專利名稱：一株產(chǎn)葡萄糖氧化酶的基因工程菌及其構(gòu)建與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株產(chǎn)葡萄糖氧化酶的基因工程菌及其構(gòu)建與應(yīng)用，特別是一株誘導(dǎo)表達(dá)葡萄糖氧化酶基因的工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
葡萄糖氧化酶是生物領(lǐng)域中最主要的工具酶之一。自1967年Updike和Hicks將 GOD固定在Clark氧電極表面，將其應(yīng)用于血糖測(cè)定以來，GOD被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥等許多相關(guān)領(lǐng)域。
在食品工業(yè)中，由于氧的存在，引起許多不利于產(chǎn)品質(zhì)量的化學(xué)反應(yīng)，并為許多微生物生長(zhǎng)創(chuàng)造了條件。目前，許多國(guó)家已將GOD作為工人的安全抗氧劑而廣泛應(yīng)用于各種食品和食品加工工藝中。雖然用途多樣，GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成過氧化氫、形成葡萄糖酸四個(gè)方面。利用其專一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析儀，能快速準(zhǔn)確簡(jiǎn)易地測(cè)定各種食品中的葡萄糖含量，指導(dǎo)生產(chǎn)。
在醫(yī)藥工業(yè)中，GOD作為試劑盒、酶電極等用于血清(漿)、尿液及腦脊液中葡萄糖的體外定量分析；G0D制成的酶制劑還可用于除去或緩解牙斑、牙垢和齲齒的形成防止口腔疾病和牙病的發(fā)生。此外，由于可以催化生成H2O2，還可用于對(duì)H2O2敏感的淋巴瘤的導(dǎo)向目標(biāo)的治療。
GOD還是一種新型的酶飼料添加劑，能夠改善動(dòng)物腸道環(huán)境，調(diào)節(jié)飼糧消化，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。含葡萄糖氧化酶、乳酸過氧化物和乳鐵蛋白的混合飼料添加劑，可用于預(yù)防牲畜胃腸道感染、腹瀉，并有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)作用。
從動(dòng)植物組織中提取GOD有一定的局限，酶量亦不豐富；細(xì)菌GOD產(chǎn)酶量少；一般采用黑曲霉(具有GRAS資格)和青霉屬菌株作為GOD生產(chǎn)菌。我國(guó)及美國(guó)均采用點(diǎn)青霉及產(chǎn)黃青霉生產(chǎn)G0D,日本常用尼崎青霉,俄羅斯用生機(jī)青霉,近年報(bào)道膠霉屬(Clioctadium)、 擬青霉 屬(Paecilomyces)和帚霉屬(Scopulariopsis)也能生產(chǎn)G0D。
產(chǎn)量低、酶活低、檢測(cè)方法復(fù)雜是GOD產(chǎn)業(yè)化的限制性因素，國(guó)內(nèi)外為此做了大量工作并取得了明顯進(jìn)展。目前國(guó)外生產(chǎn)的GOD廠家主要是德國(guó)的Boehringer和日本的 TOYOBO0規(guī)?；a(chǎn)高活性的GOD還有困難。發(fā)酵生產(chǎn)GOD的同時(shí)產(chǎn)生大量雜蛋白，分離提取復(fù)雜，成本聞。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株產(chǎn)葡萄糖氧化酶的基因工程菌，已于2012年7月I日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國(guó)武漢、武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2012266，分類學(xué)命名為巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115-pPIC9K_G0D。
本發(fā)明還提供了一株產(chǎn)葡萄糖氧化酶基因工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟
I)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏的黑曲霉CCTCC NO M2011291的基因?yàn)槟０嬖O(shè)計(jì)引物， 獲得GOD基因；
2)將GOD基因連接到畢氏酵母表達(dá)載體PPIC9K，得到重組質(zhì)粒pPIC9K_G0D ；
3)重組載體轉(zhuǎn)化 Pichia pastoris GS115。
葡萄糖氧化酶酶活測(cè)定方法G0D活性測(cè)定一般采用鄰-聯(lián)(二)茴香胺分光光度法。在有氧條件下，GOD催化葡萄糖脫氫產(chǎn)生H2O2，在過氧化物酶(POD)作用下，氧供體鄰-聯(lián)(二)茴香胺(DH2)被氧化成棕色產(chǎn)物。測(cè)540nm處吸光度的變化，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果，計(jì)算葡萄糖氧化酶活力單位。
本發(fā)明的有益效果該菌株表達(dá)的葡萄糖氧化酶在搖瓶中的酶活為52U/mL，比野生菌的酶活提高了近24倍，大大降低了生產(chǎn)成本，這為葡萄糖氧化酶的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。
生物材料保藏
一株產(chǎn)葡萄糖氧化酶的基因工程菌，該菌株為巴斯德畢赤酵母，命名為Pichia pastorisGS115-pPIC9K-G0D,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO M2012266，保藏日期為2012年7月I日。


圖1 :搖瓶中不同甲醇誘導(dǎo)濃度下的隨時(shí) 間產(chǎn)葡萄糖氧化酶的能力。
圖3 :重組GOD的最適溫度及溫度穩(wěn)定性。
圖3 :重組GOD的最適pH及pH穩(wěn)定性。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1重組菌的構(gòu)建及鑒定
根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏的黑曲霉CCTCC NO M2011291的基因?yàn)槟０嬖O(shè)計(jì)引物，獲得GOD基因，用限制性內(nèi)切酶SnaB I和Not I雙酶切消化純化后的GOD基因和載體pPIC9K， 用T4DNA連接酶于16°C過夜連接，連接產(chǎn)物用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化宿主菌JM109，轉(zhuǎn)化菌液涂布在含有卡那霉素(30mg/mL)的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)，以GOD-F和GOD-R為引物進(jìn)行菌落PCR的方法鑒定陽性克隆子，最終獲得含有GOD基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-G0D，用雙酶切進(jìn)行驗(yàn)證。
將重組質(zhì)粒pPIC9K-G0D電擊轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GS115感受態(tài)細(xì)胞，得到基因工程菌，并經(jīng)過鑒定命名為Pichia pastoris GS115_pPIC9K_G0D。
畢赤酵母的轉(zhuǎn)化采用電轉(zhuǎn)化法GS115于500mL YPD中培養(yǎng)至0D_=1. 2-1. 5， 1500g離心收集細(xì)胞；依次用400mL冰冷的無菌水洗兩次細(xì)胞，再用40mL冰冷的lmol/L山梨醇洗一次細(xì)胞，重懸細(xì)胞于ImL lmol/L山梨醇。100 μ L原生質(zhì)體與5_10 μ g線性化質(zhì)粒 DNA (Bgl II切)混合，轉(zhuǎn)入冰冷的電轉(zhuǎn)杯，放置5分鐘；電擊細(xì)胞與DNA的混合物(1. 5kv, 4. 2-4. 9ms);加入ImL冰冷的lmol/L山梨醇，繼續(xù)放置30min ;再加入0. 5mL SOS, 30° C放置2小時(shí)，偶爾搖動(dòng)志菌體不易沉淀；用lmol/L山梨醇稀釋菌體后涂布于固體MD培養(yǎng)基。 30° C培養(yǎng)4-6天后挑取單克隆。
實(shí)施例2重組菌的酶活測(cè)定和蛋白電泳
以實(shí)施例1獲得的酵母工程菌為生產(chǎn)菌株，活化后，將30°C、200rpm下培養(yǎng)到0D_ 在1. 6-1. 7之間的種子以2%的接種量轉(zhuǎn)入基本發(fā)酵培養(yǎng)基，于30°C、200rpm條件下培養(yǎng)；當(dāng)OD值為1. 2-1. 5時(shí)，將酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)蛋白的產(chǎn)生。
培養(yǎng)基種子和斜面培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g ;斜面培養(yǎng)基添加瓊脂20g ;基本發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY培養(yǎng)基(1L):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB 13. 4g，IOOmM磷酸緩沖液(pH 6. O);誘導(dǎo)培養(yǎng)基為BMMY培養(yǎng)基(1L):胰蛋白胨20g，酵母抽提物IOg,甲醇8mL，YNB 13. 4g，IOOmM磷酸緩沖液(pH 6.0)；
通過蛋白電泳(SDS-PAGE)得到一條分子量大小約為68kDa的蛋白條帶，同時(shí)在搖瓶中驗(yàn)證不同甲醇誘導(dǎo)濃度下的隨時(shí)間產(chǎn)葡萄糖氧化酶的能力，最高酶活為52U/mL比野生菌的酶活(2. 2U/mL)提高了近24倍(圖1)。
實(shí)施例3重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì)研究
測(cè)定了重組GOD葡萄糖氧化酶在不同溫度下的酶活性和在20-80° C梯度溫度下的熱穩(wěn)定性。結(jié)果表明，重組GOD的最適溫度為40° C，在20-60° C下均具有良好的熱穩(wěn)定性，重組GOD在60 ° C下保溫3h，酶活仍可達(dá)80%，40 ° C下保溫3h，酶活殘留98%以上， 超過80° C后，酶活性損失嚴(yán)重(圖2)。
P H主要通過改變酶的空間結(jié)構(gòu)，影響酶分子活性中心基團(tuán)的解離而影響酶的活性。重組GOD葡萄糖氧化酶分別在其最適溫度下、pH2. 0-10. O的緩沖體系中測(cè)定活性，以確定其最適pH。結(jié)果表明重組GOD的最適pH為6. O。同時(shí)，將重組GOD在pH2. 0-10. O的緩沖體系中40° C保溫24h后，在pH6. O下測(cè)定殘留酶活，重組GOD的pH穩(wěn)定范圍均為 4. 0-8. 0，在此pH范圍內(nèi)保溫24h，酶活基本保持在90%以上，pH小于4. O或大于8. O時(shí)，酶穩(wěn)定性急劇下降(圖3)。
可以理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附的權(quán)利要求的保護(hù)范圍。·
權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)葡萄糖氧化酶的基因工程菌，于2012年7月I日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO M 2012266。
2.權(quán)利要求1所述基因工程菌，其特征在于可誘導(dǎo)表達(dá)外源葡萄糖氧化酶。
3.—種權(quán)利要求1所述基因工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟1)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏的黑曲霉CCTCCNO M2011291的基因?yàn)槟０嬖O(shè)計(jì)引物，獲得 GOD基因；2)將葡萄糖氧化酶基因連接到畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9K，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-G0D；3)重組載體轉(zhuǎn)化Pichiapastoris GS115得到基因工程菌CCTCC NO M 2012266。
4.權(quán)利要求1所述菌株生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于以權(quán)利要求1所述酵母工程菌為生產(chǎn)菌株，活化后，將30°C、200rpm下培養(yǎng)到OD6tltl在1. 6-1. 7之間的種子以2% 的接種量轉(zhuǎn)入基本發(fā)酵培養(yǎng)基，于30°C、200rpm條件下培養(yǎng)；當(dāng)( 值為1. 2-1. 5時(shí)，將酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)蛋白的產(chǎn)生；種子培養(yǎng)基采用YPD培養(yǎng)基；；基本發(fā)酵培養(yǎng)基采用BMGY培養(yǎng)基；誘導(dǎo)培養(yǎng)基為BMMY 培養(yǎng)基中添加O. 8%的甲醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)葡萄糖氧化酶的基因工程菌及其建方法與應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用重組DNA技術(shù)將黑曲霉葡萄糖氧化酶(GOD)基因克隆連接到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K，并轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GS115，經(jīng)篩選鑒定得到一株可以產(chǎn)較高活性葡萄糖氧化酶的重組畢赤酵母Pichia pastoris GS115-pPIC9K-GOD，保藏編號(hào)為CCTCC NOM2012266。該菌株表達(dá)的葡萄糖氧化酶在搖瓶中的酶活為52U/mL，比野生菌的酶活提高了近24倍，為葡萄糖氧化酶的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N9/04GK102994406SQ201210349289
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者陳堅(jiān), 顧磊, 張娟, 堵國(guó)成, 沈依娜, 李夢(mèng)潔, 李婷, 王丹, 丁雪, 殷政 申請(qǐng)人:江南大學(xué)