功能性流感病毒樣顆粒(vlp)的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及功能性流感病毒樣顆粒(VLP)。本發(fā)明公開(kāi)并要求保護(hù)病毒樣顆粒(VLP)，這些VLP表達(dá)和/或含有季候性流感病毒蛋白、禽流感病毒蛋白和/或來(lái)自具有大流行潛力的病毒的流感蛋白。本發(fā)明包括包含所述蛋白的載體構(gòu)建體、包含所述構(gòu)建體的細(xì)胞、包含本發(fā)明VLP的制劑和疫苗。本發(fā)明還包含制備VLP和對(duì)脊椎動(dòng)物施用VLP的方法，包括誘發(fā)針對(duì)季候性流感和禽流感，或它們的至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】功能性流感病毒樣顆粒(VLP)
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2006年10月18日、中國(guó)申請(qǐng)?zhí)枮?00680045850.7、發(fā)明名稱(chēng)
為“功能性流感病毒樣顆粒(VLP) ”的發(fā)明申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。。
[0002]本申請(qǐng)要求下列申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán):2005年10月18日提交的臨時(shí)申請(qǐng)60/727，513 ；2006年5月10日提交的臨時(shí)申請(qǐng)60/780，847 ；2006年5月15日提交的臨時(shí)申請(qǐng)60/800,006 ;2006年7月17日提交的臨時(shí)申請(qǐng)60/831，196 ;2006年7月21日提交的臨時(shí)申請(qǐng)60/832，116 ;和2006年9月19日提交的臨時(shí)申請(qǐng)60/845，495 ;本文引證收錄上述申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容用于所有目的。
[0003]發(fā)明背景
[0004]流感病毒是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的成員(綜述見(jiàn)Murphy andWebster, 1996)。流感病毒有三個(gè)亞型，稱(chēng)為A、B和C。流感病毒體含有分段的負(fù)義RNA基因組。流感病毒體包括下述蛋白:血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、基質(zhì)(Ml)、質(zhì)子離子通道蛋白(M2)、核蛋白(NP)、聚合酶堿性蛋白I (PBl)、聚合酶堿性蛋白2(PB2)、聚合酶酸性蛋白(PA)、和非結(jié)構(gòu)蛋白2 (NS2)蛋白。通、嫩、11和112是膜相關(guān)的，而咿、？81、？82、？4和吧2是核殼相關(guān)蛋白。NSl是不與病毒體顆粒結(jié)合而是特異于流感病毒感染細(xì)胞的唯一非結(jié)構(gòu)蛋白。Ml蛋白是流感病毒顆粒中最豐富的蛋白。HA和NA蛋白是包膜糖蛋白，負(fù)責(zé)病毒附著和病毒顆粒侵入細(xì)胞，是病毒中和和保護(hù)性免疫所用的主要免疫顯性表位的來(lái)源。HA和NA蛋白都被認(rèn)為是預(yù)防性流感疫苗最重要的組分。
[0005]流 感病毒感染通過(guò)病毒體表面HA蛋白附著于含唾液酸細(xì)胞受體(糖蛋白和糖脂)而被引發(fā)。NA蛋白介導(dǎo)唾液酸受體的加工，且病毒對(duì)細(xì)胞的侵入依賴(lài)于HA依賴(lài)性受體介導(dǎo)的胞吞作用。在內(nèi)化的含流感病毒體的內(nèi)體的酸性境界中，HA蛋白經(jīng)歷構(gòu)象變化，導(dǎo)致病毒和宿主細(xì)胞膜融合，隨后病毒脫殼，Ml蛋白在M2的介導(dǎo)下從核殼相關(guān)核糖核蛋白(RNP)釋放,進(jìn)入細(xì)胞核以進(jìn)行病毒RNA合成。針對(duì)HA分子的抗體可以通過(guò)中和病毒感染性來(lái)預(yù)防病毒感染，而針對(duì)NA蛋白的抗體介導(dǎo)它們對(duì)病毒復(fù)制早期步驟的作用。
[0006]目前得到許可的滅活甲型和乙型流感病毒疫苗是作為供非消化道施用的三價(jià)疫苗。這些三價(jià)疫苗是在含胚雞卵尿囊腔中作為單價(jià)的總物料產(chǎn)生，通過(guò)速率區(qū)帶離心或柱層析純化，用福爾馬林或丙內(nèi)酯滅活，然后配制成特定年份人群中流行的兩株甲型和乙型流感病毒株的混合物?，F(xiàn)有的商品化流感疫苗是全病毒(WV)或亞病毒體(SV，裂解或純化的表面抗原(split or purified surface antigen))病毒疫苗。WV疫苗含有完整的滅活病毒體。用諸如磷酸三正丁酯等溶劑處理過(guò)的SV疫苗(Flu-Shield, Wyeth-Lederle)含有幾乎所有的病毒結(jié)構(gòu)蛋白和一些病毒包膜。用Triton X-100溶解的SV疫苗(Fluzone，Sanof 1-Aventis; Fluvirin, Novartis)主要含有HA單體、NA和NP的聚集物，盡管存在殘余量的其它病毒結(jié)構(gòu)蛋白。最近FDA對(duì)一種活的減毒冷適應(yīng)病毒疫苗(FluMist，MedImmune)授予了銷(xiāo)售許可，批準(zhǔn)其作為鼻內(nèi)投遞疫苗用于在5-17歲的健康兒童和青年及18-49歲的健康成人中針對(duì)甲型及乙型流感病毒所引起的疾病的自動(dòng)免疫接種和預(yù)防的商業(yè)應(yīng)用。
[0007]已經(jīng)開(kāi)發(fā)了數(shù)種重組產(chǎn)品作為候選的重組流感疫苗。這些手段均著眼于甲型流感病毒HA和NA蛋白的表達(dá)、生產(chǎn)和純化，包括使用桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞(Crawford et al, 1999; Johansson, 1999; Treanor et al., 1996),病毒載體(Pushko etal., 1997;Berglund et al.，1999),和 DNA 疫苗構(gòu)建體(Olsen et al.，1997)表達(dá)這些蛋白。
[0008]Crawford et al.(1999)證明桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的流感HA能夠預(yù)防由H5和H7禽流感亞型引起的致死性流感疾病。同時(shí)，另一個(gè)小組證明桿狀病毒表達(dá)的流感HA和NA蛋白在動(dòng)物中誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答優(yōu)于一種常規(guī)疫苗所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答(Johanssonet al.，1999)。將桿狀病毒表達(dá)的馬流感病毒血凝素的免疫原性和效力與一種同源DNA疫苗候選物進(jìn)行了比較(Olsen et al.，1997)?？傊@些數(shù)據(jù)證明，使用各種實(shí)驗(yàn)手段，在不同的動(dòng)物模型中，用重組HA或NA蛋白均可誘導(dǎo)出針對(duì)流感病毒攻擊的高度保護(hù)。
[0009]Lakey等人(1996)顯示，在一項(xiàng)I期劑量升高安全性研究中，源自桿狀病毒的流感HA疫苗在人志愿者中得到了良好的耐受并且具有免疫原性。然而，在數(shù)個(gè)臨床點(diǎn)用數(shù)個(gè)劑量的由HA和/或NA蛋白組成的流感疫苗接種人志愿者進(jìn)行第二期研究，結(jié)果表明重組亞單位蛋白疫苗沒(méi)有引發(fā)保護(hù)性免疫[G.Smith, Protein Sciences ;M.Perdue, USDA, Personal Communications]。這些結(jié)果表明，感染性病毒體HA和NA包膜粒(peplomer)表面上展示的構(gòu)象表位在中和性抗體和保護(hù)性免疫的引發(fā)中是重要的。
[0010]關(guān)于在重組流感疫苗候選物中包含其它流感蛋白的問(wèn)題，已經(jīng)進(jìn)行了若干研究，包括涉及流感核蛋白NP (單獨(dú)地或者與Ml蛋白組合地)的實(shí)驗(yàn)(Ulmer et al., 1993;Ulmeret al., 1998;Zhou et al., 1995;Tsui et al.，1998)。這些由近似不變的內(nèi)部病毒體蛋白構(gòu)成的疫苗候選物可引發(fā)廣譜的免疫力，主要是細(xì)胞免疫(⑶4+和⑶8+記憶T細(xì)胞)。這些實(shí)驗(yàn)涉及使用DNA或病毒基因載體。需要相對(duì)大量的注射DNA，因?yàn)槭褂幂^低劑量DNA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示很少或沒(méi)有保護(hù)作用(Chen et al.，1998)。因此，需要進(jìn)一步的臨床前和臨床研究來(lái)評(píng)估此類(lèi)涉及流感NP和Ml的基于DNA的手段是否安全、有效和持久。
[0011]最近，為了嘗試開(kāi)發(fā)更有效的流感疫苗，使用了顆粒蛋白作為流感M2蛋白表位的載體。開(kāi)發(fā)基于M2的 疫苗的理論根據(jù)是在動(dòng)物研究中M2蛋白引發(fā)了針對(duì)流感的保護(hù)性免疫(Slepushkin et al., 1995)。Neirynck et al.(1999)使用一種 23 個(gè)氨基酸長(zhǎng)的 M2跨膜域作為與乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的氨基末端融合配偶體，以將M2表位暴露在HBcAg殼體樣顆粒的表面上。然而，盡管全長(zhǎng)M2蛋白和M2-HBcAg VLP在小鼠中均誘導(dǎo)可檢測(cè)的抗體和保護(hù)作用，將來(lái)的流感疫苗不大可能僅僅基于M2蛋白，因?yàn)镸2蛋白每個(gè)病毒體中存在的拷貝數(shù)低，抗原性弱，不能引發(fā)結(jié)合游離流感病毒體的抗體，也不能阻斷病毒對(duì)細(xì)胞受體的附著(即中和病毒)。
[0012]由于先前的研究已經(jīng)顯示，表面流感糖蛋白HA和NA是引發(fā)抗流感病毒保護(hù)性免疫的主要靶標(biāo)，而且Ml提供抗流感細(xì)胞免疫的保守靶標(biāo)，新疫苗候選物可能包含這些病毒抗原作為蛋白大分子顆粒，諸如病毒樣顆粒(VLP)。此外，具有這些流感抗原的顆粒可展示能引發(fā)針對(duì)多種流感病毒株的中和性抗體的構(gòu)象表位。
[0013]數(shù)項(xiàng)研究已經(jīng)證明，在使用哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)?；蛘邨U狀病毒載體的細(xì)胞培養(yǎng)中重組流感蛋白能夠自組裝成VLP (Gomez-Puertas et al., 1999; Neumann et al., 2000; Lathamand Galarza, 2001)。Gomez-Puertas et al.(1999)證明，流感 VLP 的高效形成依賴(lài)于病毒蛋白的表達(dá)水平。Neumann et al.(2000)建立了一種基于哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒的系統(tǒng)，用于完全從克隆的cDNA產(chǎn)生感染性的流感病毒樣顆粒。Latham和Galarza (2001)報(bào)道了在共表達(dá)HA、NA、M1和M2基因的重組桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞中形成流感VLP。這些研究證明，流感病毒體蛋白在真核細(xì)胞中共表達(dá)時(shí)可自組裝。
[0014]發(fā)明概述
[0015]本發(fā)明提供一種病毒樣顆粒(VLP)，它包含流感病毒Ml蛋白和流感病毒H5及NI血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，Ml蛋白與H5和NI蛋白相比衍生自不同的流感病毒株。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述H5或NI來(lái)自H5N1進(jìn)化枝(clade) I流感病毒。
[0016]本發(fā)明還提供在容許VLP形成的條件下，由包含編碼流感H5和NI蛋白及流感Ml蛋白的一種或多種核酸的真核細(xì)胞表達(dá)的VLP。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述真核細(xì)胞選自酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、兩棲動(dòng)物細(xì)胞、禽類(lèi)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述真核細(xì)胞是昆蟲(chóng)細(xì)胞。
[0017]本發(fā)明還提供這樣的VLP，當(dāng)它施用于人或動(dòng)物時(shí)，在所述人或動(dòng)物體中引發(fā)針對(duì)流感感染具有保護(hù)性的中和性抗體。
[0018]本發(fā)明還提供包含有效劑量的本發(fā)明VLP的免疫原性組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含佐劑。
[0019]本發(fā)明還提供包含有效劑量的本發(fā)明VLP的疫苗。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疫苗至少包含第二種VLP，其包含來(lái)自不同流感病毒株的HA和NA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疫苗包含佐劑。
[0020]本發(fā)明還提供在動(dòng)物中誘發(fā)顯著的抗流感病毒感染免疫的方法，其包括施用至少一個(gè)有效劑量的包含本發(fā)明VLP的疫苗。在一個(gè)實(shí)施方案中，將所述疫苗通過(guò)口服、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用于動(dòng)物。
[0021]本發(fā)明還提 供本發(fā)明的VLP用于制備動(dòng)物用疫苗的用途，其中該疫苗在所述動(dòng)物中誘發(fā)顯著的抗流感病毒感染免疫。
[0022]本發(fā)明還提供制備本發(fā)明VLP的方法，其包括在真核細(xì)胞中表達(dá)Ml、HA和NA蛋白。
[0023]本發(fā)明提供包含流感VLP的疫苗，其中所述VLP包含流感Ml、HA和NA蛋白，其中所述疫苗在人體中誘導(dǎo)顯著的抗流感病毒感染免疫。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疫苗包含流感VLP，其中所述VLP基本上由流感Ml、HA和NA蛋白組成，其中所述疫苗在人體中誘導(dǎo)顯著的抗流感病毒感染免疫。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疫苗包含流感VLP，其中所述VLP包含選自流感Ml、HA和NA蛋白的多種流感蛋白，其中所述疫苗在人體內(nèi)誘導(dǎo)顯著的抗流感病毒感染免疫。
[0024]本發(fā)明還提供流感VLP用于制備疫苗的用途，其中所述VLP包含流感M1、HA和NA蛋白，其中所述疫苗在人體中誘導(dǎo)顯著的抗流感病毒感染免疫。
[0025]由此，本發(fā)明提供一種大分子蛋白結(jié)構(gòu)，其包含(a)第一種流感病毒Ml蛋白和(b)附加結(jié)構(gòu)蛋白，其可以包括:第二種或更多種流感病毒Ml蛋白；第一種、第二種或更多種流感病毒HA蛋白；第一種、第二種或更多種流感病毒NA蛋白；和第一種、第二種或更多種流感病毒M2蛋白。如果所述附加結(jié)構(gòu)蛋白不是來(lái)自第二種或更多種流感病毒Ml蛋白，那么該組中所有的成員，例如第一種和第二種流感M2病毒蛋白，均包括在內(nèi)。由此，本發(fā)明提供一種基本上由通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的流感病毒結(jié)構(gòu)蛋白所組成的功能性流感蛋白結(jié)構(gòu)，包括亞病毒顆粒、VLP或殼粒結(jié)構(gòu)，或者其部分、疫苗、多價(jià)疫苗以及它們的混合物。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述流感大分子蛋白結(jié)構(gòu)包括流感病毒HA、NA和Ml蛋白，這些蛋白是從野生型病毒作為合成片段克隆的流感病毒基因的表達(dá)產(chǎn)物。
[0026]所述大分子蛋白結(jié)構(gòu)還可以包括附加結(jié)構(gòu)蛋白，例如核蛋白(NP)、來(lái)自非流感病毒(noninfluenza viruses)之外的物種的膜蛋白及來(lái)自非流感來(lái)源(non-1nfIuenzasource)的膜蛋白，這些蛋白衍生自禽類(lèi)或哺乳動(dòng)物來(lái)源及流感病毒的不同亞型，包括甲型和乙型流感病毒。本發(fā)明可包括嵌合大分子蛋白結(jié)構(gòu)，其所包括的至少一種蛋白質(zhì)的一部分具有不是由流感病毒所產(chǎn)生的模塊。
[0027]可以通過(guò)提供可在宿主細(xì)胞中由重組構(gòu)建體自組裝的大分子蛋白結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)流感的預(yù)防。本發(fā)明的大分子蛋白結(jié)構(gòu)能夠自組裝成同型或異型的病毒樣顆粒(VLP)，這些顆粒在HA和NA蛋白上展示構(gòu)象表位，這些表位引發(fā)保護(hù)性的中和性抗體。所述組合物可以是疫苗組合物，其還含有載體或稀釋劑和/或佐劑。功能性流感VLP能引發(fā)針對(duì)一種或多種流感病毒株或病毒型的中和性抗體，取決于所述功能性流感VLP是否含有來(lái)自一種或多種病毒株或病毒型的HA和/或NA蛋白。所述疫苗包含的流感病毒蛋白可以是野生型流感病毒蛋白。優(yōu)選地，含有流感VLP的結(jié)構(gòu)蛋白或者其部分，可衍生自野生型流感病毒的多種病毒株。可以將所述流感疫苗施用于人或動(dòng)物以引發(fā)針對(duì)一種或多種流感病毒株或病毒型的保護(hù)性免疫力。
[0028]本發(fā)明的大分子蛋白結(jié)構(gòu)可以展現(xiàn)血凝素活性和/或神經(jīng)氨酸酶活性。
[0029]本發(fā)明提供一種通過(guò)構(gòu)建重組構(gòu)建體來(lái)制備流感衍生的VLP的方法，其中所述重組構(gòu)建體編碼流感結(jié)構(gòu)基因(包括Ml、HA)和至少一種流感病毒衍生的結(jié)構(gòu)蛋白。使用重組構(gòu)建體，利用重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染、感染或轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。在容許表達(dá)M1、HA和至少一種流感病毒衍生的結(jié)構(gòu)蛋白的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，在所述宿主細(xì)胞中形成VLP。收獲含有功能性流感VLP的被感染細(xì)胞的培養(yǎng)液，并純化VLP。本發(fā)明還有一個(gè)特點(diǎn)在于用編碼第二種流感蛋白的第二重組構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染、共感染或共轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，從而將第二種流感蛋白納入VLP中的額外步驟。這樣的結(jié)構(gòu)蛋白可以衍生自流感病毒,包括NA、M2和NP，并且至少一種結(jié)構(gòu)蛋白衍 生自禽類(lèi)或哺乳動(dòng)物來(lái)源。結(jié)構(gòu)蛋白可以是甲型和乙型流感病毒。根據(jù)本發(fā)明，宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞。此外，VLP可以是嵌合型VLP。
[0030]本發(fā)明的另一個(gè)特點(diǎn)是一種配制含有流感VLP的藥品的方法，該方法是通過(guò)向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入編碼流感病毒基因的重組構(gòu)建體，并容許重組流感病毒蛋白在細(xì)胞中自組裝成為功能性的同型或異型VLP。分離并純化流感VLP，并配制含有該流感VLP的藥品。所述藥品可以進(jìn)一步包含佐劑。此外，本發(fā)明提供一種配制藥品的方法，該方法是通過(guò)將此類(lèi)含有流感VLP的藥品與脂質(zhì)小泡，即非離子性脂質(zhì)小泡混合。由此，功能性的同型或異型VLP可作為覆包膜的顆粒從被感染細(xì)胞出芽(bud)。出芽的流感VLP可以通過(guò)超離心或柱層析分離純化為藥品，并單獨(dú)地或者與佐劑諸如Novasomes? (Novavax, Inc產(chǎn)品)等配制成藥物產(chǎn)品，諸如疫苗。Novasomes?.提供增強(qiáng)的免疫效應(yīng)，在美國(guó)專(zhuān)利N0.4，911，928中對(duì)其有進(jìn)一步描述，通過(guò)提述納入本文。
[0031]本發(fā)明提供一種檢測(cè)脊椎動(dòng)物中針對(duì)流感病毒感染的體液免疫的方法，該方法是通過(guò)提供包含有效抗體檢測(cè)量的流感病毒蛋白的測(cè)試試劑，所述流感病毒蛋白具有流感病毒大分子結(jié)構(gòu)的至少一個(gè)構(gòu)象表位。將測(cè)試試劑與來(lái)自需要檢查流感病毒感染的脊椎動(dòng)物的體液樣品接觸。讓樣品中包含的流感病毒特異性抗體與流感病毒大分子結(jié)構(gòu)的構(gòu)象表位結(jié)合以形成抗原-抗體復(fù)合物。將這些復(fù)合物從未結(jié)合的復(fù)合物中分離出來(lái)，并使它們與可檢測(cè)地標(biāo)記的免疫球蛋白結(jié)合劑接觸。測(cè)定結(jié)合于所述復(fù)合物的可檢測(cè)地標(biāo)記的免疫球蛋白結(jié)合劑的量。
[0032]可以如下檢測(cè)來(lái)自懷疑感染了流感病毒的動(dòng)物或人的標(biāo)本中的流感病毒，即通過(guò)提供具有產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記物或者連接于可檢測(cè)地標(biāo)記的試劑、并且對(duì)流感病毒顆粒的至少一種構(gòu)象表位具有特異性的抗體。使標(biāo)本與抗體接觸，并讓抗體與流感病毒結(jié)合。利用所述可檢測(cè)標(biāo)記物確定標(biāo)本中流感病毒的存在。
[0033]本發(fā)明提供治療、預(yù)防和產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，所述方法是通過(guò)對(duì)脊椎動(dòng)物施用有效量的本發(fā)明的組合物。
[0034]或者，所述流感VLP藥品可以配制成實(shí)驗(yàn)室試劑，用于流感病毒結(jié)構(gòu)研究和臨床診斷測(cè)定。本發(fā)明還提供用于通過(guò)施用有效量的本發(fā)明的組合物來(lái)治療流感病毒的試劑盒和使用指導(dǎo)。
[0035]本發(fā)明還提供包含HA、NA和Ml蛋白的VLP，所述HA、NA和Ml蛋白衍生自能夠在脊椎動(dòng)物中導(dǎo)致發(fā)病(morbidity)或死亡(mortality)的禽流感病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述HA、NA和Ml蛋白衍生自甲型禽流感病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，HA選自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 和 H16,而 NA 選自 N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述HA和NA蛋白分別是H5和NI。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述HA和NA蛋白分別是H9和N2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述HA和/或NA分別展現(xiàn)血凝素活性和/或神經(jīng)氨酸酶活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，VLP基本上由HA、NA和Ml蛋白組成，也就是說(shuō)，這些蛋白基本上是VLP中僅有的流感蛋白。
[0036]本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生VLP的方法，其包括將編碼禽流感病毒蛋白的載體轉(zhuǎn)染到合適的宿主細(xì)胞中，并在容許形成VLP的條件下表達(dá)所述禽流感病毒蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法涉及用僅編碼HA、NA和Ml流感蛋白的重組DNA分子轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。
[0037]本發(fā)明還包 括一種包含VLP的抗原性制劑，所述VLP含有衍生自能夠在脊椎動(dòng)物中導(dǎo)致發(fā)病和死亡的禽流感病毒的HA、NA和Ml蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，HA選自Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 和 H16,而 NA 選自 N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述HA和NA蛋白分別是H5和NI。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述HA和NA蛋白分別是H9和N2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將所述抗原性制劑通過(guò)口服、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用于受試者。
[0038]本發(fā)明進(jìn)一步提供對(duì)脊椎動(dòng)物進(jìn)行抗禽流感病毒免疫接種的方法，其包括對(duì)所述脊椎動(dòng)物施用誘導(dǎo)保護(hù)量的VLP，所述VLP包含衍生自禽流感病毒的HA、NA和Ml蛋白。
[0039]本發(fā)明還包括在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法，其包括施用至少一個(gè)有效劑量的流感VLP。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述VLP基本上由HA、NA和Ml組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由HA、NA和Ml組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述HA和/或NA分別展現(xiàn)血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶活性。
[0040]本發(fā)明還包括在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法，其包括施用至少一個(gè)有效劑量的禽流感VLP。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感VLP基本上由禽類(lèi)HA、NA和Ml組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由禽類(lèi)HA、NA和Ml組成。
[0041]本發(fā)明還包括在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法，其包括施用至少一個(gè)有效劑量的季候性流感VLP。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感VLP基本上由季候性HA、NA和Ml組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感VLP包括流感蛋白，其中所述流感蛋白由季候性HA、NA和Ml組成。
[0042]本發(fā)明還包括在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法，其包括施用至少一個(gè)有效劑量的至少一種季候性流感VLP。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感VLP包含季候性流感HA、NA和Ml。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感VLP基本上由季候性流感HA、NA和Ml組成。
[0043]本發(fā)明進(jìn)一步包括在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的保護(hù)性抗體應(yīng)答的方法，其包括施用至少一個(gè)有效劑量的流感VLP。
[0044]本發(fā)明包括在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的保護(hù)性細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法，其包括施用至少一個(gè)有效劑量的流感VLP。
[0045]本發(fā)明還包括配制疫苗的方法,所述疫苗在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力，所述方法包括向所述制劑中加入有效劑量的流感VLP。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力是通過(guò)一個(gè)劑量賦予的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力是通過(guò)多個(gè)劑量賦予的。
[0046]本發(fā)明還包括一種含有流感VLP的疫苗，其中所述疫苗當(dāng)施用于受試者時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感VLP是禽流感VLP。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感VLP是季候性流感VLP。
[0047]本發(fā)明還包括一種含有流感VLP的抗原性制劑，其中所述疫苗當(dāng)施用于受試者時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)流感病毒感染 或其至少一種癥狀的顯著的免疫力。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感VLP是禽流感VLP。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感VLP是季候性流感VLP。
[0048]附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0049]圖1描述禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)病毒神經(jīng)氨酸酶(NA)基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:1) ο
[0050]圖2描述禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)病毒血凝素(HA)基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)ο
[0051]圖3描述禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)病毒基質(zhì)蛋白Ml (Ml)基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)。
[0052]圖4描述構(gòu)建用于表達(dá)禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)HA、NA和Ml蛋白的重組桿狀病毒所用轉(zhuǎn)移載體。圖4中的(A)描述表達(dá)各個(gè)基因的轉(zhuǎn)移載體，圖4中的(B)描述用于基因的多重表達(dá)的轉(zhuǎn)移載體。
[0053]圖5描述禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)HA、NA和Ml蛋白在Sf_9S細(xì)胞中的表達(dá)。
[0054]圖6描述通過(guò)蔗糖密度梯度方法純化禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2) VLP。
[0055]圖7描述通過(guò)凝膠過(guò)濾層析檢測(cè)流感病毒蛋白。Western印跡分析中所用的抗體如下:(A)兔抗H9N2 ； (b)鼠抗Ml單抗；(C)鼠抗BACgp64。[0056]圖8描述通過(guò)電子顯微術(shù)檢測(cè)禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)蛋白，包括亞病毒顆粒、VLP和VLP復(fù)合物。
[0057]圖9描述純化的禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2) VLP的血凝素活性。
[0058]圖10描述純化的禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2) VLP的神經(jīng)氨酸酶活性。
[0059]圖11描述在小鼠中使用純化的禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2) VLP進(jìn)行重組流感免疫原性研究所用的免疫和取血時(shí)間表。
[0060]圖12描述在用重組流感H9N2VLP免疫的小鼠中免疫原性研究的結(jié)果。圖12中的(a)描述來(lái)自用重組VLP免疫的BALB/c小鼠的血清，其中的VLP由來(lái)自禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)的HA、NA和Ml蛋白組成。圖12中的(b)描述將來(lái)自用滅活甲型禽流感病毒H9N2免疫的新西蘭白兔的血清與含有滅活甲型禽流感病毒H9N2 (泳道I和3)或冷適應(yīng)甲型禽流感病毒H9N2 (泳道2和4)的Western印跡反應(yīng)。
[0061]圖13描述初次免疫和再次免疫之后BALB/c小鼠中的幾何平均抗體應(yīng)答。
[0062]圖14描述BALB/c小鼠中的血清血凝素抑制(HI)應(yīng)答。
[0063]圖15描述用H9N2流感攻擊的BALB/c小鼠中的體重減輕(%)。
[0064]圖16描述用H9N2攻擊后3天和5天的肺病毒效價(jià)。
[0065]圖17A、17B和17C描述用H3N2VLP免疫小鼠后針對(duì)甲型/福建/411/2002的抗體應(yīng)答。
[0066]圖18A和18B描 述小鼠IgG抗體同種型。
[0067]圖19描述用H9N2VLP疫苗免疫的SD大鼠中的血凝素抑制(HI)抗體應(yīng)答。
[0068]圖20A和20B描述BALB/c小鼠中針對(duì)有和沒(méi)有佐劑的不同劑量H9N2VLP的血凝素抑制(HI)抗體應(yīng)答。
[0069]圖21描述BALB/c小鼠中在不同劑量的VLP之間的血清血凝素抑制(HI)應(yīng)答。
[0070]圖22描述在雪貂中的血清血凝素抑制(HI)應(yīng)答。
[0071]圖23描述雪貂施用不同病毒株的H3N2VLP后21和42天時(shí)抽取的血清的血清血凝素抑制(HI)應(yīng)答。
[0072]圖24描述肌肉內(nèi)接種低劑量H5N1 (越南/1203/2003) VLP的小鼠的抗HA抗體(終點(diǎn)稀釋效價(jià))。
[0073]圖25描述鼻內(nèi)接種低劑量H5N1 (越南/1203/2003) VLP的小鼠的抗HA抗體(終點(diǎn)稀釋效價(jià))。
[0074]圖26描述制造、分離和純化本發(fā)明VLP的一個(gè)實(shí)例。
[0075]圖27描述通過(guò)肌肉內(nèi)給藥H3N2VLP接種小鼠，然后通過(guò)鼻內(nèi)用甲型/Aichi/2/68x31(H3N2)病毒攻擊。
[0076]圖28描述通過(guò)鼻內(nèi)給藥H3N2VLP接種小鼠，然后通過(guò)鼻內(nèi)用甲型/Aichi/2/68x31(H3N2)病毒攻擊。
[0077]圖29描述用H9N2VLP疫苗接種后用H9N2病毒鼻內(nèi)攻擊的雪貂洗鼻液中的病毒脫落(shedding)。
[0078]圖30A、30B、30C、30D、30E、30F、30G和30H描述用不同劑量的甲型/福建/411/2002 (H3N2) VLP肌肉內(nèi)或鼻內(nèi)接種后針對(duì)不同的流感病毒H3N2株進(jìn)行測(cè)試時(shí)小鼠中的血凝素抑制(HI)抗體應(yīng)答。[0079]發(fā)明詳述
[0080]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“桿狀病毒”，又稱(chēng)桿狀病毒科(baculoviridae)，是指節(jié)肢動(dòng)物有包膜DNA病毒的一個(gè)科,該科的成員可以用作表達(dá)載體在昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)中生成重組蛋白。病毒體含有一種或多種桿狀核殼，所述核殼還有環(huán)狀超螺旋雙鏈DNA分子(Mr54X 106-154X IO6)。用作載體的病毒通常是苜猜銀紋夜蛾(Autographa californica)核多角體病毒(NVP)。導(dǎo)入基因的表達(dá)是處于通常調(diào)控大核包涵體(在被感染細(xì)胞中病毒包埋在大核包涵體內(nèi))多角體蛋白組分的強(qiáng)啟動(dòng)子的控制之下。
[0081]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“衍生自”指起源或來(lái)源，可包括天然存在的、重組的、未純化的、或者純化的分子。本發(fā)明的蛋白和分子可以衍生自流感或非流感分子。
[0082]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“第一種”流感病毒蛋白，即第一種流感病毒Ml蛋白，是指衍生自某一具體流感病毒株的蛋白質(zhì)，例如Ml、HA、NA和M2。第一種流感病毒的株或型不同于第二種流感病毒蛋白的株或型。因此，“第二種”流感病毒蛋白，即第二種流感病毒Ml蛋白，是指衍生自第二種流感病毒株的蛋白，例如Ml、HA、NA和M2，其中第二種流感病毒株是不同于第一種流感病毒蛋白的株或型。
[0083]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“血凝素活性”是指含HA蛋白、VLP或它們的部分所具有的結(jié)合紅細(xì)胞(紅血球)并使之凝集的能力。
[0084]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)氨酸酶活性”是指含NA蛋白、VLP或它們的部分所具有的從底物(包括蛋白質(zhì)，例如胎球蛋白)切除唾液酸殘基的酶活性。
[0085]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“異型的”(heterotypic)是指一種或多種不同型或株的病毒。
[0086]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“同型的”(heterotypic)是指一種型或株的病毒。
[0087]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“大分子蛋白結(jié)構(gòu)”是指一種或多種蛋白的構(gòu)造(construction)或排列(arrangement)。
[0088]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“多價(jià)”疫苗是指針對(duì)多種流感病毒株或病毒型的疫苗。
[0089]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“非流感的”(non-1nfluenza)是指非衍生自流感病毒的蛋白或分子。
[0090]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“疫苗”是指死亡或弱化的病原體的制備物，或者衍生的抗原性決定簇的制備物，用于誘導(dǎo)針對(duì)所述病原體的抗體或免疫力的形成。給予疫苗以提供針對(duì)疾病(例如由流感病毒導(dǎo)致的流感)的免疫力。本發(fā)明提供具有免疫原性并提供保護(hù)的疫苗組合物。此外，術(shù)語(yǔ)“疫苗”還指免疫原(例如VLP)的懸液或溶液，其被施用于脊椎動(dòng)物以產(chǎn)生保護(hù)性免疫力，即減輕感染相關(guān)疾病的嚴(yán)重性的免疫力。
[0091]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“顯著的免疫力”是指這樣的免疫應(yīng)答:當(dāng)對(duì)脊椎動(dòng)物施用本發(fā)明的VLP時(shí)，該脊椎動(dòng)物中存在免疫系統(tǒng)的誘導(dǎo)，導(dǎo)致所述脊椎動(dòng)物中流感感染的預(yù)防、流感感染的改善或者與流感病毒感染相關(guān)的至少一種癥狀的減輕。顯著的免疫力還可以指在已施用本發(fā)明VLP并已誘導(dǎo)了免疫應(yīng)答的哺乳動(dòng)物中> 40的血凝抑制(HI)效價(jià)。
[0092]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“佐劑”是指這樣的化合物，當(dāng)其與特定的免疫原(例如VLP)在制劑中組合使用時(shí)，增大或以其它方式改變或修飾由此所致的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答的修飾包括抗體免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答之一或二者的強(qiáng)度增大或特異性增寬。免疫應(yīng)答的修飾還可以意味著特定的抗原特異性免疫應(yīng)答的降低或抑制。
[0093]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“免疫刺激物”是指通過(guò)身體自身的化學(xué)信使(細(xì)胞因子)增強(qiáng)免疫應(yīng)答的化合物。這些分子包括具有免疫刺激、免疫強(qiáng)化和促炎癥活性的各種細(xì)胞因子、淋巴因子和趨化因子，諸如白細(xì)胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL_4、IL-12、IL-13)；生長(zhǎng)因子(例如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞(GM)集落刺激因子(CSF));及其它免疫刺激分子，諸如巨噬細(xì)胞炎癥因子，F(xiàn)lt3配體，B.71 ;B7.2等。免疫刺激物分子可以在與流感VLP相同的制劑中施用，或者可以另行施用。可以施用蛋白質(zhì)或者編碼該蛋白質(zhì)的表達(dá)載體來(lái)產(chǎn)生免疫刺激效應(yīng)。
[0094]如本文所用的，“有效劑量”一般指足以誘導(dǎo)免疫力、預(yù)防和/或改善流感病毒感染或減輕流感感染的至少一種癥狀、和/或增強(qiáng)另一個(gè)劑量的VLP的效力的本發(fā)明VLP的量。有效劑量可以指足以延遲流感感染發(fā)作或使之最小化的VLP的量。有效劑量還可以指在流感感染的治療或管理中提供治療益處的VLP的量。此外，有效劑量是就單獨(dú)或與其它療法組合在流感病毒感染的治療或管理中提供治療益處的本發(fā)明VLP而言的量。有效劑量還可以是足以增強(qiáng)受試者(例如人)自己針對(duì)后來(lái)與流感病毒接觸的免疫應(yīng)答的量。免疫力的水平可以通過(guò)例如測(cè)量中和性分泌抗體和/或血清抗體的量來(lái)加以監(jiān)測(cè)，所述測(cè)量例如通過(guò)曬斑中和(plaque neutralization)、補(bǔ)體結(jié)合(complement fixation)、酶聯(lián)免疫吸附、或微中和(microneutralization)測(cè)定來(lái)進(jìn)行。在疫苗的情況下，“有效劑量”是預(yù)防疾病或降低癥狀嚴(yán)重性的劑量。
[0095]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“禽流感病毒”是指主要見(jiàn)于鳥(niǎo)類(lèi)中，但也可感染人類(lèi)或其它動(dòng)物的流感病毒。在一些情況下，禽流感病毒可以從一個(gè)人傳播或擴(kuò)散至另一個(gè)人。感染人的禽流感病毒具有導(dǎo)致流感大流行，即導(dǎo)致人類(lèi)中的發(fā)病和死亡的潛力。當(dāng)出現(xiàn)新的流感病毒株(人對(duì)其不具有天然免疫力的病毒)，其擴(kuò)散經(jīng)過(guò)各個(gè)地點(diǎn)并可能遍及全球，同時(shí)感染很多人時(shí)，即出現(xiàn)大流行。
[0096]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“季候性流感病毒”是指就某一流感季候而言，已根據(jù)全球各國(guó)家流感中心(National Influenza Centers)進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查確定為正在人群內(nèi)傳播的流感病毒株。這些流行病學(xué)研究結(jié)果以及某些分離的流感病毒被送到世界衛(wèi)生組織(WHO)的四個(gè)參考實(shí)驗(yàn)室之一以進(jìn)行詳細(xì)研究，其中一個(gè)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置在亞特蘭大的疾病控制和預(yù)防中心(Centers for Disease Control and Prevention(CDC))。這些實(shí)驗(yàn)室測(cè)試針對(duì)現(xiàn)有疫苗制備的抗體 與流行中的病毒和新流感病毒反應(yīng)的良好程度。將該信息和有關(guān)流感活動(dòng)情況的信息匯總并提交到美國(guó)食品和藥品管理局(FDA)的一個(gè)顧問(wèn)委員會(huì)以及WHO的會(huì)議上。這些會(huì)議的結(jié)果是選擇三種病毒(甲型流感病毒的兩個(gè)亞型和乙型流感病毒的一個(gè)亞型)進(jìn)入用于下個(gè)秋季和冬季的流感疫苗。該選擇在北半球于2月份進(jìn)行，在南半球于9月份進(jìn)行。通常，每年改變疫苗中三種病毒株中的一種或兩種。
[0097]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“顯著保護(hù)性的抗體應(yīng)答”是指脊椎動(dòng)物(例如人)展現(xiàn)的、由針對(duì)流感病毒的抗體介導(dǎo)的、預(yù)防或改善流感感染或減輕其至少一種癥狀的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的VLP可以刺激產(chǎn)生抗體(例如中和性抗體)，所述抗體阻止流感病毒進(jìn)入細(xì)胞、結(jié)合所述流感病毒從而阻斷該病毒復(fù)制、和/或保護(hù)宿主細(xì)胞不受感染和破壞。
[0098]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“顯著保護(hù)性的細(xì)胞免疫”是指脊椎動(dòng)物(例如人)展現(xiàn)的、由針對(duì)流感病毒的T淋巴細(xì)胞和/或其它白細(xì)胞介導(dǎo)的、預(yù)防或改善流感感染或減輕其至少一種癥狀的免疫應(yīng)答。細(xì)胞免疫的一個(gè)重要方面涉及細(xì)胞溶解性T細(xì)胞(CTL)所致的抗原特異性應(yīng)答。CTL針對(duì)與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)編碼蛋白結(jié)合呈遞并表達(dá)在細(xì)胞表面的肽抗原具有特異性。CTL幫助誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)微生物的破壞或感染了這些微生物的細(xì)胞的溶解。細(xì)胞免疫的另一個(gè)方面涉及T輔助細(xì)胞所致的抗原特異性應(yīng)答。T輔助細(xì)胞幫助刺激非特異性效應(yīng)細(xì)胞的功能，并使這些效應(yīng)細(xì)胞的活性集中指向在其表面上展示與MHC分子結(jié)合的肽抗原的細(xì)胞?！凹?xì)胞免疫應(yīng)答”還指由活化T細(xì)胞和/或其它白細(xì)胞(包括衍生自CD4+和CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞)所產(chǎn)生的細(xì)胞因子、趨化因子以及其它此類(lèi)分子的產(chǎn)生。
[0099]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“基于全群體的顯著免疫力”是指對(duì)群體中的個(gè)體施用的本發(fā)明VLP所致的免疫力。所述群體中的所述個(gè)體中的免疫力，導(dǎo)致所述個(gè)體中流感感染的預(yù)防、改善，或者與流感病毒感染相關(guān)的至少一種癥狀的減輕，并防止所述流感病毒擴(kuò)散到群體中其它個(gè)體。術(shù)語(yǔ)“群體”定義為個(gè)體(例如學(xué)童、老人、健康個(gè)體等等)的群組，可包括地理區(qū)域(例如具體的城市、學(xué)校、小區(qū)、工作場(chǎng)所、國(guó)家(country)、州(state),等)。
[0100]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“抗原性制劑”或“抗原性組合物”是指這樣的制備物:當(dāng)將它施用于脊椎動(dòng)物，尤其是鳥(niǎo)類(lèi)或哺乳動(dòng)物時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
[0101]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“脊椎動(dòng)物”或“受試者”或“患者”是指脊索動(dòng)物亞門(mén)(subphylum cordata)的任何成員，包括但不限于人和其它靈長(zhǎng)類(lèi),包括非人靈長(zhǎng)類(lèi),例如黑猩猩和其它猿類(lèi)和猴類(lèi)物種。家畜(farm animals)，如牛、綿羊、豬、山羊和馬；家養(yǎng)動(dòng)物，如狗和貓；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，包括嚙齒類(lèi)如小鼠、大鼠和豚鼠；鳥(niǎo)類(lèi)，包括家禽、野鳥(niǎo)和獵禽，如雞、火雞和其它鶉雞類(lèi)鳥(niǎo)類(lèi)，鴨、鵝等等也是非限制性的例子。該定義中包含術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”和“動(dòng)物”。意圖覆蓋成體和新生個(gè)體。
[0102]雖然現(xiàn)有在最優(yōu)條件下60-80%有效的特異性滅活病毒疫苗，流感仍然是一個(gè)普遍的公共健康問(wèn)題。當(dāng)這些疫苗有效時(shí)，通常通過(guò)防止病毒感染而避免患病?？乖圆町惖姆e累(抗原性轉(zhuǎn)變和抗原性漂移)可導(dǎo)致疫苗失效。例如，甲型禽流感H9N2與人流感病毒甲型/悉尼/97(H3N2)在豬中共流行(co-circulate)，導(dǎo)致基因重排列和具有大流行潛力的人流感病毒新株的出現(xiàn)(Peiris et al.，2001)。在發(fā)生此類(lèi)抗原性轉(zhuǎn)變的情況下，現(xiàn)有的疫苗不大可能提供足夠的保護(hù)。
[0103]缺乏流感疫苗方案的另一個(gè)原因是現(xiàn)有疫苗引發(fā)的免疫力持續(xù)時(shí)間相對(duì)較短。流感控制措施的進(jìn)一步缺乏反映了現(xiàn)有疫苗的使用受到限制，這是由于疫苗的反應(yīng)原性以及對(duì)幼兒、老年人和對(duì)商業(yè)許可的滅活病毒流感疫苗的制造中使用的卵組分過(guò)敏的人的副作用。
[0104]此外，滅活的流感病毒疫苗往往缺少HA和NA構(gòu)象表位或者所含HA和NA構(gòu)象表位發(fā)生了改變，而這些表位引發(fā)中和性抗體并且在抗病免疫中起重要作用。因此，滅活病毒疫苗和某些重組單體流感亞基蛋白疫苗賦予的保護(hù)不足。另一方面，大分子蛋白結(jié)構(gòu)，例如殼粒、亞病毒顆粒和/或VLP，含有多拷貝的展示構(gòu)象表位的天然蛋白，有利于獲得最優(yōu)的疫苗免疫原性。
[0105]本發(fā)明描述將禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)病毒HA、NA和Ml基因單獨(dú)或串聯(lián)地克隆到單一桿狀病毒表達(dá)載體中，以及生產(chǎn)由重組流感結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成的流感疫苗候選物或試劑；在桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞中，這些重組流感結(jié)構(gòu)蛋白自組裝成功能性和免疫原性同型大分子蛋白結(jié)構(gòu)，包括亞病毒流感顆粒和流感VLP。
[0106]本發(fā)明描述將人流感甲型/悉尼/5/97和甲型/福建/411/2002 (H3N2)病毒HA、NA、Ml、M2和NP基因克隆到桿狀病毒表達(dá)載體中，以及生產(chǎn)由流感結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成的流感疫苗候選物或試劑；在桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞中，這些流感結(jié)構(gòu)蛋白自組裝成功能性和免疫原性同型大分子蛋白結(jié)構(gòu)，包括亞病毒流感顆粒和流感VLP。
[0107]此外，本發(fā)明描述將人流感甲型/悉尼/5/97和甲型/福建/411/2002(H3N2)病毒的HA基因和禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)的HA、NA和Ml基因串聯(lián)地克隆到單一桿狀病毒表達(dá)載體中，以及生產(chǎn)由流感結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成的流感疫苗候選物或試劑；在桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞中，這些流感結(jié)構(gòu)蛋白自組裝成功能性和免疫原性同型大分子蛋白結(jié)構(gòu)，包括亞病毒流感顆粒和流感VLP。
[0108]本發(fā)明的VLP
[0109]本發(fā)明的流感VLP有用于制備針對(duì)流感病毒的疫苗。該系統(tǒng)的一個(gè)重要特征是能夠用不同亞型的HA和/或NA或其它病毒蛋白代替表面糖蛋白，從而可以每年更新新的流感抗原性變體或?yàn)榱鞲写罅餍凶鰷?zhǔn)備。當(dāng)這些糖蛋白的抗原性變體被鑒定時(shí)，可以更新VLP以包含這些新變體(例如用于季候性流感疫苗)。此外，來(lái)自潛在大流行性病毒如H5N1的表面糖蛋白，或其它具有大流行性潛力的HA、NA組合，也可納入VLP中，而不用擔(dān)心釋放出已有數(shù)十年未在人類(lèi)中流行的基因。這是因?yàn)檫@些VLP沒(méi)有感染性，不會(huì)復(fù)制且不能致病。因此，該系統(tǒng)可用于每年創(chuàng)造新的候選流感疫苗，和/或在任何需要的時(shí)候創(chuàng)造流感大流行性疫苗。
[0110]有16種不同的血凝素(HA)和9種不同的神經(jīng)氨酸酶(NA)，它們都已在野生鳥(niǎo)類(lèi)中找到。野生鳥(niǎo)類(lèi)是所有類(lèi)型的甲型流感病毒的主要天然儲(chǔ)庫(kù)，并且被認(rèn)為是所有其它脊椎動(dòng)物中的所有類(lèi)型的甲型流感病毒的來(lái)源。這些亞型由于它們表面上的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的變化而不同。HA和NA蛋白的許多不同組合是可能的。每種組合代表一種不同的甲型流感病毒類(lèi)型。此外，每種類(lèi)型根據(jù)其8種基因的每一種中發(fā)現(xiàn)的不同突變可以進(jìn)一步分類(lèi)為多種病毒株。
[0111]所有已知類(lèi)型的 甲型流感病毒均可在鳥(niǎo)類(lèi)中找到。通常，禽流感病毒不感染人類(lèi)。但是，某些禽流感病毒可發(fā)生與穿越物種屏障的能力相關(guān)聯(lián)的遺傳變異。這樣的病毒能夠造成大流行，因?yàn)槿祟?lèi)對(duì)此病毒沒(méi)有天然免疫力，能夠容易地從人到人傳播。1997年香港，在一次家禽禽流感爆發(fā)中，禽流感病毒從鳥(niǎo)類(lèi)傳到了人類(lèi)。該病毒被鑒定為流感病毒H5N1。這種病毒導(dǎo)致18人發(fā)生嚴(yán)重的呼吸道病情,其中6人死亡。從那時(shí)起，全世界人類(lèi)中發(fā)生了越來(lái)越多的已知H5N1感染病例，這些人中大約半數(shù)已經(jīng)死亡。
[0112]因此，本發(fā)明包括從禽流感病毒、具有大流行潛力的流感病毒和/或季候性流感病毒克隆HA、NA和Ml核苷酸到表達(dá)載體中。本發(fā)明還描述由自組裝成功能性VLP的流感蛋白構(gòu)成的流感疫苗候選物或試劑的生產(chǎn)。所有病毒蛋白組合都必須與Ml核苷酸共表達(dá)。
[0113]本發(fā)明的VLP包括流感HA、NA和Ml蛋白或由它們組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述VLP包含來(lái)自禽流感病毒、大流行性流感病毒和/或季候性流感病毒的HA，和來(lái)自禽流感病毒、大流行性流感病毒和/或季候性流感病毒的NA，其中所述HA選自Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 和 H16，所述 NA 選自 N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括基本上由HA、NA和Ml組成的VLP。所述HA和NA可以來(lái)自上面所列的HA和NA。這些VLP可包含可忽略濃度的其它流感蛋白和/或蛋白雜質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感 VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由HA、NA和Ml蛋白組成。這些VLP含有HA、NA和Ml，并可含有其它細(xì)胞組分如細(xì)胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質(zhì)、碳水化合物等，但不含有其它流感蛋白(除了 M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)表達(dá)在VLP表面上時(shí)，HA和/或NA可分別展現(xiàn)血凝素活性和/或神經(jīng)氨酸酶活性。
[0114]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VLP包含H5N1病毒的HA和NA，以及Ml蛋白(該Ml蛋白可以來(lái)自也可以不來(lái)自同一病毒株)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VLP基本上由H5N1病毒的HA和NA以及Ml蛋白組成。這些VLP可以包含可忽略濃度的其它流感蛋白和/或蛋白雜質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VLP由H5N1病毒的HA和NA以及Ml蛋白組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由H5、NI和Ml蛋白組成。這些VLP含有H5、N9和Ml，并可含有其它細(xì)胞組分如細(xì)胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質(zhì)、碳水化合物等，但不含有其它流感蛋白(除了 M1、H5和/或NI的片段之外)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)表達(dá)在VLP表面上時(shí)，H5和/或NI可分別展現(xiàn)血凝素活性和/或神經(jīng)氨酸酶活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VLP包含H9N2病毒的HA和NA，以及Ml蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VLP基本上由H9N2病毒的HA和NA，以及Ml蛋白組成。這些VLP可以包含可忽略濃度的其它流感蛋白和/或蛋白雜質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VLP由H9N2病毒的HA和NA，以及Ml蛋白組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由H9、N2和Ml蛋白組成。這些VLP含有H9、N2和Ml，并可含有其它細(xì)胞組分如細(xì)胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質(zhì)、碳水化合物等，但不含有其它流感蛋白(除了 M1、H9和/或N2的片段之外)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)表達(dá)在VLP表面上時(shí)，H9和/或N2可分別展現(xiàn)血凝素活性和/或神經(jīng)氨酸酶活性。
[0115]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VLP包含來(lái)自乙型流感病毒的HA和NA，以及Ml蛋白。乙型流感病毒通常僅見(jiàn)于人類(lèi)。和甲型流感病毒不同，這些病毒不根據(jù)亞型分類(lèi)。乙型流感病毒可在人類(lèi)中導(dǎo)致發(fā)病和死亡，但與甲型流感病毒相比，其相關(guān)的流行嚴(yán)重程度一般較小。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VLP基本上由來(lái)自乙型流感病毒的HA和NA，以及Ml蛋白組成。這些VLP可以包含可忽略濃度的其它流感蛋白和/或蛋白雜質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由HA、NA和Ml蛋白組成。這些VLP含有HA、NA和Ml，并可含有其它細(xì)胞組分如細(xì)胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質(zhì)、碳水化合物等，但不含有其它流感蛋白(除 了 M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VLP由乙型流感病毒的HA和NA，以及Ml蛋白組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)表達(dá)在VLP表面上時(shí)，HA和/或NA可分別展現(xiàn)血凝素活性和/或神經(jīng)氨酸酶活性。
[0116]本發(fā)明還涵蓋在本發(fā)明VLP之上或之中表達(dá)的所述流感蛋白的變體。這些變體可在所述組分蛋白的氨基酸序列中包含改變。術(shù)語(yǔ)“變體”就多肽而言是指相對(duì)于參考序列改變了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列。變體可具有“保守的”改變，其中用于替換的氨基酸具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，例如用異亮氨酸替換亮氨酸?；蛘撸凅w可具有“非保守的”改變，例如用色氨酸替換甘氨酸。類(lèi)似的次要變化還可包括氨基酸缺失和/或插入。使用本領(lǐng)域公知的計(jì)算機(jī)程序，例如DNASTAR軟件，可以找到確定哪些氨基酸殘基可供替換、插入或缺失而不消除生物學(xué)活性或免疫學(xué)活性的指導(dǎo)。
[0117]天然變體可由于抗原性漂移而產(chǎn)生。抗原性漂移是病毒蛋白中隨時(shí)間不斷發(fā)生的細(xì)小變化。因此，感染了某一特定流感病毒株的人產(chǎn)生針對(duì)該病毒的抗體，當(dāng)新病毒株出現(xiàn)時(shí)，針對(duì)較舊病毒株的抗體不再識(shí)別該較新的病毒，而可能發(fā)生再感染。這就是每個(gè)季候都有新流感疫苗的原因。此外，流感病毒中的某些改變可導(dǎo)致流感病毒跨種傳播。例如，某些禽流感病毒發(fā)生與穿越物種屏障能力相關(guān)的遺傳變異。這樣的病毒能夠造成大流行，因?yàn)槿祟?lèi)對(duì)此病毒沒(méi)有天然免疫力，該病毒能夠容易地從人到人傳播。所述流感蛋白的天然發(fā)生的變異是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。
[0118]描述可應(yīng)用于本發(fā)明的分子生物學(xué)技術(shù)例如克隆、突變、細(xì)胞培養(yǎng)等的通用教科書(shū)包括:Berger 和 Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods inEnzymology volume152Academic Press,Inc., San Diego,Calif.(Berger);Sambrook etal., Molecular Cloning—A Laboratory Manual(3rd Ed.), Vol.1-3，Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.，2000 ( “Sambrook，，)和 Current Protocolsin Molecular Biology, F.M.Ausubel et al., eds., Current Protocols, 由 GreenePublishing Associates, Inc.和 John ffiley&Sons, Inc.聯(lián)合出版(“Ausubel”)。這些教科書(shū)描述了誘變、載體的使用、啟動(dòng)子和許多其它相關(guān)的題目，例如HA和/或NA分子的克隆和突變等。因此，本發(fā)明也涵蓋使用已知的蛋白質(zhì)工程和重組DNA技術(shù)的方法來(lái)改進(jìn)或改變表達(dá)在本發(fā)明VLP之上或之中的流感蛋白的特性。有多種誘變類(lèi)型可用于產(chǎn)生和/或分離變體HA、NA和/或Ml分子和/或用于進(jìn)一步修飾/突變本發(fā)明的多肽。它們包括但不限于定點(diǎn)誘變、隨機(jī)點(diǎn)誘變、同源重組(DNA改組)、使用含尿嘧啶模板進(jìn)行誘變、寡核苷酸定點(diǎn)誘變、硫代磷酸酯修飾的DNA誘變、使用缺口雙鏈體DNA的誘變等等。其它合適的方法包括點(diǎn)錯(cuò)配修復(fù)(point mismatch repair),使用修復(fù)缺陷的宿主株的誘變，限制選擇和限制純化，缺失誘變，通過(guò)全基因合成的誘變，雙鏈斷裂修復(fù)等等。誘變，例如涉及嵌合構(gòu)建體的誘變，也包含在本發(fā)明中。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)天然存在的分子或經(jīng)過(guò)改變或突變的天然存在的分子，例如序列、序列比較、物理性質(zhì)、晶體結(jié)構(gòu)等等的已知信息來(lái)指導(dǎo)誘變。
[0119]本發(fā)明還包括當(dāng)表達(dá)在VLP之上或之中時(shí)顯示顯著的生物學(xué)活性(例如能夠引發(fā)有效的抗體應(yīng)答)的流感蛋白變體。這樣的變體包括缺失、插入、倒序(inversion)、重復(fù)，和替代，根據(jù)本領(lǐng)域已知的一般規(guī)則來(lái)選擇它們使其對(duì)活性幾乎不產(chǎn)生影響。
[0120]克隆所述流感蛋白的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，可以從感染了流感病毒的細(xì)胞提取聚腺苷酸化mRNA，通過(guò)RT-PCR從中分離出編碼特定流感蛋白的流感基因。所得產(chǎn)物基因可以作為DNA插入片段克隆到載體中。術(shù)語(yǔ)“載體”是指可用于擴(kuò)增核酸和/或在生物體、細(xì)胞或細(xì)胞組分之間轉(zhuǎn)移核酸的工具。載體包括自主復(fù)制或可整合到宿主細(xì)胞的染色體中的質(zhì)粒、病毒、噬菌體、原病毒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子、人工染色體等等。載體還可以是非自主復(fù)制性的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、在同一鏈中包含DNA和RNA 二者的多核苷酸、聚賴(lài)氨酸偶聯(lián)的DNA或RNA、肽偶聯(lián)的DNA或RNA、脂質(zhì)體偶聯(lián)的DNA等等。在許多但不是所有的通常實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體是質(zhì)?；驐U粒(bacmid)。
[0121 ] 因此，本發(fā)明包括這樣的核苷酸，它們編碼HA、NA和/或Ml流感蛋白，克隆到能在細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)載體中，其中所述載體誘導(dǎo)VLP的形成?！氨磉_(dá)載體”是能夠促進(jìn)納入其中的核酸的表達(dá)和復(fù)制的載體，例如質(zhì)粒。典型地，要表達(dá)的核酸與啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子“可操作地連接”，并受該啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼來(lái)自禽流感病毒、大流行性流感病毒和 /或季候性流感病毒的HA的核苷酸選自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 和 H16。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼來(lái)自禽流感病毒、大流行性流感病毒和/或季候性流感病毒的NA的核苷酸選自N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體由編碼HA、NA和/或Ml流感蛋白的核苷酸組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體由編碼HA、NA和Ml流感蛋白的核苷酸組成。優(yōu)選的表達(dá)載體是桿狀病毒載體?？寺×司幋a所述流感蛋白的核苷酸之后，對(duì)所述核苷酸可以進(jìn)一步加以操作。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以突變編碼區(qū)的特定堿基來(lái)產(chǎn)生變體。變體可在編碼區(qū)、非編碼區(qū)或者編碼區(qū)和非編碼區(qū)二者中含有改變。這樣的變體可增加流感蛋白的免疫原性或去除蛋白或RNA中的剪接位點(diǎn)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，將流感M蛋白(全長(zhǎng))上的供體和受體剪接位點(diǎn)突變，以避免M mRNA被剪接成Ml和M2轉(zhuǎn)錄物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將HA工程化以去除或突變剪切位點(diǎn)。例如，野生型H5HA具有含多個(gè)堿性氨基酸的剪切位點(diǎn)(RRRKR)。該野生型序列使得HA對(duì)宿主中或表達(dá)這些HA的系統(tǒng)中可能存在的多種遍在蛋白酶更為敏感。在一個(gè)實(shí)施方案中，去除這些氨基酸可以降低HA對(duì)多種蛋白酶的敏感性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可突變?cè)摷羟形稽c(diǎn)以去除該剪切位點(diǎn)(例如突變成RESR)。
[0122]本發(fā)明還使用編碼NA、HA和Ml的核酸和多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，流感NA核酸或蛋白與 SEQ ID N01、ll、31、32、39、38、46、47、54 或 55 至少 85%、90%、95%、96%、97%、98% 或99%同一。在另一個(gè)實(shí)施方案中，流感HA核酸或蛋白與SEQ ID N02、10、56、57、58、27、28、29、30、37、36、33、34、35、42、43、44、45、50、51、52 或 53 至少 85%、90%、95%、96%、97%、98% 或99%同一。在另一個(gè)實(shí)施方案中，流感Ml核酸或蛋白與SEQ ID N012、40、41、48或49至少85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同一。
[0123]在一些實(shí)施方案中，突變包含這樣的變化:這些變化產(chǎn)生沉默的替換、添加或缺失，但不改變被編碼蛋白的性質(zhì)或活性或者生成這些蛋白的方式。可以出于多種原因而產(chǎn)生核苷酸變體，例如為了最優(yōu)化特定宿主的密碼子表達(dá)(將人mRNA中的密碼子改變?yōu)槔ハx(chóng)細(xì)胞例如Sf9細(xì)胞偏好的那些密碼子)。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利公布2005/0118191，本文通過(guò)提述收錄其全部?jī)?nèi)容用于所有目的。本發(fā)明的最優(yōu)化密碼子序列的例子在下文公開(kāi)(例如SEQID42、44、46、48、50、52 和 54)。
[0124]此外，可將核苷酸測(cè)序以保證克隆的是正確的編碼區(qū)，且不含有任何不希望的突變?？梢詫⑦@些核苷酸亞克隆到表達(dá)載體(例如桿狀病毒)中用于在任何細(xì)胞中表達(dá)。上文僅僅是如何克隆流感病毒蛋白的一個(gè)例子。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，其它方法也是可用和可能的。
[0125]本發(fā)明還提供這樣的構(gòu)建體和/或載體，其包含編碼流感病毒結(jié)構(gòu)基因包括NA、Ml和/或HA的禽類(lèi)、大流行性和/或季候性核苷酸。所述載體可以是例如噬菌體、質(zhì)粒、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。所述編碼禽流感病毒、大流行性流感病毒和/或季候性流感病毒結(jié)構(gòu)基因包括NA、M1和/或HA的構(gòu)建體和/或載體應(yīng)與合適的啟動(dòng)子可操作地連接，這樣的啟動(dòng)子的非限制性例子有諸如AcMNPV多角體蛋白啟動(dòng)子(或其它桿狀病毒)，λ噬菌體PL啟動(dòng)子，大腸桿菌(E.coli) lac、phoA和tac啟動(dòng)子、SV40早期和晚期啟動(dòng)子，和逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR的啟動(dòng)子。取決于希望的宿主細(xì)胞和/或表達(dá)率，本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道其它合適的啟動(dòng)子。表達(dá)構(gòu)建體將進(jìn)一步含有轉(zhuǎn)錄起始、終止位點(diǎn)，以及被轉(zhuǎn)錄區(qū)域中用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。所述構(gòu)建體所 表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物的編碼部分優(yōu)選在要翻譯的多肽的起始處包含翻譯起始密碼子，而在該多肽末尾處的合適位置上含有終止密碼子。[0126]表達(dá)載體優(yōu)選包含至少一種選擇標(biāo)記。這樣的標(biāo)記包括用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶、G418或新霉素抗性，以及用于培養(yǎng)大腸桿菌和其它細(xì)菌的四環(huán)素、卡那霉素或氨芐青霉素抗性基因。優(yōu)選的載體包括病毒載體，例如桿狀病毒、痘病毒(例如牛痘病毒、禽痘病毒(avipox virus)、金絲雀痘病毒、禽痘病毒、浣熊痘病毒、豬痘病毒等等)、腺病毒(例如犬腺病毒)、皰疹病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒?？捎糜诒景l(fā)明的其它載體包括用于細(xì)菌的載體，包括 pQE70、pQE60 和 pQE_9, pBluescript 載體，Phagescript 載體，pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223_3、pKK233_3、pDR540、pRIT5。優(yōu)選的真核載體包括 pFastBaclpWINEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl 和 pSG、pSVK3、pBPV、pMSG 和 pSVL。其它合適的載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述包含編碼禽流感病毒、大流行性流感病毒和/或季候性流感病毒結(jié)構(gòu)基因(包括HA、Ml和/或NA)的核苷酸的載體是pFastBac。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述包含由編碼禽流感病毒、大流行性流感病毒和/或季候性流感病毒結(jié)構(gòu)基因(包括HA、M1和/或NA)的核苷酸組成的插入片段的載體是pFastBacο
[0127]接下來(lái)，可以將重組載體轉(zhuǎn)染、感染或轉(zhuǎn)化到合適的宿主細(xì)胞中。由此，本發(fā)明提供這樣的宿主細(xì)胞:它們包含載體(或多個(gè)載體)，所述載體含有編碼HA、Ml和/或NA且容許HA、Ml和/或NA在可形成VLP的條件下于所述宿主細(xì)胞中表達(dá)的核酸。
[0128]在一個(gè)實(shí)施方案中，上述重組構(gòu)建體可以用來(lái)轉(zhuǎn)染、感染或轉(zhuǎn)化，并可以在真核細(xì)胞和/或原核細(xì)胞中表達(dá)HA、NA和Ml流感蛋白。真核宿主細(xì)胞包括酵母、昆蟲(chóng)、禽類(lèi)、植物、秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)(C.elegans)(或線(xiàn)蟲(chóng))和哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。昆蟲(chóng)細(xì)胞的非限制性例子有:草地夜蛾(Spodoptera frugiperda) (Sf)細(xì)胞、例如 Sf9> Sf21，粉紋夜蛾(Trichoplusiani)細(xì)胞，例如High Five細(xì)胞，和果蠅S2細(xì)胞。真菌(包括酵母)宿主細(xì)胞的例子有釀酒酵母(S.cerevisiae)、乳克魯維酵母(Kluyveromyces lactis;K.1actis)、假絲酵母屬(Candida)物種包括白色假絲酵母(C.albicans)和光滑假絲酵母(C.glabrata)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe; S.pombe)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、和解脂耶羅酵母(Yarrowia Iipolytica)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的例子有COS細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞、小鼠L細(xì)胞、LNCaP細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、人胚腎(HEK)細(xì)胞和非洲綠猴細(xì)胞、CVl細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、Vero和!fep-2細(xì)胞。非洲爪蟾(Xenopus Iaevi s)卵母細(xì)胞,或兩棲動(dòng)物來(lái)源的其它細(xì)胞也可以使用。原核宿主細(xì)胞包括細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和分枝桿菌。
[0129]可以將載體，例如包含HA、NA和/或Ml多核苷酸的載體根據(jù)本領(lǐng)域公知的技術(shù)轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。例如，可通過(guò)磷酸鈣共沉淀、電穿孔、顯微注射、脂轉(zhuǎn)染和利用多胺轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染來(lái)將核酸導(dǎo)入真核細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體是重組桿狀病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組桿狀病毒被轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是昆蟲(chóng)細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述昆蟲(chóng)細(xì)胞是Sf9細(xì)胞。
[0130]在另一實(shí)施方案中，所述載體和/或宿主細(xì)胞包含這樣的核苷酸:所述核苷酸編碼選自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 和 H16 的禽流感病
毒、大流行性流感病毒和/或季候性流感病毒HA蛋白。在另一實(shí)施方案中，所述載體和/或宿主細(xì)胞包含這樣的核苷酸:所述核苷酸編碼選自N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9的NA蛋白。在另一實(shí)施方案中，所述載體和/或宿主細(xì)胞包含流感HA、M1和/或NA。在另一實(shí)施方案中，所述載體和/或宿主細(xì)胞基本上由HA、Ml和/或NA組成。在又一實(shí)施方案中，所述載體和/或宿主細(xì)胞由包括HA、Ml和NA的流感蛋白組成。這些載體和/或宿主細(xì)胞包含HA、NA和M1，并可含有其它細(xì)胞組分諸如細(xì)胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質(zhì)、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了 M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一實(shí)施方案中，所述核苷酸編碼這樣的HA和/或NA:當(dāng)它們表達(dá)在VLP表面上時(shí)，分別展現(xiàn)血凝素活性和/或神經(jīng)氨酸酶活性。
[0131]本發(fā)明還提供將增加VLP產(chǎn)生效率的構(gòu)建體和方法。例如，去除蛋白質(zhì)中的剪切位點(diǎn)以增加蛋白質(zhì)表達(dá)(見(jiàn)上文)。其它方法包括向HA、NA和/或Ml蛋白添加前導(dǎo)序列以增加轉(zhuǎn)運(yùn)效率。例如，可將異源信號(hào)序列與HA、NA和/或Ml流感蛋白融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述信號(hào)序列可衍生自昆蟲(chóng)細(xì)胞的基因，且融合于流感HA蛋白(用于在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，信號(hào)肽是幾丁質(zhì)酶信號(hào)序列，其可在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中高效地工作。在其它實(shí)施方案中，在流感蛋白之間互相交換前導(dǎo)序列可提供更好的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。例如，已證明H5血凝素轉(zhuǎn)運(yùn)到顆粒表面的效率較低。而H9血凝素靶向表面和整合到表面中的效率更高。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，將H9前導(dǎo)序列與H5蛋白融合。
[0132]另一種增加VLP產(chǎn)生效率的方法是針對(duì)具體的細(xì)胞類(lèi)型對(duì)編碼HA、NA和/或Ml蛋白的核苷酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化。例如，為在Sf9細(xì)胞中表達(dá)而對(duì)核酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利公布2005/0118191，本文通過(guò)提述收錄其全部?jī)?nèi)容用于所有目的)。下文公開(kāi)了用于Sf9細(xì)胞的經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的序列的例子(例如SEQ ID42、44、46、48、50、52和54)。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的流感蛋白的核酸序列與SEQ ID N042、44、46、48、50、52和54的任一序列有至少85%、90%、95%、96、97、98或99%的同一性。
[0133]本發(fā)明還提供產(chǎn)生VLP的方法，所述方法包括在可形成VLP的條件下表達(dá)禽類(lèi)、大流行性和/或季候性流感蛋白。取決于所選的表達(dá)系統(tǒng)和宿主細(xì)胞，在表達(dá)重組蛋白和形成VLP的條件下培養(yǎng)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，來(lái)產(chǎn)生VLP。合適的培養(yǎng)條件的選擇在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的技術(shù)之內(nèi)。
[0134]培養(yǎng)經(jīng)過(guò)工程化而產(chǎn)生本發(fā)明VLP的細(xì)胞的方法包括但不限于分批、分批補(bǔ)料、連續(xù)和灌流(perfusio n)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)意思是在生物反應(yīng)器(發(fā)酵室)中使細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，其中細(xì)胞在生物反應(yīng)器中增殖并表達(dá)蛋白(例如重組蛋白)以供純化分離用。典型地，細(xì)胞培養(yǎng)在生物反應(yīng)器中無(wú)菌、溫度和大氣受控的條件下進(jìn)行。生物反應(yīng)器是用于培養(yǎng)細(xì)胞的腔室(chamber)，其中可以監(jiān)控環(huán)境條件例如溫度、大氣、攪拌和/或pH。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物反應(yīng)器是不銹鋼室。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物反應(yīng)器是預(yù)
滅菌的塑料袋(例如Cellbagi丸:，Wave Biotech, Bridgewater, NJ)。在另一實(shí)施方案中，所述預(yù)滅菌的塑料袋為大約50L到1000L的袋子。
[0135]然后用保持VLP完整性的方法來(lái)分離這些VLP，例如通過(guò)梯度離心，例如氯化銫、蔗糖和碘克沙醇(iodixanol)梯度離心，以及標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)，包括例如離子交換和凝膠過(guò)濾層析。
[0136]下面是如何制備、分離和純化本發(fā)明VLP的一個(gè)例子。通常VLP是由重組細(xì)胞系產(chǎn)生的，其中這些細(xì)胞系經(jīng)過(guò)工程化而在細(xì)胞培養(yǎng)(見(jiàn)上文)中生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生VLP?？梢岳脠D26所示的方案實(shí)現(xiàn)VLP的生產(chǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，可以使用其它的方法來(lái)制備和純化本發(fā)明的VLP，因此本發(fā)明不限于所述的方法。[0137]本發(fā)明的VLP的生產(chǎn)可首先將Sf9細(xì)胞(未感染的)接種到搖瓶中，使細(xì)胞隨著生長(zhǎng)繁殖而擴(kuò)增和規(guī)模放大(例如從125ml瓶到50L Wave袋)。培養(yǎng)細(xì)胞所用的培養(yǎng)基為合適的細(xì)胞系配制(優(yōu)選無(wú)血清培養(yǎng)基，例如昆蟲(chóng)培養(yǎng)基ExCel 1-420，JRH)。然后，用重組桿狀病毒以效率最高的感染復(fù)數(shù)(例如每個(gè)細(xì)胞約I個(gè)到約3個(gè)噬斑形成單位)感染所述細(xì)胞。一旦發(fā)生感染，流感HA、NA和Ml蛋白即從病毒基因組表達(dá)，自組裝成VLP，并在感染后大約24到72小時(shí)從細(xì)胞分泌出來(lái)。通常，當(dāng)細(xì)胞處于生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)中期(4-8X106個(gè)細(xì)胞/ml)且至少約90%生存時(shí)，感染效率最高。
[0138]可以在感染后大約48到96小時(shí)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)基中VLP水平接近最大值但尚未發(fā)生廣泛的細(xì)胞裂解之前收獲本發(fā)明的VLP。收獲時(shí)的Sf9細(xì)胞密度和生存力可以為:大約0.5X IO6個(gè)細(xì)胞/ml到大約1.5 X IO6個(gè)細(xì)胞/ml，生存力至少為20%，如染料排除測(cè)定所示。然后，移出培養(yǎng)基并將其澄清?？梢韵蚺囵B(yǎng)基中加入NaCl至濃度為大約0.4到大約1.0M,優(yōu)選到大約0.5M，以避免VLP聚集?？衫靡淮涡允褂玫念A(yù)滅菌中空纖維0.5或1.00 μ m筒式濾器或類(lèi)似的裝置進(jìn)行切向流過(guò)濾(TFF)，來(lái)從含有本發(fā)明VLP的細(xì)胞培養(yǎng)基中去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片。
[0139]接著，可以使用一次性使用的、預(yù)滅菌的500，000分子量截留中空纖維筒式濾器通過(guò)超濾來(lái)濃縮經(jīng)過(guò)澄清的培養(yǎng)基中的VLP?？梢詫⒔?jīng)過(guò)濃縮的VLP對(duì)10倍體積的含0.5MNaCl的pH7.0到8.0的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)滲濾來(lái)去除殘余的培養(yǎng)基成分。
[0140]可以將經(jīng)過(guò)濃縮、滲濾的VLP置于含0.5M NaCl的pH7.2PBS緩沖液中20%_60%不連續(xù)蔗糖梯度上，于大約4°C到大約10°C 6，500 Xg離心18小時(shí)來(lái)進(jìn)一步純化。通常，VLP將在大約30%到大約40%蔗糖之間或者在界面上(在20%和60%的分步梯度中)形成顯著可見(jiàn)的條帶，可從梯度中收集該條帶并保存。可稀釋該產(chǎn)物使其含有200mM NaCl,以準(zhǔn)備純化過(guò)程的下一步。該產(chǎn)物含有VLP，并可能含有完整的桿狀病毒顆粒。
[0141]可以通過(guò)陰離 子交換層析或者44%等密度鹿糖墊層(cushion)離心來(lái)進(jìn)一步純化VLP。在陰離子交換層析中，將來(lái)自蔗糖梯度(見(jiàn)上文)的樣品加載到裝有帶陰離子介質(zhì)(例如Matrix Fractogel EMD TMAE)的柱子中，并通過(guò)鹽梯度(從大約0.2M到大約1.0MNaCl)洗脫，該梯度可以將VLP與其它雜質(zhì)(例如桿狀病毒和DNA/RNA)分開(kāi)。在蔗糖墊層方法中，將含有VLP的樣品添加到44%蔗糖墊層，并在30，OOOg離心約18小時(shí)。VLP在44%蔗糖的頂部形成條帶，而桿狀病毒沉淀于底部，其它雜質(zhì)蛋白停留在頂部的0%蔗糖層中。收集VLP峰或VLP帶。
[0142]如果希望，可以將完整的桿狀病毒滅活?？梢酝ㄟ^(guò)化學(xué)方法，例如福爾馬林或β-丙內(nèi)酯(BPL)滅活。還可以主要使用本領(lǐng)域已知的選擇性沉淀和層析方法，如上文例舉的，來(lái)實(shí)現(xiàn)完整桿狀病毒的去除和/或滅活。滅活方法包括將含有VLP的樣品在0.2%BPL中于大約25°C到大約27°C溫育3小時(shí)。還可以將含有VLP的樣品在0.05%BPL于4°C溫育3天，然后在37°C溫育I小時(shí)，來(lái)滅活桿狀病毒。
[0143]滅活/去除步驟后，可使含有VLP的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)另一滲濾步驟以去除任何來(lái)自滅活步驟的試劑和/或任何殘余的蔗糖，并將VLP置入期望的緩沖液(例如PBS)中。含有VLP的溶液可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法(例如無(wú)菌過(guò)濾)滅菌，并保存在冰箱或低溫冰箱中。
[0144]上述技術(shù)可以在多種 規(guī)模上實(shí)施。例如，T形瓶(T-flasks)、搖瓶、轉(zhuǎn)瓶、乃至工業(yè)級(jí)容量的生物反應(yīng)器。生物反應(yīng)器可包括不銹鋼槽或預(yù)滅菌的塑料袋(例如，WaveBiotech, Bridgewater, NJ出售的系統(tǒng))。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道用于其目的的最佳選擇。
[0145]桿狀病毒表達(dá)載體的擴(kuò)增和生產(chǎn)，以及用重組桿狀病毒感染細(xì)胞以生產(chǎn)重組流感VLP，可以在昆蟲(chóng)細(xì)胞，例如前文所述的Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是用產(chǎn)生流感VLP的工程化重組桿狀病毒感染的SF9細(xì)胞。
[0146]藥物或疫苗制劑和施用
[0147]本文中有用的藥物組合物含有可藥用載體和本發(fā)明的VLP，其中所述載體，包括任何合適的稀釋劑或賦形劑，包括本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)接受該組合物的脊椎動(dòng)物有害的免疫應(yīng)答、并且可以在不引起任何異常毒性的條件下施用的任何藥劑。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“可藥用”意思是經(jīng)過(guò)聯(lián)邦或州政府監(jiān)管部門(mén)批準(zhǔn)，或者在美國(guó)藥典、歐洲藥典或其它公認(rèn)的藥典中記載用于脊椎動(dòng)物，更具體地用于人類(lèi)中。這些組合物可以用作疫苗和/或抗原性組合物，用于在脊椎動(dòng)物中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答。
[0148]所述本發(fā)明的藥物制劑包括含流感Ml、HA和/或NA蛋白的VLP和可藥用的載體或賦形劑。可藥用載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、無(wú)菌等滲緩沖水溶液，和它們的組合。Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub.C0.N.J.current edition)提供了可藥用載體、稀釋劑和其它賦形劑的全面討論。制劑必須適合施用模式。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，制劑適于施用給人，優(yōu)選制劑是無(wú)菌、非顆粒性(non-particulate)和/或非熱原性的。
[0149]如果期望，組合物還可以含有次要量的潤(rùn)濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑。組合物可以是固體形式，例如適于重構(gòu)的凍干粉末；液體溶液；懸液；乳液；片劑；丸劑；膠囊；持續(xù)釋放制劑；或粉劑?？诜苿┛砂瑯?biāo)準(zhǔn)的載體，例如藥品級(jí)的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等等。
[0150]本發(fā)明還提供藥包(pharmaceutical pack)或試劑盒(kit);其包含一個(gè)或多個(gè)容器，所述容器裝有本發(fā)明疫苗制劑的一種或多種成分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒包含兩個(gè)容器， 其一裝有VLP，另一個(gè)裝有佐劑。所述容器還可以伴有通告，該通告采取由監(jiān)管藥品或生物制品的生產(chǎn)、使用或銷(xiāo)售的政府部門(mén)規(guī)定的形式，反映該部門(mén)對(duì)為人體施用而生產(chǎn)、使用或銷(xiāo)售的許可。
[0151]本發(fā)明還提供VLP制劑包裝在標(biāo)示組合物數(shù)量的密封容器例如安瓿或小藥囊(sachette)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，VLP組合物作為液體提供，在另一個(gè)實(shí)施方案中，作為密封容器中的干燥無(wú)菌凍干粉末或無(wú)水濃縮物提供，并且可以例如用水或鹽水重構(gòu)為供施用于受試者的合適濃度。優(yōu)選地，VLP組合物作為密封容器中的干燥無(wú)菌凍干粉末提供，單位劑量?jī)?yōu)選為大約I P g、大約5 μ g、大約10 μ g、大約20 μ g、大約25 μ g、大約30 μ g、大約50 μ g、大約100 μ g、大約125 μ g、大約150 μ g或大約200 μ g。或者，VLP組合物的單位劑量小于約I μ g(例如大約0.08 μ g,大約0.04 μ g ;大約0.2 μ g、大約0.4 μ g、大約0.8 μ g、大約0.5 μ g或更少、大約0.25 μ g或更少，或大約0.1 μ g或更少)，或多于大約125 μ g (例如大約150 μ g或更多、大約250 μ g或更多、或大約500 μ g或更多)。這些劑量可以以總VLP或HA的μ g數(shù)測(cè)量。VLP組合物應(yīng)當(dāng)在自?xún)龈煞勰┲貥?gòu)后大約12小時(shí)內(nèi)、優(yōu)選約6小時(shí)內(nèi)、約5小時(shí)內(nèi)、約3小時(shí)內(nèi)、或約I小時(shí)內(nèi)施用。
[0152]在一個(gè)作為選擇的實(shí)施方案中，VLP組合物作為標(biāo)示VLP組合物的數(shù)量和濃度的密封容器中的液體形式提供。優(yōu)選地，VLP組合物在密封容器中以至少約50μ g/ml、優(yōu)選至少約100 μ g/ml、至少約200 μ g/ml、至少500 μ g/ml、或至少lmg/ml的濃度提供。
[0153]通常，本發(fā)明的流感VLP以足以刺激針對(duì)一種或多種流感病毒株的免疫應(yīng)答的有效量或數(shù)量(如上文定義的)施用。優(yōu)選地，施用本發(fā)明的VLP引發(fā)針對(duì)至少一種流感病毒的顯著的免疫力。典型地，可以根據(jù)例如年齡、身體健康狀況、體重、性別、飲食、施用時(shí)間和其它臨床因素，在該范圍內(nèi)調(diào)節(jié)該劑量。預(yù)防性疫苗制劑是全身施用的，例如通過(guò)使用針頭和注射器或無(wú)針頭注射裝置進(jìn)行皮下或肌肉內(nèi)注射來(lái)施用。或者，疫苗制劑是鼻內(nèi)施用的，通過(guò)滴劑、大顆粒氣溶膠(大于約10微米)、或噴霧到上呼吸道中。雖然上述任何投遞途徑均產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但鼻內(nèi)施用還帶來(lái)額外的益處，即在流感病毒進(jìn)入的部位引發(fā)粘膜免疫。
[0154]由此，本發(fā)明還包括誘導(dǎo)受試者中針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著免疫力的疫苗或抗原性組合物的配制方法，包括對(duì)所述制劑添加有效劑量的流感VLP。
[0155]雖然優(yōu)選的是以單個(gè)劑量刺激顯著的免疫力，但可以通過(guò)相同或不同的途徑施用額外的劑量來(lái)達(dá)到所需效果。例如，在新生兒和嬰兒中，可能需要多次施用來(lái)引發(fā)足夠的免疫水平。根據(jù)維持足夠水平的抗流感感染保護(hù)的需要，可以在整個(gè)兒童期以一定間隔繼續(xù)進(jìn)行施用。類(lèi)似地，特別容易受到反復(fù)或嚴(yán)重的流感感染的成年人，例如衛(wèi)生保健工作者、日間護(hù)理工作者、幼兒的家人、老年人、以及心肺功能受損的個(gè)體等，可能需要進(jìn)行多次免疫來(lái)建立和/或維持保護(hù)性免疫應(yīng)答?？梢酝ㄟ^(guò)例如測(cè)量中和性分泌和血清抗體的量來(lái)監(jiān)測(cè)誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫力的水平，并根據(jù)引發(fā)和維持期望的保護(hù)水平的需要來(lái)調(diào)整劑量或重復(fù)接種。
[0156]因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，誘發(fā)受試者中針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著免疫力的方法包括施用至少一個(gè)有效劑量的流感VLP，其中所述VLP包含流感HA、NA和Ml蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，誘發(fā)受試者中針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著免疫力的方法包括施用至少一個(gè)有效劑量的流感VLP，其中所述VLP基本上由流感HA、NA和Ml組成。所述VLP可包含可忽略濃度的其它流感蛋白和/或蛋白雜質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，誘發(fā)受試者中針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著免疫力的方法包括施用至少一個(gè)有效劑量的流 感VLP，其中所述VLP由流感HA、NA和Ml組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感HA、NA和Ml衍生自季候性流感和/或禽流感病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，誘發(fā)受試者中針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著免疫力的方法包括施用至少一個(gè)有效劑量的包含流感蛋白的流感VLP，其中所述流感蛋白由HA、NA和Ml蛋白組成。這些VLP包含HA、NA和Ml，并可含有其它細(xì)胞組分諸如細(xì)胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質(zhì)、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了 M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述HA和/或NA分別展現(xiàn)血凝素活性和/或神經(jīng)氨酸酶活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者是哺乳動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是人。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括通過(guò)以一個(gè)劑量施用所述制劑而誘發(fā)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括通過(guò)以多個(gè)劑量施用所述制劑而誘發(fā)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力。
[0157]包含VLP的組合物(疫苗和/或抗原性制劑)的施用方法包括，但不限于，非消化道施用(例如皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮下)、硬膜外、和粘膜(例如鼻內(nèi)和口腔或肺途徑或通過(guò)栓劑)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物通過(guò)肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、透皮或皮內(nèi)施用。組合物可以通過(guò)任何方便 的途徑施用，例如通過(guò)輸注或推注，通過(guò)經(jīng)由上皮或粘膜皮膚襯里(例如口腔粘膜、結(jié)腸、結(jié)膜、鼻咽、口咽、陰道、尿道、膀胱和腸粘膜等)的吸收，并且可以與其它生物學(xué)活性劑一起施用。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明含VLP組合物的鼻內(nèi)或其它粘膜施用途徑所誘發(fā)的抗體或其它免疫應(yīng)答可顯著高于其它施用途徑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明含VLP組合物的鼻內(nèi)或其它粘膜施用途徑可誘發(fā)這樣的抗體或其它免疫應(yīng)答，所述應(yīng)答將誘發(fā)針對(duì)其它流感病毒株的交叉保護(hù)。施用可以是全身性的或者是局部的。
[0158]在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述疫苗和/或抗原性制劑以這樣的方式施用，使得其靶向粘膜組織，以在免疫部位引發(fā)免疫應(yīng)答。例如，可以通過(guò)口服含有具備特定粘膜靶向性質(zhì)的佐劑的組合物，來(lái)靶向粘膜組織例如腸相關(guān)淋巴樣組織(GALT)進(jìn)行免疫。還可以靶向其它粘膜組織，例如鼻咽淋巴樣組織(NALT)和支氣管相關(guān)淋巴樣組織(BALT)。
[0159]本發(fā)明的疫苗和/或抗原性制劑還可以按照劑量日程表(dosage schedule)來(lái)施用，例如用疫苗組合物進(jìn)行一次初次施用，隨后進(jìn)行多次加強(qiáng)施用。在具體的實(shí)施方案中，第二個(gè)劑量的組合物在初次施用后大約兩周到一年，優(yōu)選約I個(gè)月、約2個(gè)月、約3個(gè)月、約4個(gè)月、約5個(gè)月到約6個(gè)月施用。進(jìn)一步，可以在第二個(gè)劑量之后，且在初次施用后大約3個(gè)月到大約兩年甚至更長(zhǎng)時(shí)間，優(yōu)選約4個(gè)月、約5個(gè)月、或者約6個(gè)月、或者約7個(gè)月到約I年施用第三個(gè)劑量。當(dāng)施用第二個(gè)劑量后在受試者的血清和/或尿或者粘膜分泌物中沒(méi)有檢測(cè)到或者檢測(cè)到低水平的特異性免疫球蛋白時(shí)，可任選地施用第三個(gè)劑量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二個(gè)劑量在第一次施用后大約I個(gè)月施用，而第三個(gè)劑量在第一次施用后大約6個(gè)月施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二個(gè)劑量在第一次施用后大約6個(gè)月施用。
[0160]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述本發(fā)明的VLP可用作為聯(lián)合療法的一部分施用。例如，本發(fā)明的VLP可以與其它免疫原性組合物和/或抗病毒劑(例如金剛烷胺(Amantadine)、金剛乙胺(Rimantadine)、扎那米韋(Zanamivir)和奧塞米韋(Osteltamivir))共同配制。
[0161]本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定藥物制劑的劑量，例如通過(guò)首先鑒定可有效引發(fā)預(yù)防性或治療性免疫應(yīng)答的劑量，例如通過(guò)測(cè)量病毒特異性免疫球蛋白的血清效價(jià)或通過(guò)測(cè)量血清樣品或尿樣品或粘膜分泌物中抗體的抑制比。所述劑量可以由動(dòng)物研究確定。用于研究流感病毒的動(dòng)物的非限制性清單包括豚鼠、敘利亞地鼠(Syrian hamster)、栗鼠(chinchilla)、刺 猬、雞、大鼠、小鼠和雪貂(ferret)。大多數(shù)動(dòng)物不是流感病毒的天然宿主，但仍可用于該疾病的各個(gè)方面的研究。例如，可以對(duì)任何上述動(dòng)物定量給予疫苗候選物，例如本發(fā)明的VLP，以部分地表征誘發(fā)的免疫應(yīng)答，和/或確定是否生成了任何中和性抗體。例如，已經(jīng)在小鼠模型中進(jìn)行了許多研究，因?yàn)樾∈篌w型小，而且它們的成本低使得研究者可以進(jìn)行大規(guī)模研究。但是，小鼠的小體型也增加了迅捷觀察任何疾病臨床體征的難度，而且小鼠不是人類(lèi)中疾病的預(yù)測(cè)性模型。
[0162]雪貂已經(jīng)廣泛地用于人流感病毒感染及其作用過(guò)程的各個(gè)方面的研究。如果沒(méi)有雪貂的應(yīng)用，對(duì)流感病毒免疫的許多現(xiàn)代概念的發(fā)展是不可能的(Maher et al.2004)。已經(jīng)證明雪貂是研究流感的良好模型，原因有如下數(shù)方面:就臨床體征、發(fā)病機(jī)制和免疫力而言，雪貂中的流感感染非常近似于人中的流感感染；人類(lèi)甲型和乙型流感病毒天然地感染雪貂，從而使人們有機(jī)會(huì)對(duì)完全受控的群體進(jìn)行研究以觀察感染傳播、疾病和流感病毒糖蛋白中氨基酸序列變異之間的相互影響；而且雪貂還具有其它使其成為解析該疾病表現(xiàn)的理想模型的體質(zhì)特征。例如，雪貂和人顯示非常近似的流感感染臨床體征，這些體征看起來(lái)依賴(lài)于宿主年齡、病毒株、環(huán)境條件、繼發(fā)細(xì)菌感染的程度和其它許多變量。因此，相比于小鼠或者上述其它任何模型，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以更容易地將來(lái)自雪貂模型的流感疫苗的效力與劑量方案與人相關(guān)聯(lián)。
[0163]此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行人體臨床研究來(lái)確定用于人的優(yōu)選有效劑量。這樣的臨床研究是常規(guī)的，且為本領(lǐng)域公知。要使用的確切劑量還將依賴(lài)于施用途徑?？梢詮难苌泽w外或動(dòng)物試驗(yàn)系統(tǒng)的劑量-應(yīng)答曲線(xiàn)外推得到有效劑量。
[0164]本領(lǐng)域還公知，可以使用免疫應(yīng)答的非特異性刺激物來(lái)增強(qiáng)具體組合物的免疫原性，這樣的刺激物稱(chēng)為佐劑。實(shí)驗(yàn)上已經(jīng)使用佐劑來(lái)促進(jìn)針對(duì)未知抗原的免疫力的普遍增加(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利N0.4，877，611)。免疫規(guī)程使用佐劑來(lái)刺激應(yīng)答已有多年，因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)佐劑是熟知的。有些佐劑影響抗原呈遞的方式。例如，當(dāng)?shù)鞍卓乖幻鞯\沉淀時(shí)，免疫應(yīng)答增加?？乖娜榛部裳娱L(zhǎng)抗原呈遞的持續(xù)時(shí)間。本發(fā)明的范圍意圖涵蓋Vogel 等人“A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2nd Edition),，，(本文通過(guò)提述收錄該文獻(xiàn)全部?jī)?nèi)容用于所有目的)中所述任何佐劑的引入。
[0165]示例性的佐劑包括完全弗氏佐劑(一種非特異性免疫應(yīng)答刺激物，含有已殺死的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis))、不完全弗氏佐劑和氫氧化招佐劑。其它佐劑包括GMCSP、BCG、氫氧化鋁、MDP化合物諸如thur_MDP和nor_MDP、CGP (MTP-PE)、脂質(zhì)A和單磷酰脂質(zhì)A(MPL)。還設(shè)想使用RIBI，其在2%角鯊烯/TWeen80乳液中含有從細(xì)菌提取的3種成分:MPL、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)。還可以使用MF-59、Novasomes?, MHC 抗原。
[0166]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑是少片層(paucilamellar)脂質(zhì)小泡,其具有大約2到10個(gè)雙層，它們排列成多個(gè)基本呈球形的殼，由水性層隔開(kāi)，圍繞著不含脂質(zhì)雙層的無(wú)定形中心大空腔。少片層脂質(zhì)小泡可以通過(guò)數(shù)種方式起作用來(lái)刺激免疫應(yīng)答:作為非特異性刺激物、作為抗原載體、作為其它佐劑的載體，以及這些方式的組合。例如，當(dāng)通過(guò)混合抗原與預(yù)先形成的小泡，使得抗原相對(duì)于小泡保持在胞外(extracellular)的方法制備疫苗時(shí)，少片層脂質(zhì)小泡起非特異性免疫刺激物的作用。通過(guò)將抗原包被在小泡的中心空腔中，小泡起到免 疫刺激物和抗原載體兩方面的作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，小泡主要由非磷脂小泡構(gòu)成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，小泡是Novasomes。Novasomes?是大約IOOnm到大約500nm范圍的少片層非磷脂小泡。它們包含Bri j72、膽固醇、油酸和角鯊烯。Novasomes已被證明是流感抗原的有效佐劑(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5，629，021,6, 387，373和4，911，928，本文通過(guò)提述收錄它們的全部?jī)?nèi)容用于所有目的)。
[0167]在一個(gè)方面，使用藥劑來(lái)達(dá)到佐劑的效果，例如使用明礬，其以磷酸鹽緩沖鹽水中大約0.05到大約0.1%的溶液使用。或者，VLP可以制成與合成糖聚合物(Carbopol?)的混
合物，所述聚合物以大約0.25%的溶液使用。有些佐劑，例如某些從細(xì)菌獲得的有機(jī)分子，作用于宿主而非抗原。一個(gè)例子是胞壁酰二肽(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺[MDP]),—種細(xì)菌肽聚糖。在其它實(shí)施方案中，血藍(lán)蛋白和血紅蛋白(hemoerythrin)也可與本發(fā)明的VLP—起使用。在某些實(shí)施方案中優(yōu)選使用來(lái)自鑰孔I戚的血藍(lán)蛋白(KLH)，但可以使用其它軟體動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白和血紅蛋白。
[0168]還可以使用各種多糖佐劑。例如，各種肺炎球菌多糖佐劑對(duì)小鼠抗體應(yīng)答的效用已經(jīng)有描述(Yin et al., 1989) 0產(chǎn)生最佳應(yīng)答的劑量或者在其它方面不產(chǎn)生抑制的劑量應(yīng)當(dāng)如指示地使用(Yin et al.，1989)。多糖的多胺變化形式是特別優(yōu)選的,例如幾丁質(zhì)和殼聚糖，包括脫乙酰幾丁質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，胞壁酰二肽的親脂性雙糖-三肽衍生物描述用于由磷脂酰膽堿和磷脂酰甘油形成的人工脂質(zhì)體中。
[0169]兩親性物質(zhì)和表面活性物質(zhì),例如阜苷和衍生物例如QS21 (Cambridge Biotech)構(gòu)成用于本發(fā)明的VLP的另一類(lèi)佐劑。非離子型嵌段共聚物表面活性劑(Rabinovich etal.，1994)也可以使用。寡核苷酸是另一類(lèi)有用的佐劑(Yamamoto et al.，1988)。Quil A和香菇多糖(Ientinen)是其它可用于本發(fā)明某些實(shí)施方案中的佐劑。
[0170]另一類(lèi)佐劑是脫毒的內(nèi)毒素，例如美國(guó)專(zhuān)利N0.4，866，034的精制脫毒內(nèi)毒素。這些精制脫毒內(nèi)毒素可在脊椎動(dòng)物中有效產(chǎn)生佐劑應(yīng)答。當(dāng)然，脫毒內(nèi)毒素可以與其它佐劑組合使用以制備多佐劑制劑。例如，特別考慮脫毒內(nèi)毒素與海藻糖二霉菌酸酯的組合，如美國(guó)專(zhuān)利N0.4，435，386所述的。還考慮脫毒內(nèi)毒素與海藻糖二霉菌酸酯和內(nèi)毒素糖脂的組合(美國(guó)專(zhuān)利N0.4，505，899)，以及脫毒內(nèi)毒素與細(xì)胞壁骨架(CWS)的組合或者與CWS和海藻糖二霉菌酸酯的組合，如美國(guó)專(zhuān)利N0.4，436，727,4, 436，728和4，505，900所述的。我們預(yù)想，僅有CWS和海藻糖二霉菌酸酯而無(wú)脫毒內(nèi)毒素的組合也是有用的，如美國(guó)專(zhuān)利N0.4，520,019 中所述的。
[0171]本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)知道能夠與根據(jù)本發(fā)明的疫苗偶聯(lián)的不同種類(lèi)的佐劑，這些包括烷基溶血磷脂(ALP) ;BCG;和生物素(包括生物素化的衍生物)，以及其它。本文特別考慮使用的某些佐劑有來(lái)自革蘭氏細(xì)胞(Gram-cells)的磷壁酸。這些包括脂磷壁酸(lipoteichoic acids, LTA)、核糖醇憐壁酸(ribitol teichoic acids, RTA)和甘油憐壁酸(glycerol teichoic acid, GTA)。它們的合成對(duì)應(yīng)物的活性形式也可以用于本發(fā)明(Takada et al., 1995)。
[0172]例如，如果希望激發(fā)抗體或隨后獲得活化T細(xì)胞，多種佐劑，即使是那些通常不用于人的佐劑，仍可用于其它脊椎動(dòng)物。佐劑或細(xì)胞可能造成的毒性或其它不良作用，例如使用未受照射的腫瘤細(xì)胞時(shí)可能發(fā)生的毒性或其它不良作用，在此情況下是不相干的。
[0173]另一種 誘發(fā)免疫應(yīng)答的方法可以通過(guò)將本發(fā)明的VLP與“免疫刺激物” 一起配制來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些“免疫刺激物”是身體自有的增加免疫系統(tǒng)應(yīng)答的化學(xué)信使(細(xì)胞因子)。免疫刺激物包括但不限于具有免疫刺激性、免疫強(qiáng)化和促炎癥活性的各種細(xì)胞因子、淋巴因子和趨化因子，例如白細(xì)胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL_4、IL-12、IL-13);生長(zhǎng)因子(例如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞(GM)集落刺激因子(CSF));和其它免疫刺激性分子，例如巨噬細(xì)胞炎性因子，F(xiàn)lt3配體、B7.1、B7.2等等。免疫刺激性分子可以與流感VLP在相同的制劑中施用，或者可以另行施用?？梢允┯玫鞍踪|(zhì)或者編碼該蛋白質(zhì)的表達(dá)載體來(lái)產(chǎn)生免疫刺激效應(yīng)。
[0174]刺激抗流感免疫應(yīng)答的方法
[0175]本發(fā)明的VLP可用于制備刺激免疫應(yīng)答的組合物，所述免疫應(yīng)答賦予針對(duì)流感病毒的免疫力或顯著的免疫力。粘膜免疫和細(xì)胞免疫均可貢獻(xiàn)于抗流感感染和疾病的免疫力。在上呼吸道中局部分泌的抗體是針對(duì)自然感染的抗性中的主要因素。分泌型免疫球蛋白A(sIgA)參與上呼吸道的保護(hù),血清IgG參與下呼吸道的保護(hù)。感染所誘發(fā)的免疫應(yīng)答抵御同一病毒或抗原性類(lèi)似的病毒株的再次感染。流感病毒頻繁發(fā)生不可預(yù)測(cè)的變化，因此，自然感染后，宿主免疫提供的針對(duì)人群中流行的新病毒株的有效保護(hù)期可能僅有數(shù)年。[0176]本發(fā)明的VLP當(dāng)施用于脊椎動(dòng)物(例如人)時(shí)可以在所述脊椎動(dòng)物中誘發(fā)顯著的免疫力。顯著的免疫力由針對(duì)本發(fā)明的流感VLP的免疫應(yīng)答導(dǎo)致，在所述脊椎動(dòng)物中保護(hù)或改善流感病毒感染或者至少減輕流感病毒感染的癥狀。在一些情況下，如果所述脊椎動(dòng)物被感染，所述感染將是無(wú)癥狀的。所述應(yīng)答可能不是完全保護(hù)性的應(yīng)答。在此情況下，如果所述脊椎動(dòng)物感染了流感病毒，該脊椎動(dòng)物與未經(jīng)免疫的脊椎動(dòng)物相比將經(jīng)歷減輕的癥狀或者較短的癥狀持續(xù)時(shí)間。
[0177]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括誘發(fā)受試者體內(nèi)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法，包括施用至少一個(gè)有效劑量的流感VLP。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述顯著的免疫力的誘導(dǎo)減少流感癥狀的持續(xù)時(shí)間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，誘發(fā)受試者體內(nèi)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法包括施用至少一個(gè)有效劑量的流感VLP，其中所述VLP包含流感HA、NA和Ml蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由HA、NA和Ml蛋白構(gòu)成。這些VLP含有HA、NA和M1，并可含有其它細(xì)胞組分諸如細(xì)胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質(zhì)、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了 M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，誘發(fā)受試者體內(nèi)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法包括施用至少一個(gè)有效劑量的流感VLP，其中所述VLP基本上由HA、NA和Ml組成。所述VLP可包含可忽略濃度的其它流感蛋白和/或蛋白雜質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，誘發(fā)受試者體內(nèi)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法包括施用至少一個(gè)有效劑量的流感VLP，其中所述VLP由流感HA、NA和Ml組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述HA和/或NA分別展現(xiàn)血凝素活性和/或神經(jīng)氨酸酶活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者是哺乳動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是人。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述VLP與佐劑或免疫刺激物一起配制。
[0178]最近，人們共同致力于構(gòu)建針對(duì)具有產(chǎn)生大流行潛力的禽流感病毒的疫苗。這是因?yàn)槎喾N禽流感病毒已經(jīng)跨越了物種屏障而直接感染了人類(lèi)，使人患病，而且在一些情況下導(dǎo)致死亡。這些病毒是H5N1、H9N2和H7N7(Cox et al.，2004)。最近一項(xiàng)研究考察了使用滅活H5N1流感病毒作為疫苗的潛力。該疫苗的配方與現(xiàn)有已許可上市的許可滅活疫苗相似。該研究的結(jié)論是使用滅活的H5N1病毒的確在人類(lèi)中誘導(dǎo)了免疫應(yīng)答，但所給的劑量很高(90 μ g禽流感,相比于 15 μ g的許可疫苗)(Treanor et al.，2006)。大量的禽流感抗原對(duì)于世界范圍的接種計(jì)劃而言是不切實(shí)際的。如下文說(shuō)明的，本發(fā)明的VLP當(dāng)施用于脊椎動(dòng)物時(shí)在所述脊椎動(dòng)物中誘發(fā)免疫應(yīng)答。
[0179]因此，本發(fā)明涵蓋誘發(fā)受試者體內(nèi)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法，包括施用至少一個(gè)有效劑量的禽流感VLP。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述顯著的免疫力的誘發(fā)減少流感癥狀的持續(xù)時(shí)間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫力的誘發(fā)是來(lái)自施用含至少0.2 μ g禽類(lèi)HA的本發(fā)明VLP。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫力的誘發(fā)是來(lái)自施用含至少0.2 μ g禽類(lèi)HA到至少15 μ g禽類(lèi)HA的本發(fā)明VLP。施用可以分為一個(gè)或更多個(gè)劑量進(jìn)行，但有利的是以一個(gè)劑量進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VLP禽類(lèi)HA衍生自禽流感H5N1。
[0180]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括誘發(fā)受試者體內(nèi)針對(duì)禽流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法，包括施用至少一個(gè)有效劑量的禽流感VLP，其中所述VLP包含禽流感HA、NA和Ml。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，所述禽流感VLP包含禽流感蛋白，其中所述禽流感蛋白由HA、NA和Ml蛋白組成。這些VLP含有HA、NA和Ml，并可含有其它細(xì)胞組分諸如細(xì)胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質(zhì)、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了 Ml、HA和/或NA的片段之外)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述誘發(fā)受試者體內(nèi)針對(duì)禽流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法包括施用至少一個(gè)有效劑量的禽流感VLP，其中所述VLP基本上由禽流感HA、NA和Ml組成。所述VLP可包含可忽略濃度的其它流感蛋白和/或蛋白雜質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述誘發(fā)受試者體內(nèi)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法包括施用至少一個(gè)有效劑量的流感VLP，其中所述VLP由禽流感HA、NA和Ml蛋白組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述禽流感HA和NA分別是H5N1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述禽流感HA和NA分別是H9N2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述禽流感HA和NA分別是H7N7。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述禽流感HA和/或NA分別展現(xiàn)血凝素活性和/或神經(jīng)氨酸酶活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者是哺乳動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是人。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述VLP與佐劑或免疫刺激物一起配制。
[0181]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述禽流感VLP在脊椎動(dòng)物中誘發(fā)的免疫應(yīng)答，與配制方式類(lèi)似于現(xiàn)有許可上市的許可滅活疫苗的相似禽流感抗原相比，效力增加到大約2倍，大約4倍，大約8倍，大約16倍，大約32倍，大約64倍，大約128倍(或更高)?，F(xiàn)有制劑包括全滅活病毒(例如甲醛處理的)疫苗、裂解(split)病毒(化學(xué)性破壞的)疫苗、和亞單位(純化糖蛋白)疫苗。確定疫苗效力的方法在本領(lǐng)域是已知和常規(guī)的。例如，可進(jìn)行微中和測(cè)定和凝血抑制測(cè)定來(lái)確定禽類(lèi)VLP疫苗相對(duì)于配制方式類(lèi)似于現(xiàn)有許可上市的許可滅活疫苗的禽流感抗原的效力。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)對(duì)脊椎動(dòng)物施用大約0.2μ g、大約0.4 μ g、大約0.6 μ g、大約0.8 μ g、大約I μ g、大約2 μ g、大約3 μ g、大約4 μ g、大約5 μ g、大約6 μ g、大約7 μ g、大約9 μ g、大約10 μ g、大約15 μ g、大約20 μ g、大約25 μ g、大約30 μ g、大約35 μ g、40 μ g、大約45 μ g、大約50 μ g或更多的VLP和配制方式類(lèi)似于現(xiàn)有許可上市滅活疫苗的抗原(即:VLP中相當(dāng)量的HA和/或NA，和以配制方式類(lèi)似于許可滅活疫苗和/或任何其它抗原的相當(dāng)量的HA和/或NA)時(shí)，實(shí)現(xiàn)上述效力增加。可以根據(jù)HA含量來(lái)測(cè)量。例如，I μ g的本發(fā)明VLP為含HA的VLP溶液中的I μ g HA或者可以VLP重量測(cè)量。
[0182]人們每年接受季候性流感疫苗以減少每年流感病例的發(fā)生。目前，在美國(guó)有兩種亞型的甲型流 感和乙 型流感流行。因此，現(xiàn)有疫苗是三價(jià)的，以提供針對(duì)流行中病毒株的保護(hù)。每年不同的流感病毒株或流感病毒變體改變。因此，大多數(shù)年份中制造并施用新疫苗組合物。滅活疫苗是通過(guò)在含胚雞蛋中擴(kuò)增病毒來(lái)生產(chǎn)的。采集尿囊液，濃縮并純化病毒后加以滅活。因此，現(xiàn)有的許可流感病毒疫苗可能含有痕量的殘余卵蛋白，因此不應(yīng)給予對(duì)蛋有過(guò)敏性超敏反應(yīng)的人。此外，蛋的供應(yīng)必須是有組織的，而且用于生產(chǎn)疫苗的病毒株必須在下一個(gè)流感季候前數(shù)個(gè)月選定，這樣就限制了該方法的靈活性，經(jīng)常導(dǎo)致生產(chǎn)和分配的遲延和短缺。而且，一些流感病毒株在含胚雞蛋中復(fù)制不好，這可能對(duì)能夠生長(zhǎng)并配制成疫苗的流感病毒株構(gòu)成限制。
[0183]如上所述，本發(fā)明VLP的生產(chǎn)不需要蛋。這些VLP是藉由細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)制備的。因此，本發(fā)明涵蓋誘發(fā)受試者體內(nèi)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法，包括施用至少一個(gè)有效劑量的季候性流感VLP。如上文討論的，季候性流感病毒是指就某一流感季候而言，已根據(jù)全球各國(guó)家流感中心進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查確定為正在人群內(nèi)傳播的流感病毒株。所述研究結(jié)果以及某些分離的流感病毒被送到世界衛(wèi)生組織(WHO)的四個(gè)參考實(shí)驗(yàn)室之一以進(jìn)行詳細(xì)研究，其中一個(gè)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置在亞特蘭大的疾病控制和預(yù)防中心(⑶C)。這些實(shí)驗(yàn)室測(cè)試針對(duì)現(xiàn)有疫苗制備的抗體與流行中的病毒和新流感病毒反應(yīng)的良好程度。將該信息和有關(guān)流感活動(dòng)情況的信息匯總并提交到美國(guó)食品和藥品管理局(FDA)的一個(gè)顧問(wèn)委員會(huì)以及WHO的會(huì)議上。這些會(huì)議的結(jié)果是選擇三種病毒(甲型流感病毒的兩個(gè)亞型和乙型流感病毒的一個(gè)亞型)進(jìn)入用于下個(gè)秋季和冬季的流感疫苗。該選擇在北半球于2月份進(jìn)行，在南半球于9月份進(jìn)行。通常，每年改變疫苗中三種病毒株中的一種或兩種。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述顯著的免疫力的誘導(dǎo)減少流感癥狀的持續(xù)時(shí)間。
[0184]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包含誘發(fā)受試者體內(nèi)針對(duì)季候性流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法，包括施用至少一個(gè)有效劑量的季候性流感VLP，其中所述VLP包含季候性流感HA、NA和Ml蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述季候性流感VLP包含季候性流感蛋白，其中所述流感蛋白由HA、NA和Ml蛋白構(gòu)成。這些VLP含有HA、NA和M1，并可含有其它細(xì)胞組分諸如細(xì)胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質(zhì)、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了 M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述誘發(fā)受試者體內(nèi)針對(duì)季候性流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法包括施用至少一個(gè)有效劑量的季候性流感VLP，其中所述VLP基本上由季候性流感HA、NA和Ml組成。所述VLP可包含可忽略濃度的其它流感蛋白和/或蛋白雜質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，誘發(fā)受試者體內(nèi)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法包括施用至少一個(gè)有效劑量的流感VLP，其中所述VLP由季候性流感HA、NA和Ml組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述禽流感HA和/或NA分別展現(xiàn)血凝素活性和/或神經(jīng)氨酸酶活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者是哺乳動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是人。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述VLP與佐劑或免疫刺激物一起配制。
[0185]通常，本發(fā)明的季候性流感VLP的施用數(shù)量足以刺激針對(duì)一種或多種季候性流感病毒株的顯著的免疫力。在一個(gè)實(shí)施方案中，將所述VLP與包含不同流感亞型蛋白(如上面列出的)的其它VLP—起摻混。在另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑是三價(jià)制劑，包含具有來(lái)自至少兩種甲型流感亞型和/或至少 一種乙型流感亞型的季候性流感HA和/或NA蛋白的VLP的混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述乙型亞型是通過(guò)與上面所述相同的方法制備的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多價(jià)組合物包含一種或多種如上所述的本發(fā)明VLP。
[0186]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的VLP (禽類(lèi)或季候性VLP)可引發(fā)這樣的免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答將提供針對(duì)多于一種流感病毒株的保護(hù)。由具體亞類(lèi)的、具體病毒株構(gòu)建的流感VLP對(duì)脊椎動(dòng)物的交叉保護(hù)可誘發(fā)針對(duì)不同毒株和/或亞類(lèi)的流感病毒的交叉保護(hù)。下文的實(shí)施例顯示，本發(fā)明的VLP能夠誘發(fā)與不同病毒株和/或亞類(lèi)的交叉反應(yīng)性。
[0187]體液免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)不同流感抗原的抗體，其中HA特異性抗體對(duì)于中和病毒及由此防止疾病是最重要的。NA特異性抗體預(yù)防感染的有效性較低，但它們減少被感染細(xì)胞釋放病毒。粘膜組織是許多病原體包括流感的主要侵入門(mén)戶(hù)，而粘膜免疫系統(tǒng)提供了除天然免疫之外針對(duì)感染的第一道防線(xiàn)。SIgA，從某種程度上說(shuō)還有IgM，是針對(duì)粘膜病原體的主要中和性抗體，防止病原體進(jìn)入，并且可以在細(xì)胞內(nèi)作用以抑制病毒復(fù)制。鼻分泌物含有中和性抗體，特別是針對(duì)流感HA和NA的中和性抗體，其主要為IgA同種型且為局部產(chǎn)生。在原發(fā)感染過(guò)程中，可以通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定在鼻沖洗液中檢出對(duì)HA特異性的所有三個(gè)主要的Ig類(lèi)型(IgG、IgA和IgM)，雖然IgA和IgM比IgG更常被檢出。IgA，從某種程度上說(shuō)還有IgM，均在局部活躍地分泌，而IgG是作為血清分泌物衍生的。在具有局部IgA應(yīng)答的受試者中，也觀察到血清IgA應(yīng)答。由自然感染刺激的局部IgA應(yīng)答持續(xù)至少3-5個(gè)月，并且可以在局部檢出流感特異性IgA定向的記憶細(xì)胞。IgA也是繼發(fā)感染后局部分泌物中的主要Ig同種型，并且在后續(xù)感染時(shí)在血清中檢測(cè)到IgA應(yīng)答?；畈《疽呙缯T發(fā)的局部產(chǎn)生的中和性抗體的存在與野生型病毒攻擊后的感染抵抗力和病情相關(guān)聯(lián)。
[0188]針對(duì)流感感染的抵抗力或病情與針對(duì)HA和NA抗體的局部和/或血清水平相關(guān)。血清抗HA抗體是最經(jīng)常被測(cè)量的抗流感保護(hù)相關(guān)指標(biāo)(Cox et al.，1999)。自然流感感染后在大約80%的受試者中可檢測(cè)到保護(hù)性血清抗體(凝血抑制(HI)效價(jià)> 40)應(yīng)答。在正常受試者(Cox et al., 1994)和正經(jīng)歷流感感染的個(gè)體中存在產(chǎn)生所有三種主要Ig類(lèi)型的B細(xì)胞。在人類(lèi)中，血清抗體在流感感染的抵抗力和恢復(fù)中起作用。人類(lèi)中針對(duì)HA和NA的血清抗體水平可以與實(shí)驗(yàn)感染和自然感染后的病情抵抗力相關(guān)聯(lián)。在原發(fā)感染過(guò)程中，在10-14天內(nèi)可檢測(cè)到三種主要Ig類(lèi)型。IgA和IgM水平在2周后達(dá)到峰值然后開(kāi)始降低，而IgG水平在4-6周達(dá)到峰值。雖然初次應(yīng)答中IgG和IgM是主要的，在二次免疫應(yīng)答中IgG和IgA占主要地位。
[0189]由此，本發(fā)明包含誘發(fā)受試者中針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的保護(hù)性抗體應(yīng)答的方法，包括施用至少一個(gè)有效劑量的流感VLP。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述顯著的保護(hù)性抗體應(yīng)答的誘發(fā)減少流感癥狀的持續(xù)時(shí)間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，誘發(fā)受試者中針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的保護(hù)性抗體應(yīng)答的方法包括施用至少一個(gè)有效劑量的流感VLP，其中所述VLP包含流感HA、NA和Ml蛋白。
[0190]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括誘發(fā)受試者體內(nèi)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的保護(hù)性抗體應(yīng)答的方法，包括施用至少一個(gè)有效劑量的流感VLP，其中所述VLP基本上由流感HA、NA和Ml組成。所述VLP可包含可忽略濃度的其它流感蛋白和/或蛋白雜質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由HA、NA和Ml組成。這些VLP含有HA、NA和 Ml，并可含有其它細(xì)胞組分諸如細(xì)胞蛋白、桿狀病毒蛋白、月旨質(zhì)、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了 Ml、HA和/或NA的片段之外)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，誘發(fā)受試者體內(nèi)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法包括施用至少一個(gè)有效劑量的流感VLP，其中所述VLP由流感HA、NA和Ml組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述流感HA、NA和Ml衍生自季候性流感和/或禽流感。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述HA和/或NA分別展現(xiàn)血凝素活性和/或神經(jīng)氨酸酶活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者是哺乳動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是人。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述VLP與佐劑或免疫刺激物一起配制。
[0191]如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“抗體”是包含一個(gè)或多個(gè)基本上或者部分地由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼的多肽的蛋白質(zhì)。公認(rèn)的免疫球蛋白基因包括K、λ、α、Y、δ、ε和μ恒定區(qū)基因和無(wú)數(shù)免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分為K或λ。重鏈分為Υ、μ、α、δ或ε，它們進(jìn)而分別定義免疫球蛋白的類(lèi)型:IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單位由四聚體構(gòu)成。每個(gè)四聚體由同樣的兩對(duì)多肽鏈組成，每對(duì)具有一條“輕”(大約25kD)鏈和一條“重”(大約50-70kD)鏈。每條鏈的N末端定義一個(gè)大約100-110個(gè)或更多氨基酸的可變區(qū)，它主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別?？贵w作為完整的免疫球蛋白存在，或者作為若干通過(guò)各種肽酶消化而產(chǎn)生的、已充分表征的片段存在。
[0192]細(xì)胞介導(dǎo)的免疫也在流感感染的恢復(fù)中起作用，還可以防止流感相關(guān)的并發(fā)癥。已經(jīng)在被感染受試者的血液和下呼吸道分泌物中檢出了流感特異性細(xì)胞淋巴細(xì)胞。流感感染細(xì)胞的細(xì)胞溶解是由CTL與流感特異性抗體和補(bǔ)體共同介導(dǎo)的。在被感染或接種疫苗的個(gè)體中，初次細(xì)胞毒性應(yīng)答可于6-14天后在血液中檢測(cè)到，并在第21天以前消失(Enniset al.，1981)。流感特異性CTL在體外培養(yǎng)中展現(xiàn)交叉反應(yīng)特異性，從而，它們?nèi)芙飧腥玖讼嗤?lèi)型流感而非其它類(lèi)型(例如甲型流感而非乙型流感病毒)的細(xì)胞。識(shí)別內(nèi)部非糖基化蛋白，M、NP和PB2的CTL已得到分離(Fleischer et al.，1985)。CTL應(yīng)答在甲型流感病毒株之間有交叉反應(yīng)性(Gerhard et al.，2001),并且在與抗體共同使病毒擴(kuò)散最小化中是重要的(Nguyen et al.，2001)。
[0193]細(xì)胞介導(dǎo)的免疫也在流感感染的恢復(fù)中起作用，還可以防止流感相關(guān)的并發(fā)癥。已經(jīng)在被感染受試者的血液和下呼吸道分泌物中檢出了流感特異性細(xì)胞淋巴細(xì)胞。流感感染細(xì)胞的細(xì)胞溶解是由CTL與流感特異性抗體和補(bǔ)體共同介導(dǎo)的。在被感染或接種疫苗的個(gè)體中，初次細(xì)胞毒性應(yīng)答可于6-14天后在血液中檢測(cè)到，并在第21天以前消失(Enniset al.，1981)。流感特異性CTL在體外培養(yǎng)中展現(xiàn)交叉反應(yīng)特異性，從而，它們?nèi)芙飧腥玖讼嗤?lèi)型流感而非其它類(lèi)型(例如甲型流感而非乙型流感病毒)的細(xì)胞。識(shí)別內(nèi)部非糖基化蛋白，M、NP和PB2的CTL已得到分離(Fleischer et al.，1985)。CTL應(yīng)答在甲型流感病毒株之間有交叉反應(yīng)性(Gerhard et al.，2001),并且在與抗體共同使病毒擴(kuò)散最小化中是重要的(Nguyen et al.，2001)。.[0194]由此，本發(fā)明包括誘發(fā)受試者體內(nèi)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的保護(hù)性細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法，包括施用至少一個(gè)有效劑量的流感VLP。在另一個(gè)實(shí)施方案中，誘發(fā)受試者體內(nèi)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法包括施用至少一個(gè)有效劑量的流感VLP，其中所述VLP由流感HA、NA和Ml組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由HA、NA和Ml蛋白組成。這些VLP含有HA、NA和M1，并可含有其它 細(xì)胞組分諸如細(xì)胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質(zhì)、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了 M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述流感HA、NA和Ml衍生自季候性流感和/或禽流感病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述HA和/或NA分別展現(xiàn)血凝素活性和/或神經(jīng)氨酸酶活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者是哺乳動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是人。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述VLP與佐劑或免疫刺激物一起配制。
[0195]如上所述，本發(fā)明的VLP (例如禽流感和/或季候性流感VLP)預(yù)防或減輕受試者中流感感染的至少一種癥狀。流感的癥狀是本領(lǐng)域公知的。它們包括發(fā)熱、肌痛、頭痛、嚴(yán)重不適、干咳、咽喉痛、體重減輕和鼻炎。因此，本發(fā)明的方法包括預(yù)防或減輕與流感病毒感染相關(guān)的至少一種癥狀。癥狀的減輕可以主觀地或者客觀地確定，例如受試者自我評(píng)估、由內(nèi)科醫(yī)生評(píng)估、或通過(guò)實(shí)施合適的測(cè)定或測(cè)量(例如體溫)，包括例如生活質(zhì)量評(píng)價(jià)、流感感染或其它癥狀的進(jìn)展減慢、流感癥狀的嚴(yán)重程度降低或者合適的測(cè)定(例如抗體效價(jià)(titer)和/或T細(xì)胞激活測(cè)定)。客觀評(píng)價(jià)包括動(dòng)物和人的評(píng)價(jià)。
[0196]免疫實(shí)施咨詢(xún)委員會(huì)(AdvisoryCommittee on Immunization Practices, ACIP)所提倡的主要流感控制策略是對(duì)具有流感嚴(yán)重并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)的人，特別是> 65歲的人進(jìn)行疫苗接種。但是，每年的流感流行仍未減輕，并給我們的社會(huì)帶來(lái)了重大的健康和財(cái)政負(fù)擔(dān)(Glaser et al.，1996)。在過(guò)去的20年中(1976-1999)，流感相關(guān)全因超額死亡數(shù)(influenza-associated all cause excess deaths)發(fā)生了顯著的增加。從 1990 年到1999年,每年流感相關(guān)全因死亡數(shù)超過(guò)50，000 (Thompson et al.，2003)。雖然過(guò)去10年內(nèi)^ 65歲的人的疫苗覆蓋率增加到了 65%，但流感相關(guān)全因超額死亡數(shù)未出現(xiàn)相應(yīng)的減少。
[0197]因此，流感預(yù)防和控制的另一策略是對(duì)健康兒童和個(gè)體進(jìn)行普遍接種。兒童的流感感染率、流感所致的就醫(yī)疾病率和入院率均較高(Neuzil et al.，2000)。兒童在學(xué)校、家庭和社區(qū)內(nèi)的流感傳播中扮演著重要的角色。用現(xiàn)有流感疫苗對(duì)某個(gè)社區(qū)中大約80%的學(xué)童進(jìn)行接種減少了成人中的呼吸系統(tǒng)疾病和老年人中的超額死亡(Reichert etal.，2001)。這種理念被稱(chēng)為社區(qū)免疫力或者“群體免疫力”(herd immunity)，并被認(rèn)為對(duì)于保護(hù)社區(qū)免于疾病具有重要意義。由于被接種的人具有能中和流感病毒的抗體，他們將流感病毒傳播給其他人的可能性大大降低。從而，即使沒(méi)有經(jīng)過(guò)接種的人(以及接種已經(jīng)減弱或者疫苗不完全有效的人)往往可以受到群體免疫力的防護(hù)，因?yàn)樗麄冎車(chē)?jīng)過(guò)接種的人不得病。群體免疫力隨著經(jīng)過(guò)接種的人的百分比增加而更為有效。人們認(rèn)為，為了實(shí)現(xiàn)群體免疫力，社區(qū)中大約95%的人必須得到疫苗的保護(hù)。未經(jīng)免疫的人可增加他們和別人患病的機(jī)會(huì)。
[0198]因此，本發(fā)明包括通過(guò)對(duì)社區(qū)中的人群施用本發(fā)明的VLP，對(duì)人群或社區(qū)誘發(fā)針對(duì)流感病毒感染的顯著的保護(hù)性免疫，以在免疫受損的個(gè)體或未接種個(gè)體中減少流感病毒感染發(fā)生率的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)施用本發(fā)明的VLP對(duì)大多數(shù)學(xué)齡兒童進(jìn)行抗流感病毒免疫。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)施用本發(fā)明的VLP對(duì)社區(qū)中大多數(shù)健康個(gè)體進(jìn)行抗流感病毒免疫。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的VLP是“動(dòng)態(tài)接種”策略的一個(gè)部分。動(dòng)態(tài)接種是指堅(jiān)定地生產(chǎn)低效力的疫苗，該疫苗與新發(fā)的大流行性病毒株相關(guān)，但由于抗原性漂移而可能不會(huì)在哺乳動(dòng)物中提供完全的保護(hù)(見(jiàn)Germann et al.，2006)。由于將來(lái)大流行性病毒株的身份的不確定性，儲(chǔ)備匹配良好的大流行性病毒株幾乎是不可能的。但是，用匹配性不高但可能有效的 疫苗進(jìn)行接種可能延緩大流行性病毒的擴(kuò)散和/或減少流感病毒大流行株癥狀的嚴(yán)重程度。
[0199]本發(fā)明還涵蓋一種包含流感VLP的疫苗，其中所述疫苗當(dāng)施用于受試者時(shí)誘發(fā)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述顯著的免疫力的誘發(fā)減少流感癥狀的持續(xù)時(shí)間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疫苗在受試者中誘發(fā)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力，包括含有流感HA、NA和Ml蛋白的VLP。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種所述疫苗在受試者中誘發(fā)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力，包含基本上由流感HA、NA和Ml蛋白組成的VLP。所述VLP可含有可忽略濃度的其它流感蛋白和/或蛋白雜質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種所述疫苗在受試者中誘發(fā)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力，包含由流感HA、NA和Ml蛋白組成的VLP。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，一種所述疫苗在受試者中誘發(fā)針對(duì)流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力，包含含有流感蛋白的VLP，其中所述流感蛋白由HA、NA和Ml蛋白組成。這些VLP含有HA、NA和Ml，并可含有其它細(xì)胞組分諸如細(xì)胞蛋白、桿狀病毒蛋白、月旨質(zhì)、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了 Ml、HA和/或NA的片段之外)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感HA、NA和Ml蛋白衍生自禽流感和/或季候性流感病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述HA和/或NA分別展現(xiàn)血凝素活性和/或神經(jīng)氨酸酶活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者是哺乳動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是人。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述VLP與佐劑或免疫刺激物一起配制。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疫苗施用于哺乳動(dòng)物。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是人。
[0200]通過(guò)下面的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)解釋為限制性的。本文通過(guò)提述收錄本申請(qǐng)中引用的所有參考文獻(xiàn)、專(zhuān)利和已公開(kāi)的專(zhuān)利申請(qǐng)，以及附圖和序列表。
實(shí)施例
[0201]實(shí)施例1
[0202]材料和方法
[0203]使用桿狀病毒桿粒載體表達(dá)系統(tǒng)在草地夜蛾細(xì)胞(Sf_9S細(xì)胞系；ATCCPTA-4047)中表達(dá)禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)病毒HA、NA和Ml基因。HA、NA和Ml基因是利用從禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)病毒分離的RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)合成的(圖1、2和3)。逆轉(zhuǎn)錄和PCR使用對(duì)禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)病毒HA、NA和Ml基因特異性的寡核苷酸引物(表1)。首先將這些基因的cDNA拷貝克隆到細(xì)菌亞克隆載體PCR2.1T0P0中。從所得的三種基于pCR2.1T0P0的質(zhì)粒將HA、NA和Ml基因插入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac I (InVitrogen)中AcMNPV多角體蛋白啟動(dòng)子的下游，得到三種基于PFastBacl的質(zhì)粒:pHA、pNA和pMl，它們分別表達(dá)這些流感病毒基因。然后，構(gòu)建了編碼HA和Ml基因二者的、基于pFastBacl的單一質(zhì)粒pHAM，這兩個(gè)基因分別位于不同的多角體蛋白啟動(dòng)子的下游(圖4)。測(cè)定了 pNA質(zhì)粒中NA基因和鄰近的5’-和3’-區(qū)域的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)(圖1)。同時(shí)，也使用pHAM質(zhì)粒測(cè)定了 HA和Ml基因及鄰近區(qū)域的核苷酸序列(SEQ ID NO:2和3)(圖2和3)。
[0204]最后，將來(lái)自pHAM 質(zhì)粒的一個(gè)編碼HA和Ml表達(dá)盒的限制性DNA片段克隆到pNA質(zhì)粒中。由此得到編碼禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)病毒HA、NA和Ml基因的質(zhì)粒pNAHAM(圖 4)。
[0205]使用質(zhì)粒pNAHAM構(gòu)建重組桿狀病毒，該病毒含有整合到基因組中的流感病毒NA、HA和Ml基因，這些基因分別在不同的桿狀病毒多角體蛋白啟動(dòng)子的下游。用所得的重組桿狀病毒感染允許性Sf-9S昆蟲(chóng)細(xì)胞，結(jié)果這三種流感基因在每個(gè)感染了這些重組桿狀病毒的Sf-9S細(xì)胞中共表達(dá)。
[0206]感染后(p.1.)經(jīng)過(guò)72小時(shí)，使用HA特異性和Ml特異性抗體通過(guò)SDS-PAGE分析、考馬斯藍(lán)蛋白染色和Western免疫印跡分析對(duì)Sf_9S細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行表征(圖5)。使用針對(duì)流感病毒甲型/香港/1073/99 (H9N2)激發(fā)產(chǎn)生的兔抗體(CDC，Atlanta, Ga.，USA)或者針對(duì)流感Ml蛋白的小鼠單克隆抗體(Serotec，UK)進(jìn)行Western免疫印跡分析。Western免疫印跡分析檢測(cè)到了具有期望分子量的HA、NA和Ml蛋白(分別為64kd、60kd和31kd)。相比于該測(cè)定中檢測(cè)到的HA蛋白的量，NA蛋白與針對(duì)流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)病毒的兔血清顯示較低的反應(yīng)性。對(duì)于可檢測(cè)的NA蛋白的量的解釋包括:與HA蛋白相比，感染了重組桿狀病毒的Sf-9S細(xì)胞的NA蛋白表達(dá)水平較低；在Western免疫印跡測(cè)定中的致變性條件下NA與 該血清的反應(yīng)性較低(由于膜結(jié)合的凝膠電泳過(guò)程中重要的NA表位喪失)；與HA-抗體相比NA-抗體親合力較低；或者血清中NA-抗體豐度較低。
[0207]對(duì)于來(lái)自感染了表達(dá)甲型/香港/1073/99 (H9N2)HA、NA和Ml蛋白的重組桿狀病毒的Sf-9S細(xì)胞的培養(yǎng)基也進(jìn)行了流感病毒的探測(cè)。對(duì)經(jīng)過(guò)澄清的培養(yǎng)上清液進(jìn)行27，OOOrpm的超離心，以濃縮流感病毒的高分子(量)蛋白復(fù)合物，例如亞病毒顆粒、VLP、VLP復(fù)合物以及可能存在的由流感HA、NA和Ml蛋白構(gòu)成的其它自組裝顆粒物。將離心沉淀的蛋白產(chǎn)物重懸在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH7.2)中，然后在不連續(xù)的20-60%蔗糖分步梯度上進(jìn)行超離心來(lái)進(jìn)一步純化。從鹿糖梯度收集級(jí)分并利用SDS-PAGE分析、Western免疫印跡分析和電子顯微術(shù)進(jìn)行分析。
[0208]通過(guò)考馬斯藍(lán)染色和Western免疫印跡分析在多個(gè)蔗糖密度梯度級(jí)分中檢測(cè)到了具有期望分子量的流感HA和Ml蛋白(圖6，表1)。這提示來(lái)自被感染的Sf-9S細(xì)胞的流感病毒蛋白在大分子量復(fù)合物(如殼粒結(jié)構(gòu)、亞病毒顆粒、VLP和/或VLP復(fù)合物)中是聚集的?？捡R斯藍(lán)染色和Western免疫印跡分析對(duì)NA蛋白的檢出不穩(wěn)定,這可能是由于兔抗流感血清在Western免疫印跡分析中不能識(shí)別變性的NA蛋白所致,但在神經(jīng)氨酸酶活性測(cè)定中穩(wěn)定地檢出了 NA蛋白(圖10)。
[0209]表1
級(jí)分效價(jià)
【權(quán)利要求】
1.一種病毒樣顆粒(VLP)，其包含流感病毒Ml蛋白和流感病毒H5和NI血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白。
2.一種疫苗，其包含有效劑量的權(quán)利要求1的VLP。
3.—種在動(dòng)物中誘發(fā)針對(duì)流感病毒感染的顯著的免疫力的方法，其包括施用至少一個(gè)有效劑量的權(quán)利要求2的疫苗。
4.權(quán)利要求1的VLP用于制備動(dòng)物用疫苗的用途，其中所述疫苗在所述動(dòng)物中誘發(fā)針對(duì)流感病毒感染的顯著的免疫力。
5.制備權(quán)利要求1的VLP的方法，其包括在真核細(xì)胞中表達(dá)所述Ml、HA和NA蛋白。
6.一種包含流感VLP的疫苗，其中所述VLP包含流感M1、HA和NA蛋白，其中所述疫苗在人體中誘發(fā)針對(duì)流感病毒感染的顯著的免疫力。
7.一種在人體中誘發(fā)針對(duì)流感病毒感染的顯著的免疫力的方法，其包括施用至少一個(gè)有效劑量的權(quán)利要求6的疫苗。
8.流感VLP用于制備疫苗的用途，其中所述VLP包含流感M1、HA和NA蛋白，其中所述疫苗在人體中誘發(fā) 針對(duì)流感病毒感染的顯著的免疫力。
【文檔編號(hào)】A61P31/16GK103865892SQ201410085506
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2006年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2005年10月18日
【發(fā)明者】蓋爾.史密斯, 里克.布賴(lài)特, 彼得.普什科, 張金友, 庫(kù)塔布.馬穆德 申請(qǐng)人:諾瓦瓦克斯股份有限公司