專利名稱：含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域的融合多肽突變體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及含有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域TAT、Smad錨定與受體活化蛋白SARA肽適體(SARA/SBD)的融合多肽突變體，還涉及編碼該融合多肽突變體的cDNA序列及其衍生物，包含此類cDNA序列的重組表達(dá)載體，用此類重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以及用于制 備此類重組蛋白質(zhì)和它們的衍生物的方法。本發(fā)明還涉及該融合蛋白突變體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腎臟纖維化是不同病因(包括炎癥、損傷、藥物、糖尿病和遺傳因素、衰老等)所導(dǎo)致慢性腎臟疾病的最終共同結(jié)局。各種進(jìn)展性腎臟疾病，無論其原發(fā)病如何，最終都將導(dǎo)致腎臟纖維化，進(jìn)展為終末期腎功能衰竭，并必須依靠透析或腎移植維持生命。因此，研究腎臟纖維化的發(fā)病機(jī)制、探索能夠緩解腎臟纖維化進(jìn)程或逆轉(zhuǎn)腎臟纖維化的有效治療手段、延緩終末期腎衰的發(fā)生是腎臟疾病研究領(lǐng)域亟待解決的重要臨床問題。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在眾多細(xì)胞因子、體液、代謝和血流動(dòng)力學(xué)因素中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β I (Transforming growth factor- β I, TGF- β I)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphorgenic protein, BMP)及其下游的smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展中起著決定性作用。通過阻斷TGF-β I信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和(或)增強(qiáng)ΒΜΡ7信號(hào)來逆轉(zhuǎn)或延緩腎臟纖維化成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，并已在大量的體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得以證實(shí)。但目前已經(jīng)建立的阻斷TGF-β I信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的策略在抑制腎臟纖維化的同時(shí)也對(duì)機(jī)體對(duì)抗腎臟炎癥的作用通路產(chǎn)生了抑制作用，因此難于在臨床推廣應(yīng)用。ΒΜΡ7在治療急性和慢性腎臟疾病中雖顯示出良好的效果，然而ΒΜΡ7的活性形式為二聚體，含有6個(gè)分子內(nèi)二硫鍵和一個(gè)分子間二硫鍵，使用基因工程技術(shù)制備時(shí)蛋白復(fù)性成本過高，不能被廣大患者接受。從2009年始，本課題組一直致力于探索TGF-β I通路抑制蛋白SARA阻斷腎纖維化的作用研究，探索能夠替代基因治療及ΒΜΡ7并能有效治療、緩解腎臟纖維化的蛋白藥物。合成的SARA融合蛋白雖具一定的功能活性，但蛋白表達(dá)不穩(wěn)定，以包涵體形式存在，沉淀蛋白須經(jīng)復(fù)性才可使用，但復(fù)性常使蛋白性質(zhì)發(fā)生變化而失去功能，不利于今后的藥物生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在原有SARA融合蛋白的工作基礎(chǔ)上，對(duì)SARA羧基末端的Smad結(jié)合作用域——SARA肽適體(SARA/SBD)進(jìn)行改造，獲得一種含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域TAT、Smad錨定與受體活化蛋白SARA肽適體(SARA/SBD)的新的融合多肽突變體。其中，所述蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域TAT為人類免疫缺陷病毒-I型(HIV-I)的反式激活蛋白(transactivator of transcription, TAT)改造而來，其氨基酸序列為 SEQ ID NO:I (YARAAARQARA)。其中，Smad錨定與受體活化蛋白SARA肽適體(SARA/SBD)與人SARA/SBD同源，其突變體是通過將Smad錨定與受體活化蛋白SARA肽適體(SARA/SBD)氨基酸序列的第51位由A突變?yōu)門以及第54位由A突變?yōu)镻而獲得的；該突變體的氨基酸序列為SEQID NO :2(MSASSQSPNPNNPAEYCSTIPPLQQAQASGALSSPPPTVMVPVGVLKHPGTEVPQPR)。其中，所述連接肽包含至少I個(gè)、3個(gè)、5個(gè)、7個(gè)、9個(gè)、15個(gè)、25個(gè)氨基酸，如其氨基酸序列為SGGGS (SEQID No 3)。本發(fā)明還涉及該融合蛋白突變體的氨基酸序列，如SEQ ID NO :4所示(YARMARQARASGGGSMSAS SQSPNPNNPA EYCSTIPPLQ QAQASGALSS PPPTVMVPVG VLKHPGTEVP QPR);本發(fā)明還涉及編碼該融合蛋白突變體的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示；以及該核酸分子的cDNA序列；該核酸分子或其cDNA與啟動(dòng)子構(gòu)建的表達(dá)盒；包含該核酸分子、或其cDNA、或其表達(dá)盒的質(zhì)?；蜉d體，其中該質(zhì)?；蜉d體是表達(dá)載體；還涉及宿主細(xì)胞，其包含該核酸分子、cDNA序列、表達(dá)盒、或質(zhì)?；蜉d體。本發(fā)明還涉及制備該融合蛋白突變體的方法，其中所述方法包括1)提供核酸，所述核酸包含可在生物中表達(dá)的編碼所述融合蛋白突變體的核苷酸序列；2)在所述生物中表達(dá)所述核酸以形成TAT-SARA/SBD融合蛋白突變體；和3)純化所述TAT-SARA/SBD融合蛋白突變體。 本發(fā)明還涉及將該融合蛋白突變體用作制備藥物；本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含有效量的該融合蛋白突變體以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含上述表達(dá)盒、或上述質(zhì)粒或載體以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明還涉及上述融合蛋白突變體、核酸分子、cDNA、表達(dá)盒、質(zhì)?；蜉d體、宿主細(xì)胞的用途，如制備治療腎臟纖維化的藥物。本發(fā)明最大的目的就是在原有SARA融合蛋白的工作基礎(chǔ)上，對(duì)SARA羧基末端的Smad結(jié)合作用域-SARA肽適體(SARA/SBD)進(jìn)行改造，獲得這種含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域TAT、Smad錨定與受體活化蛋白SARA肽適體(SARA/SBD)的新的融合多肽突變體。再將該融合蛋白突變體的編碼基因?qū)氡磉_(dá)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)后分離純化。具體為將該融合蛋白突變體克隆至SI載體,轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,進(jìn)行表達(dá)純化,得到大量上清表達(dá)、不需復(fù)性、穩(wěn)定的目的蛋白。檢測(cè)該融合蛋白突變體的功能活性，發(fā)現(xiàn)該融合蛋白突變體具備體內(nèi)生物學(xué)活性。建立單側(cè)輸尿管結(jié)扎梗阻模型，以TAT-SARA/SBD為受試藥物，SARA/SBD、注射用生理鹽水為對(duì)照藥物，以實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)腎臟纖維化為檢測(cè)指標(biāo)，確定該蛋白具備明顯逆轉(zhuǎn)腎纖維化的效果。因此，該融合蛋白突變體可用于制備治療腎臟纖維化的藥物。


圖I是實(shí)施例融合蛋白突變體的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖，其中，圖IA為S1-TAT-SARA/SBD質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖、圖IB為M2-TAT-SARA/SBD質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。圖2是實(shí)施例S1-TAT-SARA/SBD融合蛋白突變體的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果圖，其中M :蛋白 marker ；NC :未誘導(dǎo)的 BL21/S1-TAT PTD-SARA/SBD ；1 :15 °C 過夜誘導(dǎo) BL21/S1-TATPTD-SARA/SBD ;2_3 37°C 4h 誘導(dǎo)的 BL21/S1-TAT PTD-SARA/SBD。圖3是實(shí)施例SI-TAT-SARA/SBD融合蛋白突變體的純化結(jié)果，其中M marker ；1 離心后的沉淀；2 :離心后的上清；3 :穿過峰；4-10 :洗脫后的產(chǎn)物。圖4是實(shí)施例SI-TAT-SARA/SBD融合蛋白突變體的純化產(chǎn)物鑒定結(jié)果，其中M1 marker ；M2 Easy westernmarker ；I :純化產(chǎn)物 SDS_PAGE(圖 3 的 4 7) ;2 :純化產(chǎn)物SDS-PAGE (圖 3 的 8 10) ；3 ffestern blot 鑒定(圖 3 的 4 7) ；Lane 4 ffestern blot鑒定(圖3的8 10)。圖5是實(shí)施例TAT-SARA/SBD融合蛋白突變體的抑制單側(cè)輸尿管結(jié)扎后腎纖維化的效果(圖5A，圖5B)。
具體實(shí)施例方式I、為了在SI質(zhì)粒中表達(dá)本發(fā)明的TAT-SARA/SBD融合蛋白突變體，在該融合蛋白突變體的前面加上His tag和SUMO tag。按照大腸桿菌慣用密碼子設(shè)計(jì)并合成了編碼TAT-SARA/SBD的核酸片斷CATATGATGC ATCACCACCA CCATCACTAT GCCCGTGCGG CGGCGCGTCAGGCCCGTGCT TCTGGCGGCG GTTCAATGTC GGCGAGTAGT CAGAGTCCGAACCCGAACAA TCCGGCAGAA TATTGCTCCA CCATTCCGCC GCTGCAGCAAGCGCAGGCCA GCGGCGCGCT GAGCTCTCCG CCGCCGACCG TGATGGTTCCGGTCGGCGTT CTGAAACACC CGGGCACCGA AGTTCCGCAA CCGCGTTAATGAAAGCTT (SEQ ID NO 5)(圖 I)。2、SI、M2質(zhì)粒由南京金斯瑞(GenScript)生物科技有限公司獲得，它的克隆位點(diǎn)是Nde I和Hind III，將上述合成的片斷亞克隆至質(zhì)粒SI。(圖I)3、TAT-SARA/SBD融合蛋白突變體的誘導(dǎo)表達(dá)將重組好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)細(xì)胞，隨機(jī)挑選單克隆接種于含氨芐青霉素的LB中，37°C、200rpm活化振搖培養(yǎng)，一旦細(xì)胞濃度達(dá)OD65tol = O. 6-0. 8，加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)。SDS-PAGE and Western blot監(jiān)測(cè)表達(dá)表達(dá)結(jié)果。(圖2)4、TAT-SARA/SBD融合蛋白突變體的純化質(zhì)粒SI用于擴(kuò)增產(chǎn)物，3L培養(yǎng)液15 °C過夜誘導(dǎo)，細(xì)胞經(jīng)50mM Tris-HCl,300mMNaCl, 20mM Imidazole, pH8. 0高頻聲波裂解，離心后上清裝填Ni-NTA層析純化，SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)并經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析，純度大于95%。(圖3、4)5、TAT-SARA/SBD融合蛋白突變體的體內(nèi)抗纖維化作用TAT-SARA/SBD融合蛋白突變體對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻所致腎臟纖維化模型的治療作用制備小鼠UUO模型，按5mg、10mg/kg體重尾靜脈注射TAT-SARA/SBD，觀察TAT-SARA/SBD 對(duì)UUO模型腎臟纖維化的治療作用。設(shè)立假手術(shù)組、單純UUO模型組和SARA組作為對(duì)照。組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)觀察免疫組化染色定量腎組織E-cadherin、a_SMA等。圖5A和圖5B是TAT-SARA/SBD融合蛋白突變體體內(nèi)逆轉(zhuǎn)纖維化結(jié)果圖。
權(quán)利要求
1.一種TAT-SARA/SBD融合蛋白突變體，其是由蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域TAT、Smad錨定與受體活化蛋白SARA肽適體(SARA/SBD)的突變體通過連接肽連接獲得，所述蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域TAT為人類免疫缺陷病毒 _1 型(HIV-I)的反式激活蛋白(transactivator of transcription, TAT)改造而來，所述Smad錨定與受體活化蛋白SARA肽適體(SARA/SBD)與人SARA/SBD同源。
2.權(quán)利要求I的融合蛋白突變體，其中所述蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域TAT的氨基酸序列為SEQIDNO :1。
3.權(quán)利要求I的融合蛋白突變體，其中通過將Smad錨定與受體活化蛋白SARA肽適體(SARA/SBD)氨基酸序列的第51位由A突變?yōu)門，第54位由A突變?yōu)镻，從而獲得所述Smad錨定與受體活化蛋白SARA肽適體(SARA/SBD)突變體，獲得的突 變體的氨基酸序列為SEQID NO :2。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的融合蛋白突變體，其中所述連接肽的氨基酸序列為SEQIDNO :3。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的融合蛋白突變體，其氨基酸序列為SEQID N0:4。
6.核酸分子，其中所述核酸分子包含編碼權(quán)利要求1-5的融合蛋白突變體的多核苷酸序列。
7.權(quán)利要求6的核酸分子，其核苷酸序列為SEQID NO :5。
8.制備權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的TAT-SARA/SBD融合蛋白突變體的方法，其中所述方法包括 1)提供核酸，所述核酸包含可在生物中表達(dá)的編碼所述融合蛋白突變體的核苷酸序列； 2)在所述生物中表達(dá)所述核酸以形成TAT-SARA/SBD融合蛋白突變體；和 3)純化所述TAT-SARA/SBD融合蛋白突變體。
9.藥物組合物，其中所述藥物組合物包含權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的TAT-SARA/SBD融合蛋白突變體以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
10.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的TAT-SARA/SBD融合蛋白突變體、或權(quán)利要求6或7的核酸分子在制備治療腎臟纖維化的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域TAT、Smad錨定與受體活化蛋白SARA肽適體(SARA/SBD)融合多肽突變體的結(jié)構(gòu)序列及構(gòu)建方法。該融合蛋白突變體含73個(gè)氨基酸。將該蛋白進(jìn)行融合表達(dá)和純化，以純化的TAT-SARA/SBD為受試藥物進(jìn)行動(dòng)物單側(cè)輸尿管結(jié)扎梗阻模型實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，受試藥物具備逆轉(zhuǎn)纖維化效果。該融合蛋白突變體可高效上清表達(dá)、易于純化，便于生產(chǎn)，有望用于抑制腎纖維化的治療中。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102863538SQ20121035019
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月20日
發(fā)明者黃晨, 孫世仁, 王漢民, 張鵬, 杜銳, 許國雙, 劉曉渭, 劉宏寶, 何麗潔, 李嶸 申請(qǐng)人:黃晨