備的酵母重組表達(dá)載體pESC-ΡΙΥ的多克隆位點(diǎn)2 (即為pESC-URA質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)2，MCS2/myc)的BamH I和Xho I之間，得到酵母重組表達(dá)載體pESC-PlY-3⑶Y。具體按照如下步驟進(jìn)行I)在實(shí)施例I得到的CVB33⑶Y基因(如序列表中序列2所示)的5’端和3’端分別引入限制性內(nèi)切酶BamHI和Xho I (限制性內(nèi)切酶BamHI及Xho I購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)的酶切位點(diǎn)。具體操作如下以實(shí)施例I得到的CVB33CDY基因(如序列表中序列2所示)為模板，用引物3CD-UP和3CD-D0WN進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到5’端和3’端分別弓I入BamHI和Xho I酶切位點(diǎn)的CVB33⑶Y基因片段。3CD-UP 5，-CGGGATCCACCATGGGTCCAGCTTTTGAATTTG-3，(下劃線處為限制性內(nèi)切酶BamHI酶切位點(diǎn)的序列，該序列的第12-33位為序列2的第1_22位)；3CD-D0WN:5’ ~CCGCTCGAGTTAAAAAGAATCCAACCATTTTC~3 (下劃線處為限制性內(nèi)切酶Xho I酶切位點(diǎn)的序列，其后的序列為序列2的第1919-1941位的反向互補(bǔ)序列)。2)使用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I酶切上述步驟4制備的酵母重組表達(dá)載體pESC-ΡΙΥ，回收骨架載體(大片段)與經(jīng)同樣酶切的CVB33⑶Y基因片段按摩爾比I :4比例混合(DNA Marker和DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)，依次加入10XT4DNA連接酶緩沖液和T4DNA連接酶，反應(yīng)體積為20μ 1，16°C連接過(guò)夜，取10 μ I連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞。從接種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的LB瓊脂平板上挑取若干個(gè)單菌落，接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按步驟3所述質(zhì)粒的快速小量制備方法提取重組質(zhì)粒(圖3)。并用內(nèi)切酶BamHI和Xho I對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖4所示，得到大小約為9200bp和2000bp的兩個(gè)條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，進(jìn)一步經(jīng)酶切鑒定后的重組質(zhì)粒送公司測(cè)序，將測(cè)序證實(shí)含有CVB33⑶Y基因(序列2)的重組質(zhì)粒命名為PESC-P1Y-3⑶Y。其中，序列2編碼序列表中序列6所示的蛋白。酵母重組表達(dá)載體pESC-PlY-3⑶Y中，啟動(dòng)所述CVB3P1Y基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為釀酒酵母GALlO啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄終止子為ADHl終止子；啟動(dòng)所述CVB33⑶Y基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為釀酒酵母GALl啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄終止子為CYCl終止子。實(shí)施例3、重組CVB3病毒樣顆粒在酵母細(xì)胞中的大量表達(dá)及純化I、釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備在釀酒酵母平板中挑取單克隆菌落INVSc KSaccharomyces cerevisiae,產(chǎn)品目錄號(hào)C81000，購(gòu)自Invitrogen)接種于IOml YPD培養(yǎng)液(購(gòu)自北京欣經(jīng)科公司)中，30°C振 搖培養(yǎng)16h，取合適體積的培養(yǎng)物加入48ml YH)培養(yǎng)液中混勻，使其0D600值為0. 5，30°C振搖培養(yǎng)Ih后0D600值為0. 7，繼續(xù)培養(yǎng)30min后，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入50ml無(wú)菌的離心管中，室溫1500rpm 離心 5min,棄上清，用 IOml Sc EasyComp transformation kit(購(gòu)自 Invitrogen)中的溶液I (試劑盒自帶)重懸沉淀，室溫1500rpm離心5min,小心棄上清,用Iml溶液II(試劑盒自帶)重懸沉淀，50iU/管分裝滅菌的I. 5ml離心管中，置_70°C保存。2、酵母重組表達(dá)載體PESC-P1Y-3CDY轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞將3 ill實(shí)施例2制備的酵母重組表達(dá)載體pESC-PlY-3⑶Y加入到上述步驟I制備的酵母INVSCl感受態(tài)細(xì)胞中，加入500 u I Sc EasyComp transformation kit (購(gòu)自Invitrogen)中的溶液III，在渦旋振蕩器上劇烈振蕩混勻，得到DNA/酵母混合物。將DNA/酵母混合物置30°C水浴中孵育lh，每隔15min在渦旋振蕩器上劇烈振蕩混勻。取IOOiU涂布URA選擇平板(選擇性培養(yǎng)液(Ura-) YNB 6. 7g，酵母Ura營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基粉末(Sigma公司，Y1501) I. 92g，如制平板加入20g瓊脂粉，溶于900ml去離子水中，高壓滅菌，冷卻至500C，加入IOOml無(wú)菌的20%葡萄糖。)，置30°C孵箱中倒置培養(yǎng)2_4天。隨機(jī)挑取5個(gè)單克隆菌落分別接種于IOml URA選擇培養(yǎng)液中，30°C振搖培養(yǎng)24h。將經(jīng)過(guò)鑒定表明成功轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體PESC-P1Y-3CDY的酵母INVSCl細(xì)胞命名為INVSCl/pESC-PlY_3CDY。同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)入pESC-URA空載體的酵母INVSCl細(xì)胞的對(duì)照，將該酵母細(xì)胞命名為INVSCl/pESC-URA。3、重組CVB3病毒樣顆粒在酵母細(xì)胞中的大量表達(dá)及純化I)重組CVB3病毒樣顆粒在酵母細(xì)胞中的大量表達(dá)將經(jīng)過(guò)上述步驟2獲得的INVSCl/pESC-PlY-3CDY (實(shí)驗(yàn)組)和INVSCl/pESC-URA (陰性對(duì)照組)取5ml酵母細(xì)胞培養(yǎng)液分別接種于100ml URA選擇培養(yǎng)液(選擇性培養(yǎng)液(Ura-) YNB 6. 7g，酵母Ura營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基粉末(Sigma公司，Y1501) I. 92g，溶于900ml去離子水中，高壓滅菌，冷卻至50°C，加入IOOml無(wú)菌的20% (20g/100ml)葡萄糖。)中，30°C振搖培養(yǎng)8h，取合適體積的培養(yǎng)液接種于500ml URA選擇培養(yǎng)液中，使0D600值為0. 4，30°C振搖培養(yǎng)4h，取合適體積的培養(yǎng)液接種3L URA誘導(dǎo)培養(yǎng)液(YNB 6. 7g，酵母Ura營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基粉末(Sigma公司，Y1501) I. 92g，溶于800ml去離子水中，高壓滅菌，冷卻至50°C，加入100ml無(wú)菌的20% (20g/100ml)半乳糖)，使0D600值為0. 4，30°C振搖培養(yǎng)48h，8000g離心15min收集菌體沉淀，用PBS緩沖液重懸，APV高壓均質(zhì)儀以1500bar循環(huán)破碎3次，4°C 12000g離心30min，收集上清(破碎菌液上清)，置-70°C保存。將I倍體積的50%PEG溶液(50%PEG溶液50gPEG6000 (Ameresco公司)溶于IOOml ddH20)緩慢加入到4倍體積的上述破碎菌液上清中，4°C攪拌過(guò)夜。第二日，4°C 12000rpm, 30min離心,去除上清,收集沉淀。用無(wú)菌PBS重懸沉淀,濃縮至樣品原體積的1/10，得到濃縮樣品(實(shí)驗(yàn)組濃縮樣品和陰性對(duì)照組濃縮樣品)。2)重組CVB3病毒樣顆粒的純化在離心管中由下至上依次小心加入I. 4g/ml、I. 34g/ml和I. 25g/ml的CsCl溶液各7ml，取酵母破碎上清液(上述步驟I)中得到的濃縮樣品)置CsCl不連續(xù)密度梯度(CsCl購(gòu)自北京欣經(jīng)科公司)，4°C用BeckmanSW32Ti轉(zhuǎn)頭IOOOOOg離心21h，小心收集目標(biāo)位置條帶。將收集樣品加入到100000MWC0超濾管中，40C 6000g離心20min，收集濃縮后樣品，待后續(xù)檢測(cè)(實(shí)驗(yàn)組待測(cè)樣品和陰性對(duì)照組待測(cè)樣品)。實(shí)施例4、重組CVB3病毒樣顆粒的鑒定及電鏡觀察對(duì)實(shí)施例3制備的待測(cè)樣品(實(shí)驗(yàn)組待測(cè)樣品和陰性對(duì)照組待測(cè)樣品)進(jìn)行 Western Blot鑒定和電鏡觀察。U Westerr Blot鑒定重組CVB3衣殼蛋白的表達(dá)利用碧云天公司的BCA蛋白定量試劑盒(增強(qiáng)型)(P0010S)，按照說(shuō)明書(shū)操作步驟，對(duì)實(shí)施例3得到的純化后的待測(cè)樣品(實(shí)驗(yàn)組待測(cè)樣品和陰性對(duì)照)進(jìn)行蛋白定量。根據(jù)定量結(jié)果，對(duì)兩種待測(cè)樣品各取適量的懸液(保證兩種樣品的上樣蛋白總量相等)進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳。用識(shí)別CVB5VP1的鼠單克隆抗體為一抗(一抗購(gòu)自Dako公司，產(chǎn)品編號(hào)為M7064)(由于CVB病毒的VPl蛋白具有高度的保守性，故此處使用CVB5VP1單抗驗(yàn)證，參見(jiàn)CVB5VP1的鼠單克隆抗體說(shuō)明書(shū))，熒光標(biāo)記羊抗鼠抗體為二抗(二抗購(gòu)自KPL，產(chǎn)品目錄號(hào)為072-07-18-06)進(jìn)行Western Blot分析(蛋白Marker購(gòu)自Fermentas公司)。同時(shí)設(shè)置CVB3病毒(柯薩奇病毒B3北京株0811,GENEBANK GQ141875. I)作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果如圖5所示，實(shí)驗(yàn)組待測(cè)樣品與CVB3病毒陽(yáng)性對(duì)照均檢測(cè)到大小約為34KD(VPl)的CVB3特異性條帶；而陰性對(duì)照組待測(cè)樣品未檢測(cè)到CVB3的特異性條帶。2、重組CVB3病毒樣顆粒的電鏡觀察將實(shí)施例3得到的純化后的兩個(gè)待測(cè)樣品(實(shí)驗(yàn)組待測(cè)樣品和陰性對(duì)照)調(diào)整蛋白濃度一致，各取IOiil懸液滴加在覆蓋鍍碳支持膜上靜止lmin，吸干鍍碳支持膜(購(gòu)自中鏡科儀，編號(hào)BZ110223)表面殘余液體，用2%磷鎢酸(購(gòu)自中鏡科儀，編號(hào)GZ02536)染色lmin，吸干鍍碳支持膜表面殘液，室溫放置干燥后用透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組待測(cè)樣品(圖6)在電鏡下均可見(jiàn)直徑約30nm左右的病毒樣顆粒的存在，而陰性對(duì)照組(空載體)測(cè)樣品則沒(méi)有在電鏡下觀察到病毒樣顆粒的存在。本實(shí)施例的結(jié)果表明，攜帶有密碼子優(yōu)化后的CVB3P1基因和CVB33⑶基因的重組表達(dá)載體在酵母系統(tǒng)中，成功的包裝出CVB3的病毒樣顆粒。
權(quán)利要求
1.柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒的制備方法，包括如下步驟 1)將柯薩奇病毒B3型的Pl基因和3⑶基因克隆到目的質(zhì)粒中，得到重組表達(dá)載體； 2)用步驟I)得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化目的酵母細(xì)胞，得到表達(dá)所述Pl基因和所述3⑶基因的重組酵母細(xì)胞； 3)裂解步驟2)得到的重組酵母細(xì)胞，分離得到重組的柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述Pl基因和所述3CD基因均為經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的基因；所述優(yōu)化為在不改變野生型柯薩奇病毒B3型Pl蛋白和野生型柯薩奇病毒B3型3CD蛋白氨基酸序列的前提下，將野生型柯薩奇病毒B3型Pl基因和野生型柯薩奇病毒B3型3CD基因的密碼子替換為酵母細(xì)胞偏好的密碼子。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述Pl基因的核苷酸序列為序列表中序列I所示；所述3CD基因的核苷酸序列為序列表中序列2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述目的酵母細(xì)胞為釀酒酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述Pl基因和所述3CD基因在所述重組表達(dá)載體中各由一個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄，驅(qū)動(dòng)所述Pl基因的啟動(dòng)子方向和驅(qū)動(dòng)所述3CD基因的啟動(dòng)子方向相反。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述重組表達(dá)載體為將所述Pl基因和所述3CD基因分別插入到pESC-URA的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)處各由一個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄得到的重組質(zhì)粒。
7.利用權(quán)利要求1-6中任一所述方法制備得到的柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒。
8.密碼子優(yōu)化型的柯薩奇病毒B3型的Pl基因，其特征在于所述Pl基因的核苷酸序列為序列表中序列I所示；或 密碼子優(yōu)化型的柯薩奇病毒B3型的3CD基因，其特征在于所述3CD基因的核苷酸序列為序列表中序列2所示。
9.含有權(quán)利要求8所述Pl基因和/或3CD基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
10.權(quán)利要求8所述Pl基因和/或3CD基因在制備下述a)或b)產(chǎn)品中的應(yīng)用 a)柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒； b)以柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒為活性成分的預(yù)防性疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了重組柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒的制備方法。本發(fā)明所提供的方法包括如下步驟1)將柯薩奇病毒B3型的P1基因和3CD基因克隆到目的質(zhì)粒中，得到重組表達(dá)載體；2)用步驟1)得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化目的酵母細(xì)胞，得到表達(dá)所述P1基因和所述3CD基因的重組酵母細(xì)胞；3)裂解步驟2)得到的重組酵母細(xì)胞，分離得到重組的柯薩奇病毒B3型病毒樣顆粒。實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明所提供的方法，在酵母表達(dá)系統(tǒng)中成功的制備了柯薩奇病毒B3型的病毒樣顆粒，可將其進(jìn)一步用于病毒性心肌炎與I型糖尿病候選預(yù)防性疫苗和藥物組合物。
文檔編號(hào)A61K39/125GK102827846SQ20121035063
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者盛望, 張瀟, 王曉雯, 趙淼, 曾毅, 李澤琳, 劉偉 申請(qǐng)人:北京工業(yè)大學(xué)