一株多環(huán)芳烴降解菌及其降解基因的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一株多環(huán)芳烴降解菌及其降解基因的應(yīng)用，涉及環(huán)境污染物生物處理。所述多環(huán)芳烴降解菌為印度洋速生桿菌（Celeribacter?indica）P73，保藏編號為CGMCC?No.1.12539。所述印度洋速生桿菌（Celeribacter?indica）P73可用于制備含多環(huán)芳烴廢水生物處理劑，也可用于受含多環(huán)芳烴污染環(huán)境的修復(fù)。通過對印度洋速生桿菌（Celeribacter?indica）P73基因組的測序發(fā)現(xiàn)該菌含有很多與石油烴或多環(huán)芳烴降解相關(guān)的基因。這些基因在該菌降解石油烴或多環(huán)芳烴過程中發(fā)揮重要作用。
【專利說明】一株多環(huán)芳烴降解菌及其降解基因的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及環(huán)境污染物生物處理，尤其是涉及一株多環(huán)芳烴降解菌及其降解基因的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]多環(huán)芳經(jīng)(PolycyclicAromatic Hydrocarbons,PAHs)是一類含有一個苯環(huán)以上的芳香化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，疏水性強，不易降解，包括萘、菲、熒蒽等在內(nèi)，有200多種。PAHs具有高毒性，有很強的“三致”作用，即:致癌、致畸和致突變作用。PAHs是環(huán)境致癌化學(xué)物質(zhì)中最大的一類，其中，苯并[α ]芘和苯并[α ]蒽等是危害最大的，苯并[α ]芘是第一個被發(fā)現(xiàn)的環(huán)境化學(xué)致癌物，被國際癌癥研究機構(gòu)指定為一級致癌物質(zhì)，已列為國內(nèi)外環(huán)境監(jiān)測的常規(guī)項目之一。PAHs已受到各國環(huán)境保護組織的重視，美國環(huán)境保護署將16種未帶取代基的PAHs列入了優(yōu)先治理的污染物黑名單。
[0003]大氣中的大部分PAHs來源于煤和石油的不完全燃燒，而陸地環(huán)境中則主要來源于固體廢物、工業(yè)漏滲和大氣沉降。海洋環(huán)境主要PAHs來源是海底原油滲漏、海上運輸、油井滲漏、油輪事故等。PAHs是石油中除烷烴以外的主要組分。全世界平均每天開采出7000萬加侖石油，其中有一半需要通過海洋來運輸，在石油的生產(chǎn)運輸過程中不可避免地會發(fā)生油井自然滲漏、海上運輸泄漏等。更為嚴(yán)重的是由于油輪事故導(dǎo)致的大范圍污染，污染物中易揮發(fā)的成分通過蒸發(fā)進入大氣中，難溶解難揮發(fā)的成分少數(shù)可以通過光氧化等途徑降解，而多數(shù)則通過黏附于海洋沉積物經(jīng)年累月地在海洋中積累，PAHs就屬于后者。殘留在海洋中的PAHs可能會在海洋生物體內(nèi)富集從而毒害海洋生物。更甚的是，這種難降解的化合物可能會經(jīng)過食物鏈累積作用直接影響到人類健康(王桂山，仲兆慶.PAH(多環(huán)芳烴)的危害及產(chǎn)生的途徑[J].山東環(huán)境，2001，2):41-41)。
[0004]環(huán)境中的PAHs可以通過多種方式去除，包括自然揮發(fā)、光降解、化學(xué)降解、生物降解、顆粒吸附等，微生物轉(zhuǎn)化與降解被認(rèn)為是環(huán)境中PAHs去除最為徹底有效的方式。目前，已知的環(huán)境中PAHs降解微生物有許多，包括細(xì)菌、放線菌、真菌、藻類等。PAHs的細(xì)菌降解已有廣泛的研究，許多細(xì)菌被分離鑒定為PAH s降解菌，這些菌株主要包括Pseudomonas、Sphingomonas、Cyc1clastiCUs、BurkhoIderia、Rhodococcus、PoIaromonas、Neptunomonas、JanibacterΛ Nocardia、Bacillus、Mycobacterium 等屬(CERNIGLIA CE.Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons[J].Current opinion inbiotechnology，1993，4(3):331-338;張志家，金袓亮，竺乃愷，et al.強致突變物二硝基苯并(a)芘的合成，結(jié)構(gòu)與致突變性研究[J].化學(xué)學(xué)報，1990，1014.；GIBS0N DT，MAHADEVAN V, JERINA D M，et al.0xidation of thecarcinogens benzo[a]pyrene andbenzo[a]anthracene to dihydrodiols by a bacterium[J].Science, 1975，189(4199):295-297)。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的在于提供一株多環(huán)芳烴降解菌及其降解基因的應(yīng)用。
[0006]所述多環(huán)芳烴降解菌為印度洋速生桿菌(Celeribacter indica) P73,該菌已于2013年06月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101 ;保藏中心登記入冊編號為CGMCCN0.1.12539。所述印度洋速生桿菌(Celeribacter indica)P73來源于西南印度洋的深海沉積物，經(jīng)人工富集培養(yǎng)、分離純化得到。經(jīng)生理、生化、形態(tài)鑒定和16S rRNA基因序列分析等，證實該菌為革蘭氏染色陰性的速生桿菌屬(Celeribacter)的新菌株P(guān)73,命名為印度洋速生桿菌(Celeribacter indica)P73。菌株16S rDNA序列的GenBank登入號為 EU440950。
[0007]所述印度洋速生桿菌(Celeribacter indica) P73可用于制備含多環(huán)芳烴廢水生物處理劑，也可用于受含多環(huán)芳烴污染環(huán)境的修復(fù)。印度洋速生桿菌(Celeribacterindica) P73為革蘭氏陰性細(xì)菌，其生物學(xué)特性為觸酶陽性，氧化酶陽性，非發(fā)酵型，專性需氧，菌體形態(tài)為呈卵桿狀，菌體大小為1.2~1.3μηι長,0.6~0.7μηι寬,菌落呈白色不透明，邊緣規(guī)則，表面光滑，有暈環(huán)，直徑3~4mm。該菌的最適生長條件為:pH=6.5~8.5，溫度 28 ~37°C，NaCl 濃度 2% ~7%。該菌的主要脂肪酸為 Sum In Feature8 (C18:1 ω 7c/ω 6c)(58.6%)、C19:0 ω 8ccyclo (17.4%)和 C16:0 (7.9%)，G+C 含量為 64.5mol%。
[0008]印度洋速生桿菌(Celeribacter indica) P73對下列抗生素敏感:氨卞青霉素(10μ g)、羧卞青霉素(100μ g)、先鋒霉素4 (30 μ g)、先鋒霉素5 (30yg)、先鋒必素(30 μ g)、先鋒霉6 (30μ g)、氯霉素(30 μ g)、環(huán)丙沙星(5 μ g)、紅霉素(15 μ g)、利福平(5“8)、慶大霉素(1(^8)、卡那霉素(3(^8)、米諾四環(huán)素(3(^8)、新霉素(1(^8)、氟哌酸(10 μ g)、氧氟沙星(5 μ g)、青霉素G (10呢)、氧哌嗪青霉素(10(^8)、多粘菌素8(30U)、頭孢三嗪(30μ g)、鏈霉素(10μ g)、四環(huán)素(30μ g)、萬古霉素(30μ g)和強力霉素(30yg);對氯潔霉素(2yg)、呋喃唑酮(15yg)、復(fù)方新諾明(25yg)、林可霉素(2yg)、甲硝唑(5 μ g)和苯唑青霉素(I μ g)不敏感。
[0009]印度洋速生桿菌(Celeribacter indica) P73能很好地利用吐溫80,溴丁二酸，L-脯氨酸，L-丙氨酸，D-丙氨酸，琥珀酸，D-阿拉伯醇，D-纖維二糖，D-果糖，a -D-葡萄糖，D-海藻糖，麥芽糖，D-甘露醇，L-鼠李糖，D-山梨醇，蔗糖，松二糖，丙酮酸甲酯，單甲基琥珀酸，順-烏頭酸(丙烯三羧酸))，羥基丁酸，α-酮戊二酸，D，L-乳酸，丙酸，奎尼酸；并可微弱地利用吐溫40，乙酸，糊精，α-羥基丁酸，α-酮丁酸，琥珀酰胺酸，次黃嘌呤核苷，尿嘧啶核苷，胸腺嘧啶核苷，丙三醇。
[0010]上述生理生化特性和16S rDNA序列與對應(yīng)模式菌株比較分析結(jié)果表明，印度洋速生桿菌(Celeribacter indica) P73是速生桿菌屬(Celeribacter)的一個新菌種。
[0011]印度洋速生桿菌(Celeribacter indica) P73能夠利用混合PAHs、聯(lián)苯、萘、2_甲基萘、2，6-二甲基萘、苊、蒽、菲、二苯并噻吩、二苯并呋喃、芴、4-甲基二苯并噻吩和熒蒽等多環(huán)芳烴以及柴油作為唯一能源和碳源生長繁殖，該菌在15天能將人工海水培養(yǎng)基中的聯(lián)苯、萘、2-甲基萘、2，6-二甲基萘、苊、蒽、菲、二苯并噻吩、二苯并呋喃、芴、4-甲基二苯并噻吩和熒蒽分別降解 88.8%,27.3%,75.2%,78.9%,73.4%,76.0%、92.2%,93.7%,95.3%、42.9%,97.0%和20.0%。印度洋速生桿菌(Celeribacter indica) P73可用于多環(huán)芳烴、柴油和原油的降解。[0012]通過對印度洋速生桿菌(Celeribacter indica) P73基因組的測序發(fā)現(xiàn)該菌含有很多與石油烴或多環(huán)芳烴降解相關(guān)的基因。這些基因在該菌降解石油烴或多環(huán)芳烴過程中發(fā)揮重要作用?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0013]圖1為印度洋速生桿菌(Celeribacter indica) P73在原油柴油(1:1)中的生長情況。在圖1中，左:無菌對照；右:菌株P(guān)73降解原油柴油(I: I)。
[0014]圖2為印度洋速生桿菌(Celeribacter indica) P73對各種碳源的降解率。在圖2中，橫坐標(biāo)為碳源，縱坐標(biāo)為降解率。
【具體實施方式】
[0015]下面通過實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的描述，但并不因此將本發(fā)明限制在以下實施例范圍之中。以下實施例中采用的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0016]實施例1:印度洋速生桿菌(Celeribacter indica) P73的分離與降解原油柴油(I: I)的性能
[0017]現(xiàn)場采集西南印度洋的深海沉積物，采用IOOmL海水培養(yǎng)基加入PAHs(萘、菲、蒽、芘)作為碳源和能源進行靜置富集培養(yǎng)。2個月后在實驗室將富集物轉(zhuǎn)接，并將最終的富集物梯度稀釋、涂布216L平板，分離純化單菌得到菌株P(guān)73。菌株P(guān)73經(jīng)過接種至液體培養(yǎng)基中驗證其降解多環(huán)芳烴、PAHs的能力，發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)73是I株具有PAHs降解譜很廣降解能力很強的菌株，該菌經(jīng)16S rDNA鑒定為速生桿菌屬(Celeribacter)。216L培養(yǎng)基成分:乙酸鈉lg/L，硝酸銨0.2g/L，檸檬酸鈉0.5g/L，普通肉湯培養(yǎng)基0.5g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉2g/L，瓊脂粉15g/L，調(diào)pH7.5，121°C高壓蒸汽滅菌20min。海水培養(yǎng)基成分:取大洋表層海水用121 °C高壓蒸汽滅菌20min后，補加1%體積已滅菌的KH2PO4溶液(10g/L，pH6.7)及
0.1% 體積 0.22 μ m 濾膜除菌的 FeSO4 (0.4g/L)。
[0018]將印度洋速生桿菌(Celeribacter indica) P73接種至含原油柴油(1:1)的海水培養(yǎng)基中，在180r/min、28°C搖床中培養(yǎng)14天后(圖1)，觀察該菌對于原油柴油(I: I)的降解能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該菌能夠降解原油柴油(I: I )，培養(yǎng)基變色為橙色，且培養(yǎng)基有渾濁(圖1右)。
[0019]實施例2:印度洋速生桿菌(Celeribacter indica)P73對多環(huán)芳烴的降解性能測
定
[0020]將印度洋速生桿菌(Celeribacter indica) P73接種至不同碳源(聯(lián)苯、萘、2_甲基萘、2，6- 二甲基萘、苊、蒽、菲、二苯并噻吩、二苯并呋喃、芴、4-甲基二苯并噻吩、熒蒽、屈和芘)的海水培養(yǎng)基中，同時設(shè)置底空白對照(只加碳源不加菌)，在180r/min、28°C搖床中培養(yǎng)15天后觀察菌株的生長狀況，并測定該菌對各底物的降解率。結(jié)果表明，該菌株能夠利用聯(lián)苯、萘、2-甲基萘、2，6- 二甲基萘、苊、蒽、菲、二苯并噻吩、二苯并呋喃、芴、4-甲基二苯并噻吩和熒蒽，降解率分別為 88.8%,27.3%,75.2%,78.9%,73.4%,76.0%、92.2%,93.7%、95.3%,42.9%,97.0% 和 20.0% (參見圖 2)。
[0021]實施例3:印度洋速生桿菌(Celeribacter indica)P73的石油烴和芳香烴降解相關(guān)基因的應(yīng)用[0022]表1菌株P(guān)73烴類降解關(guān)鍵基因
[0023]
【權(quán)利要求】
1.一株多環(huán)芳烴降解菌，其特征在于為印度洋速生桿菌(Celeribacter indica) P73,該菌已于2013年06月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏中心登記入冊編號為CGMCC N0.1.12539。
2.如權(quán)利要求1所述一株多環(huán)芳烴降解菌在制備含多環(huán)芳烴廢水生物處理劑中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1所 述一株多環(huán)芳烴降解菌在修復(fù)受含多環(huán)芳烴污染環(huán)境中的應(yīng)用。
【文檔編號】C02F3/34GK103540551SQ201310518343
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】邵宗澤, 賴其良, 曹軍偉, 袁軍 申請人:國家海洋局第三海洋研究所