專利名稱：高效表達(dá)ha蛋白的重組流感病毒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及到疫苗的生產(chǎn)領(lǐng)域，具體地，是涉及到一種高效表達(dá)HA蛋白的重組流感病毒及其制備方法和應(yīng)用。技術(shù)領(lǐng)域流感是由正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的一種急性、高度接觸性傳染 病，高致病性禽流感被國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織確定為A類疫病。流感病毒根據(jù)基質(zhì)蛋白(Matrixprotein,Μ)的不同可以分為A、B、C三型。根據(jù)流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase, NA)抗原性的差異,又可將流感病毒分為不同的亞型，A型流感病毒根據(jù)HA劃分為16個(gè)亞型，根據(jù)NA劃分為9個(gè)亞型。流感病毒具有高度傳染性，可通過(guò)飛沫傳播，因此它能在短期內(nèi)突然發(fā)生，迅速蔓延，造成不同程度的流行，甚至世界大流行。1983-1984年，美國(guó)賓州的高致病性禽流感暴發(fā)，造成1700萬(wàn)家禽死亡，損失近6500萬(wàn)美元。2003年年底，亞洲多個(gè)國(guó)家和地區(qū)暴發(fā)了高致病性的禽流感。禽流感的暴發(fā)，使I億多只家禽死亡或被撲殺，部分國(guó)家禽肉產(chǎn)量和銷售量急劇下降，價(jià)格下跌，禽肉及其制品進(jìn)出口暫時(shí)中止；此外，家禽養(yǎng)殖業(yè)、飼料行業(yè)和旅游業(yè)也都受到不利的影響。據(jù)糧農(nóng)組織估計(jì)，由此遭受的損失至少為5億美元。此外，許多亞型的禽流感病毒具有跨宿主傳播至人的能力，因而，該病的暴發(fā)也同時(shí)危害著社會(huì)公共安全。二十世紀(jì)爆發(fā)了三次流感的大流行，分別是1918年西班牙流感(HlNl)、1957年亞洲流感(H2N2)和1968年香港流感(H3N2)，其中最大規(guī)模的流行為西班牙流感。該流感疫病造成全球2000萬(wàn)人的死亡，超過(guò)第一次世界大戰(zhàn)死亡人數(shù),列全球所有傳染病死亡的第一位。流感病毒的基因組由單股，負(fù)義RNA片段組成.。A型流感病毒分為8個(gè)片段，編碼11種功能蛋白，片段1、2、3分別編碼三個(gè)聚合酶蛋白PB2、PB1和PA ;片段4編碼血凝素HA ;片段5編碼核衣殼蛋白NP ;片段6編碼神經(jīng)氨酸酶NA ;片段7編碼基質(zhì)蛋白Ml和離子通道M2 ;片段8編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSl和NS2。其中HA和NA是流感病毒最主要的兩種表面糖蛋白，HA蛋白是流感病毒最重要的保護(hù)性抗原。目前，各國(guó)對(duì)動(dòng)物和人流感的預(yù)防控制采取了不同的措施，但是疫苗接種仍然是預(yù)防流感的最佳選擇，因此研制有效的流感疫苗對(duì)于控制流感流行具有極其重要的意義。全病毒滅活疫苗是目前應(yīng)用最廣泛的疫苗，該疫苗安全性好，不會(huì)出現(xiàn)毒力返強(qiáng)和變異的危險(xiǎn)，能夠經(jīng)受同種亞型流感病毒的攻擊。目前已上市的流感疫苗基本都是使用雞胚培養(yǎng)制備，國(guó)內(nèi)外使用雞胚培養(yǎng)疫苗已經(jīng)有50年歷史。由于雞胚生產(chǎn)流感疫苗需要消耗大量的雞胚，雞胚帶有潛在污染可能，而且培養(yǎng)周期過(guò)長(zhǎng)，不易于擴(kuò)大產(chǎn)量，不利于應(yīng)對(duì)大規(guī)模的流感爆發(fā)。為此，世界衛(wèi)生組織、美國(guó)政府等都鼓勵(lì)發(fā)展細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)替代目前的雞胚培養(yǎng)技術(shù)來(lái)生產(chǎn)流感疫苗。為加快細(xì)胞培養(yǎng)流感疫苗技術(shù)的開(kāi)發(fā)，美國(guó)政府決定投資11億美元資助葛蘭素史克、edlmmune、諾華、DynPort、Solvay和巴斯德6個(gè)主要的流感疫苗開(kāi)發(fā)新技術(shù)。在2007年，全球最大的生物制藥公司之一諾華宣布其人用流感疫苗Optaflu上市，成為唯一獲批(歐盟批準(zhǔn))的人用細(xì)胞培養(yǎng)流感疫苗，是50年流感疫苗生產(chǎn)史最重大的創(chuàng)新
之一 。無(wú)論采用雞胚法和大規(guī)模細(xì)胞制備法獲得病毒，重要的影響因素便是疫苗種毒本身是不是高產(chǎn)量的病毒株。A/Puerto Rico/8/34(PR8)是一株雞胚適應(yīng)病毒株，是目前在雞胚上高產(chǎn)株之一，疫苗研制中常常將PR8的6個(gè)內(nèi)部基因與流行毒株的HA和NA基因重組(6+2模式)，將重組病毒作為疫苗株來(lái)提高病毒滴度。為了進(jìn)一步提高PR8的病毒滴度，滿足在流感大暴發(fā)時(shí)，巨大的疫苗需求量，科研人員進(jìn)行了大量的研究，通過(guò)優(yōu)化病毒基因來(lái)提高病毒株產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn)該流感病毒一些蛋白的某個(gè)氨基酸位點(diǎn)對(duì)該病毒的增殖能力具有重要的影響，如PB2上360位的酪氨酸(Tyr)和NSl上55位的谷氨酸(Glu)也起到一定作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一，在于提供一種PR8突變重組流感病毒，該重組流感病毒可高效表達(dá)HA蛋白，適用于大規(guī)模生產(chǎn)流感疫苗。實(shí)現(xiàn)上述目的技術(shù)方案如下一種PR8重組流感病毒，其含有Hl亞型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6個(gè)內(nèi)部基因(PB1，PB2, PA，NP, M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突變位點(diǎn)NS基因編碼的NS2蛋白上具有E67S點(diǎn)突變、或E74S點(diǎn)突變、或E67S/E74S點(diǎn)突變，NP基因編碼的NP蛋白上具有G132A點(diǎn)突變，所述Hl亞型流感病毒是除PR8病毒以外的Hl亞型流感病毒(編碼具有E67S點(diǎn)突變、或E74S點(diǎn)突變、或E67S/E74S點(diǎn)突變的NS2蛋白的NS基因，以及編碼具有G132A點(diǎn)突變的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分別如SEQID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一種PR8重組流感病毒，其含有H3亞型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6個(gè)內(nèi)部基因( 81，？82，？么，冊(cè)^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突變位點(diǎn)NS基因編碼的NS2蛋白上具有E67S點(diǎn)突變、或E74S點(diǎn)突變、或E67S/E74S點(diǎn)突變，NP基因編碼的NP蛋白上具有G132A點(diǎn)突變(編碼具有E67S點(diǎn)突變、或E74S點(diǎn)突變、或E67S/E74S點(diǎn)突變的NS2蛋白的NS基因，以及編碼具有G132A點(diǎn)突變的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分別如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一種PR8重組流感病毒，其含有H4亞型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6個(gè)內(nèi)部基因( 81，？82，？么，冊(cè)^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突變位點(diǎn)NS基因編碼的NS2蛋白上具有E67S點(diǎn)突變、或E74S點(diǎn)突變、或E67S/E74S點(diǎn)突變，NP基因編碼的NP蛋白上具有G132A點(diǎn)突變(編碼具有E67S點(diǎn)突變、或E74S點(diǎn)突變、或E67S/E74S點(diǎn)突變的NS2蛋白的NS基因，以及編碼具有G132A點(diǎn)突變的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分別如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一種PR8重組流感病毒，其含有H5亞型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6個(gè)內(nèi)部基因( 81，？82，？么，冊(cè)^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突變位點(diǎn)NS基因編碼的NS2蛋白上具有E67S點(diǎn)突變、或E74S點(diǎn)突變、或E67S/E74S點(diǎn)突變，NP基因編碼的NP蛋白上具有G132A點(diǎn)突變(編碼具有E67S點(diǎn)突變、或E74S點(diǎn)突變、或E67S/E74S點(diǎn)突變的NS2蛋白的NS基因，以及編碼具有G132A點(diǎn)突變的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分別如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一種PR8重組流感病毒，其含有H6亞型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6個(gè)內(nèi)部基因( 81，？82，？么，冊(cè)^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突變位點(diǎn)NS基因編碼的NS2蛋白上具有E67S點(diǎn)突變、或E74S點(diǎn)突變、或E67S/E74S點(diǎn)突變，NP基因編碼的NP蛋白上具有G132A點(diǎn)突變(編碼具有E67S點(diǎn)突變、或E74S點(diǎn)突變、或E67S/E74S點(diǎn)突變的NS2蛋白的NS基因，以及編碼具有G132A點(diǎn)突變的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分別如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一種PR8重組流感病毒，其含有H7亞型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6個(gè)內(nèi)部基因( 81，？82，？么，冊(cè)^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突變位點(diǎn)NS基因編碼的NS2蛋白上具有E67S點(diǎn)突變、或E74S點(diǎn)突變、或E67S/E74S點(diǎn)突變，NP基因編碼的NP蛋白上具有G132A點(diǎn)突變(編碼具有E67S點(diǎn)突變、或E74S點(diǎn)突變、或E67S/E74S點(diǎn)突變的NS2蛋白的NS基因，以及編碼具有G132A點(diǎn)突變的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分別如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一種PR8重組流感病毒，其含有H9亞型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6個(gè)內(nèi)部基因( 81，？82，？么，冊(cè)^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突變位點(diǎn)NS基因編碼的NS2蛋白上具有E67S點(diǎn)突變、或E74S點(diǎn)突變、或E67S/E74S點(diǎn)突變，NP基因編碼的NP蛋白上具有G132A點(diǎn)突變(編碼具有E67S點(diǎn)突變、或E74S點(diǎn)突變、或E67S/E74S點(diǎn)突變的NS2蛋白的NS基因，以及編碼具有G132A點(diǎn)突變的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分別如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO :24-27所示)。一種PR8重組流感病毒，其含有HlO亞型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6個(gè)內(nèi)部基因( 81，？82，？么，冊(cè)^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突變位點(diǎn)NS基因編碼的NS2蛋白上具有E67S點(diǎn)突變、或E74S點(diǎn)突變、或E67S/E74S點(diǎn)突變，NP基因編碼的NP蛋白上具有G132A點(diǎn)突變(編碼具有E67S點(diǎn)突變、或E74S點(diǎn)突變、或E67S/E74S點(diǎn)突變的NS2蛋白的NS基因，以及編碼具有G132A點(diǎn)突變的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分別如SEQ ID. NO 20-23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID. NO 24-27 所示)。本發(fā)明的另一目的是提供制備上述PR8重組流感病毒的方法。實(shí)現(xiàn)該目的的技術(shù)方案如下一種制備上述PR8重組流感病毒的方法，包括以下步驟構(gòu)建分別包含Hl、H3、H4、H5、H6、H7、H9、HlO亞型流感病毒的HA和NA基因的重
組質(zhì)粒；構(gòu)建包含PR8病毒突變基因片段的重組質(zhì)粒，該P(yáng)R8病毒突變基因片段選自下述突變的NS或NP基因片段編碼含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S點(diǎn)突變的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段，編碼含有G132A點(diǎn)突變的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段；將上述各亞型流感病毒的HA基因的重組質(zhì)粒和NA基因的重組質(zhì)粒，與上述包含PR8病毒突變基因片段的重組質(zhì)粒、以及分別包含PR8病毒PA、PB1、PB2、M、NP或NS內(nèi)部基因的質(zhì)粒按相應(yīng)組合一起轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞；將培養(yǎng)的細(xì)胞上清接種于雞胚，在孵化器內(nèi)培養(yǎng)合適時(shí)間后，收獲雞胚尿囊液，檢測(cè)該尿囊液的血凝性，如果有血凝活性，并且經(jīng)過(guò)序列分析確定沒(méi)有非預(yù)期突變后，即獲得PR8重組流感病毒。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，制備上述PR8重組流感病毒的方法，包括以下步驟(一 )、構(gòu)建重組質(zhì)粒
八、獲得!11、!13、!14、冊(cè)，冊(cè)、!17、!19、!110亞型流感病毒的擬和嫩基因；獲得!11、!13、!14、冊(cè)、冊(cè)、!17、!19、!110亞型流感病毒的擬和嫩基因的方法為分別抽提HI、H3、H4、H5、H6、H9和HlO亞型流感病毒的總RNA ；分別以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成Hl、H3、H4、H5、H6、H9、HlO亞型流感病毒的cDNA ；以獲得的cDNA 為模板，分別用 SEQ ID. NO 13 和 SEQ ID. NO 14 以及 SEQ ID. NO 11和SEQ ID. NO 12為上下游引物，分別擴(kuò)增出HI、H3、H4、H6、H9、HlO亞型流感病毒的HA基因和HI、H3、H4、H5、H6、H9、HlO亞型流感病毒的NA基因；以H5亞型流感病毒的cDNA為模板，用突變H5HA堿性裂解位點(diǎn)的引物SEQ ID. NO
15和 SEQ ID. NO :13、及引物 SEQ ID. N0:16 和 SEQ ID. NO :14 分別擴(kuò)增，再用 SEQ ID. NO 13和SEQ ID. NO 14引物進(jìn)行PCR融合擴(kuò)增，獲得含有低致病性禽流感毒株堿性裂解位點(diǎn)的H5N1亞型流感病毒的HA基因；所述H7亞型流感病毒的HA和NA基因的制備為人工合成H7亞型流感病毒的NA基因和含有低致病性禽流感毒株堿性裂解位點(diǎn)的HA基因，并用SEQ ID. NO 13和SEQID. NO :14和SEQ ID. NO 11和SEQ ID. NO 12為上下游引物，分別進(jìn)行擴(kuò)增，分別擴(kuò)增出H7亞型流感病毒的HA基因和NA基因。B、分別獲得編碼含有G132A點(diǎn)突變的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段和編碼含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S點(diǎn)突變的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段；優(yōu)選地，所述分別獲得編碼含有G132A點(diǎn)突變的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段和編碼含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S點(diǎn)突變的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段的制備為以含有PR8病毒NP基因的重組質(zhì)粒為模板，分別用引物SEQ ID. NO :7和SEQID. NO 6以及引物SEQ ID. NO 5和SEQ ID. NO 8在Pfx DNA聚合酶的作用下分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以兩段PCR產(chǎn)物為模板，以SEQ ID. NO :7和SEQ ID. NO 8為引物，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增融合，獲得點(diǎn)突變G132A的PR8病毒NP基因片段；以PBD-PR8NS重組質(zhì)粒為模板，分別用引物SEQ ID. NO 9和SEQ ID. NO 2以及引物SEQ ID. NO : I和SEQ ID. NO : 10在Pfx DNA聚合酶的作用下分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以兩段PCR產(chǎn)物為模板，以SEQ ID. NO 9和SEQ ID. NO 10為引物，進(jìn)行第二次PCR融合，獲得編碼含有E67S定點(diǎn)突變NS2蛋白的NS基因片段；
以PBD-PR8NS重組質(zhì)粒為模板，分別用引物SEQ ID. NO :9和SEQ ID. NO 4以及SEQID. NO :3和引物SEQ ID.N0:10在Pfx DNA聚合酶的作用下分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以兩段PCR產(chǎn)物為模板，以SEQ ID. NO :9和SEQ ID. NO : 10為引物，進(jìn)行第二次PCR融合，獲得編碼含有E74S定點(diǎn)突變NS2蛋白的NS基因片段；以上述的編碼含有E67S定點(diǎn)突變NS2蛋白的NS基因片段為模板，分別用引物SEQ ID. NO 9 和 SEQ ID. NO 4 以及引物 SEQ ID. NO 3 和 SEQ ID. NO :10 在 Pfx DNA 聚合酶的作用下分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以兩段PCR產(chǎn)物為模板，以SEQ ID. NO :9和SEQ ID. NO 10為引物，進(jìn)行第二次PCR融合，獲得編碼同時(shí)含有E74S和E74S定點(diǎn)突變NS2蛋白的NS基因片段；C、制備重組質(zhì)粒分別將獲得的編碼含有G132A點(diǎn)突變的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段和編碼含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S點(diǎn)突變的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段和上述獲得的HA和NA基因經(jīng)過(guò)酶切、連接及轉(zhuǎn)化，獲得相應(yīng)的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒為以下中的一種以上PBD-(HI)HA、PBD-(HI)NA ；PBD-(H3)HA、PBD-(H3)NA ；PBD-(H4)HA、PBD-(H4N2) NA ；PBD-(H5) HA、PBD-(H5) NA ；PBD-(H6)HA、PBD-(H6)NA ；PBD- (H7)HA、PBD- (H7)NA ;PBD-(H9)HA、PBD-(H9) NA ;PBD_ (HlO) HA、PBD-(HlO)NA ;PBD-PR8NS_NS2E67/74S、PBD-PR8NS-NS2E67S、PBD-PR8NS-NS2E74S、PBD-PR8NP-G132A、PBD-PR8PB1、PBD-PR8PB2、 PBD-PR8PA、PBD-PR8NP、PBD-PR8M、PBD PR8NS(Zejun Li, et al. JVI, 2005, 79 (18)12058-12064)。(二)、制備PR8重組流感病毒將上述獲得的重組質(zhì)粒按照相應(yīng)組合，轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞；轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞上清用TPCK-Trypsin處理后，接種SPF雞胚，培養(yǎng)；收獲雞胚尿囊液，獲得上述的PR8重組流感病毒。本發(fā)明的另一目的是上述PR8重組流感病毒的應(yīng)用。具體技術(shù)方案如下上述任一所述的PR8重組流感病毒在制備流感疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)PR8病毒株的NS2蛋白第67位氨基酸由E突變?yōu)镾(E67S點(diǎn)突變)，或NS2蛋白第74位氨基酸由E突變成S (E74S點(diǎn)突變)，或NS2蛋白第64和74位氨基酸同時(shí)由E突變成S(E67S/E74S點(diǎn)突變)，病毒突變株在雞胚上的增殖能力明顯提高。此外，NP蛋白的第132位氨基酸由G突變?yōu)锳時(shí)(G132A點(diǎn)突變)，突變體的病毒株在細(xì)胞上的增殖能力明顯提高。利用這些高增殖能力突突病毒的內(nèi)部基因和不同亞型(H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10)流感病毒進(jìn)行人工重組，獲得本發(fā)明所述的高效表達(dá)HA抗原的重組病毒，這些重組病毒可用于大規(guī)模制備流感疫苗。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。圖I重組PR8突變病毒及重組PR8病毒在雞胚上的血凝活性。圖2重組PR8突變病毒及重組PR8病毒在細(xì)胞上的血凝活性。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定I、引物設(shè)計(jì)
設(shè)計(jì)流感病毒PR8的NS和NP的突變引物；流感病毒12bp反轉(zhuǎn)錄引物、A型流感的通用引物、H5和H7HA裂解位點(diǎn)突變引物由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)。上述引物具體的序列見(jiàn)表1(本發(fā)明中所用到的引物序列，具體見(jiàn)表I)，均由上海Invitrogen公司合成。2、兩點(diǎn)定點(diǎn)突變采用兩步PCR方法對(duì)預(yù)期突變氨基酸位點(diǎn)的核苷酸進(jìn)行突變。首先以PBD-PR8NP為模板，分別用 BSPQI-NP-forward 和 PR8-NP-400R 以及 PR8-NP-387F 和 BSPQI-NP-reverse為上下游引物，在Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)的作用下分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR獲得的兩個(gè)片段，通過(guò)膠回收試劑盒回收。以回收的兩段PCR產(chǎn)物為模板，以BSPQI-NP-forward和BSPQI-NP-reverse為引物，進(jìn)行第二次PCR融合。如此獲得編碼G132A點(diǎn)突變的NP蛋白的NP基因片段。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，進(jìn)入以下循環(huán)，94°C變性45s，53 °C退火45s，72°C延伸lmin-lmin45s，運(yùn)行30個(gè)循環(huán)，最后再72°C延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，PCR 產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。用同樣的方法，利用表I中NS2突變引物PR8-NS2-193F、PR8-NS2-204R，PR8-NS2-215F、PR8-NS2-224R和NS基因擴(kuò)增引物BSPQI_NS-forward和BSPQI-NS-reverse分別獲得含有NS2E67S、E74S和NS2E67/74S點(diǎn)突變的NS基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。具體如下以PBD-PR8NS重組質(zhì)粒為模板，分別用引物SEQ ID. NO :9和SEQ ID. NO 2以及引物SEQ ID.N0:1和SEQ ID.N0:10在Pfx DNA聚合酶的作用下分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以兩段PCR產(chǎn)物為模板，以SEQ ID. NO :9和SEQ ID. NO : 10為引物，進(jìn)行第二次PCR融合，獲得編碼含有E67S定點(diǎn)突變NS2蛋白的NS基因片段；以PBD-PR8NS重組質(zhì)粒為模板，分別用引物SEQ ID. NO :9和SEQ ID. NO 4以及SEQID. NO :3和引物SEQ ID.N0:10在Pfx DNA聚合酶的作用下分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以兩段PCR產(chǎn)物為模板，以SEQ ID. NO :9和SEQ ID. NO : 10為引物，進(jìn)行第二次PCR融合，獲得編碼含有E74S定點(diǎn)突變NS2蛋白的NS基因片段；以上述的編碼含有E67S定點(diǎn)突變NS2蛋白的NS基因片段模板，分別用引物SEQID. NO 9 和 SEQ ID. NO 4 以及引物 SEQ ID. NO 3 和 SEQ ID. NO :10 在 Pfx DNA 聚合酶的作用下分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增;以兩段PCR產(chǎn)物為模板，以SEQ ID. NO :9和SEQ ID.N0:10為引物，進(jìn)行第二次PCR融合，獲得編碼同時(shí)含有E74S和E74S定點(diǎn)突變NS2蛋白的NS基因片段。3、HA和NA基因的PCR擴(kuò)增HA和NA基因來(lái)源于不同亞型的流感病毒(HxNy，代表H1N1、H3N2、H4N2、H5N1、H6N4、H7N7、H9N2、H10N8亞型流感病毒)。除H7N7亞型流感外，其他病毒用Trizol (Invitrogen)抽提總 RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TakaRa),根據(jù)其說(shuō)明書(shū)，用12bp引物5' -AGCAAAAGCAGG-3'(表I)為特異性引物，合成cDNA第一鏈。以獲得的cDNA的第一鏈為模板，用 BSPQI-HA-forward、BSPQI-HA-reverse 和 BSPQI-NA-forward、BSPQI-NA-reverse為上下游引物(含有BspQI酶切位點(diǎn)，如表1)，分別擴(kuò)增出片段的!1謂1、!13吧、!14吧、冊(cè)財(cái)、H9N2、H10N8 亞型流感病毒的 HA 和 H1N1、H3N2、H4N2、H5N1、H6N4、H9N2、H10N8 亞型流感病毒的NA基因。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 V預(yù)變性5min，進(jìn)入以下循環(huán)，94°C變性45s，53 V退火45s，72°C延伸lmin45s，運(yùn)行30個(gè)循環(huán)，最后再72°C延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物在
I.O %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳驗(yàn)證。
抽提獲得H5N1亞型流感病毒HA基因后，用突變H5HA堿性裂解位點(diǎn)的下游引物H5_reverse和BSPQI-HA-forward、突變堿性裂解位點(diǎn)的上游引物H5_forward和BSPQI-HA-reverse 分別進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，再用 BSPQI-HA-forward、BSPQI-HA_reverse 引物進(jìn)行融合PCR。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，進(jìn)入以下循環(huán)，94°C變性45s，53 °C退火45s，72°C延伸lmin45s， 運(yùn)行30個(gè)循環(huán)，最后再72°C延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物在I. 0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳驗(yàn)證。獲得含有低致病性禽流感毒株堿性裂解位點(diǎn)的H5的HA基因。在本研究中人工合成了 H7N7流感病毒的NA基因和含有低致病性禽流感毒株堿性裂解位點(diǎn)的 HA 基因，并用 BSPQI-HA-forward、BSPQI-HA-reverse 和 BSPQI-NA-forward、BSPQI-NA-reverse為上下游引物(含有BspQI酶切位點(diǎn)，如表I)，分別進(jìn)行了 PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，進(jìn)入以下循環(huán)，94°C變性45s，53°C退火45s，72°C延伸lmin45s，運(yùn)行30個(gè)循環(huán)，最后再72°C延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳驗(yàn)證。4、PCR產(chǎn)物的割膠回收電泳結(jié)束后在紫外光下從凝膠上切下目的DNA片段的瓊脂糖凝膠，用DNA快速回收試劑盒回收DNA。具體方法如下在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，放入一無(wú)菌的L 5ml的EP管中，加入3倍凝膠體積(IOOmg = IOOul體積)的Buffer DE-A(凝膠液)，混合均勻后于75°C加熱，間斷混合(2-3min)，直至凝膠塊完全熔化(約6_8min)。加入O. 5個(gè)Buffer DE-A體積的Buffer DE-B (結(jié)合液)，混合均勻；當(dāng)回收的DNA片段小于400bp時(shí),加入I個(gè)凝膠體積的異丙醇。將混合液轉(zhuǎn)移到DNA制備管中，12000Xg離心Imin,倒掉收集管中的廢液。將制備管置回收集管中，加入500ul Buffer Wl (洗滌液)，12000 X g離心30s，棄掉收集管中的廢液。將制備管置回收集管中，加入700ul Buffer W2(去鹽液)，12000Xg離心lmin，棄掉收集管中的廢液，以同樣的方法再洗一次。將制備管置回收集管中，12000\8空離11^11。最后將制備管置于潔凈的I. 5ml EP管中，在制備膜中央加入30ul的去離子水，室溫靜置lmin，12000Xg離心Imin洗脫DNA，置于_20°C保存?zhèn)溆谩?、酶切、連接及轉(zhuǎn)化上述PCR純化產(chǎn)物與PBD載體(ZejunLi，et al. JVI, 2005, 79 (18) :12058-12064)分別用BSPQI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，用膠回收試劑盒回收目的片段與PBD質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物，然后用T4連接酶將酶切后的PCR產(chǎn)物與酶切處理的PBD載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細(xì)胞JM109(上海索萊生物科技有限公司)，無(wú)菌條件下涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37 °C培養(yǎng)8-20h。6、重組質(zhì)粒的鑒定挑取LB固體培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落，放入加有約3ml含Amp的LB液體培養(yǎng)基的試管中，37°C振蕩培養(yǎng)10h。將菌液用堿性抽提法抽提的質(zhì)粒，用PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定，用DNAstar序列分析軟件進(jìn)行序列分析，確定序列正確無(wú)誤。分別如SEQID. NO 20-23所示的核酸序列，或其氨基酸序列為SEQ ID. NO :24_27。此外，各個(gè)亞型的HA和NA基因的序列經(jīng)核實(shí)也是正確的。表1NS2、NP基因的定點(diǎn)突變引物和A型流感病毒通用引物
權(quán)利要求
1.一種PR8重組流感病毒，其特征在于，其含有H6亞型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6個(gè)內(nèi)部基因( 81，？82，？么，冊(cè)^，吧基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突變位點(diǎn)NS基因編碼的NS2蛋白上具有E67S點(diǎn)突變、或E74S點(diǎn)突變、或E67S/E74S點(diǎn)突變，NP基因編碼的NP蛋白上具有G132A點(diǎn)突變。
2.一種制備權(quán)利要求I所述的PR8重組流感病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟 構(gòu)建分別包含H6亞型流感病毒的HA和NA基因的重組質(zhì)粒； 構(gòu)建包含PR8病毒突變基因片段的重組質(zhì)粒，該P(yáng)R8病毒突變基因片段選自下述突變的NS或NP基因片段編碼含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S點(diǎn)突變的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段，編碼含有G132A點(diǎn)突變的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段； 將上述H6亞型流感病毒的HA基因的重組質(zhì)粒和NA基因的重組質(zhì)粒，與上述包含PR8病毒突變基因片段的重組質(zhì)粒、以及分別包含PR8病毒PA、PBU PB2、M、NP或NS內(nèi)部基因的質(zhì)粒按相應(yīng)組合一起轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞； 將培養(yǎng)的細(xì)胞上清接種于雞胚，在孵化器內(nèi)培養(yǎng)合適時(shí)間后，收獲雞胚尿囊液，檢測(cè)該尿囊液的血凝性，如果有血凝活性，并且經(jīng)過(guò)序列分析確定沒(méi)有非預(yù)期突變后，即獲得PR8重組流感病毒。
3.權(quán)利要求I所述的PR8重組流感病毒在制備流感疫苗中的應(yīng)用。
4.一種疫苗，其特征在于，包含權(quán)利要求I所述的PR8重組流感病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種PR8重組流感病毒，該重組流感病毒含有H6亞型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6個(gè)內(nèi)部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突變位點(diǎn)NS基因編碼的NS2蛋白上具有E67S點(diǎn)突變、或E74S點(diǎn)突變、或E67S/E74S點(diǎn)突變，NP基因編碼的NP蛋白上具有G132A點(diǎn)突變。本發(fā)明還公開(kāi)了上述PR8重組流感病毒的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建重組質(zhì)粒、共轉(zhuǎn)染細(xì)胞和SPF雞胚擴(kuò)增得到的PR8重組流感病毒，能高效表達(dá)HA蛋白和/或NA基因，可用于大規(guī)模制備流感疫苗。
文檔編號(hào)C12N15/44GK102839160SQ201210349518
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2011年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月8日
發(fā)明者李澤君, 滕巧泱 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所