一種抗豬流感以及藍耳病的中藥復方及提取方法
【專利摘要】本發(fā)明所述一種抗H1N1和H3N2亞型豬流感以及藍耳病的中藥復方，包含如下藥物：金銀花20～30重量份，知母10～20重量份，赤芍10～15重量份，貫眾10～15重量份，柴胡10～15重量份，魚腥草10～15重量份，甘草5～15重量份，可同時抗豬流感病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒，尤其是H1N1和H3N2亞型豬流感病毒，而且具有殘毒較低或無殘毒，副作用小，不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，同時能調節(jié)機體免疫功能，抑制病毒復制，改善臨床癥狀。
【專利說明】
一種抗豬流感以及藍耳病的中藥復方及提取方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于獸用中藥領域，涉及一種抗豬流感以及藍耳病的中藥復方及提取方 法。
【背景技術】
[0002] 豬流感（swine influenza，SI)又稱豬流行性感冒，是由正黏病毒科A型流感病毒 屬的豬流感病毒(swine influenza virus，SIV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性呼吸道 傳染病，臨床以突發(fā)、高熱、咳嗽、呼吸困難、反復發(fā)作、發(fā)病率高、死亡率低為特征。此病在 世界各地都有發(fā)生，危害嚴重，經(jīng)濟損失巨大，并對人類的健康構成威脅。其突出的流行特 點是常以亞臨床形式存在并常引起其他呼吸道細菌和病毒的繼發(fā)或混合感染，如豬繁殖與 呼吸綜合癥、豬圓環(huán)病毒病和豬傳染性胸膜肺炎等，使疫情變得復雜，死亡率增高。
[0003] 豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiration Syndrome Virus，PRRS)又稱"藍耳病"，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的豬以繁殖障礙和 呼吸道癥狀為主要特征的一種高度傳染性疾病。該病能多途徑傳播，不僅能引起妊娠母豬 發(fā)熱、流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎和弱仔，也能誘發(fā)仔豬和育成豬的呼吸系統(tǒng)疾病。PRRSV可導致病豬 食欲不振、體重下降、呼吸系統(tǒng)疾病并產(chǎn)生間質性肺炎。給全國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重威脅及巨 大經(jīng)濟損失。
[0004] 在臨床實踐豬流感的防治上，由于抗生素具有控制并發(fā)癥的特點而被廣泛使用， 同時配合大量的解熱鎮(zhèn)痛、糖皮質激素類等藥物。這些處理方式在抑制機體炎癥反應的同 時也加重了免疫抑制，導致病情更加的惡化。而豬繁殖與呼吸綜合征主要依賴疫苗進行防 治，但是滅活疫苗需要大量、多次免疫，產(chǎn)生免疫時間長，弱毒疫苗又存在毒力返強的危險。 中草藥作為天然產(chǎn)物，具有藥源豐富，殘毒較低或無殘毒，副作用小，不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu) 點；同時能調節(jié)機體免疫功能，抑制病毒復制，改善臨床癥狀，在治療病毒感染性疾病上應 用廣泛。因此，應用中草藥防治豬流感和豬繁殖與呼吸綜合征，前景極為廣闊。
[0005] 縱觀現(xiàn)在中藥復方抗病毒的實驗研究，對分別抗豬流感病毒和豬繁殖與呼吸綜合 征病毒的單方研究較多，目前并沒有研究出一個復方可以同時抗豬流感病毒和豬繁殖與呼 吸綜合征病毒。并且大多分別采用體內試驗或體外試驗的方法獨立研究，不能全面評價中 藥復方抗豬流感病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的效果。
[0006] 為解決上述問題，迫切需要篩選出有效防治豬流感和豬繁殖與呼吸綜合征的中藥 復方。并且同時采用體外試驗和體內試驗，從作用機理和臨床實際上綜合研究中藥復方抗 HlNl和H3N2亞型豬流感病毒以及藍耳病病毒的效果，為臨床防治提供理論和實際依據(jù)。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術中的缺點，提供了一種抗豬流感以及藍耳病的中藥復方及 提取方法，可以同時防治豬流感病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒，其具有殘毒較低或無殘 毒，副作用小，不易廣生耐藥性等優(yōu)點，同時能調節(jié)機體免疫功能，抑制病毒復制，改善臨床 癥狀。
[0008] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：
[0009] 一種抗豬流感以及藍耳病的中藥復方，包含如下藥物:金銀花20~30重量份，知母 10~20重量份，赤芍10~15重量份，貫眾10~15重量份，柴胡10~15重量份，魚腥草10~15 重量份，甘草5~15重量份，所述的重量份是指復方中各種藥物占整個復方的重量比例。 [00?0]進一步，包含如下藥物：金銀花25重量份，知母15重量份，赤茍12.5重量份，貫眾 12.5重量份，柴胡12.5重量份，魚腥草12.5重量份，甘草10重量份。
[0011] -種抗豬流感以及藍耳病的中藥復方的提取方法，包括以下步驟：
[0012] (1)按上述配比稱量各藥物；
[0013] (2)將稱量后的藥復方粉碎到20目，加入兩倍量的水，浸泡lh，水煎2次，每次煮沸 30min，合并2次煎液；
[0014] (3)將煎液在常壓真空抽濾及濃縮，定容至IOOmL水煎液，每毫升相當于Ig生藥（即 1000mg/mL)；
[0015] (4)將水煎液進行高壓滅菌，在4°C冰箱內保存?zhèn)溆?br>[0016] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0017] 本發(fā)明所述一種抗豬流感以及藍耳病的中藥復方及提取方法，包含如下藥物:金 銀花20~30重量份，知母10~20重量份，赤芍10~15重量份，貫眾10~15重量份，柴胡10~ 15重量份，魚腥草10~15重量份，甘草5~15重量份，可同時抗豬流感病毒和豬繁殖與呼吸 綜合征病毒，尤其是HlNl和H3N2亞型豬流感病毒，而且具有殘毒較低或無殘毒，副作用小， 不易廣生耐藥性等優(yōu)點，同時能調節(jié)機體免疫功能，抑制病毒復制，改善臨床癥狀。
【附圖說明】
[0018] 附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明， 并不構成對本發(fā)明的限制，在附圖中：
[0019] 圖1是HlNl亞型豬流感病毒感染小鼠體重的變化；
[0020]圖2是H3N2亞型豬流感病毒感染小鼠體重的變化；
[0021]圖3A表示中藥復方組的HlNl亞型豬流感病毒感染小鼠的肺部病理切片；
[0022]圖3B表示麻杏石甘散復方組的HlNl亞型豬流感病毒感染小鼠的肺部病理切片； [0023]圖3C表示利巴韋林組的HlNl亞型豬流感病毒感染小鼠的肺部病理切片；
[0024]圖3D表示模型對照組的HlNl亞型豬流感病毒感染小鼠的肺部病理切片；
[0025]圖3E正常對照組的HlNl亞型豬流感病毒感染小鼠的肺部病理切片；
[0026]圖4A表示中藥復方組的H3N2亞型豬流感病毒感染小鼠的肺部病理切片，
[0027]圖4B表示麻杏石甘散組的H3N2亞型豬流感病毒感染小鼠的肺部病理切片，
[0028]圖4C表示利巴韋林組的H3N2亞型豬流感病毒感染小鼠的肺部病理切片，
[0029]圖4D表示模型對照組的H3N2亞型豬流感病毒感染小鼠的肺部病理切片，
[0030]圖4E表示正常對照組的H3N2亞型豬流感病毒感染小鼠的肺部病理切片。
【具體實施方式】
[0031]以下結合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優(yōu)選實 施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0032] 本發(fā)明所述一種抗豬流感以及藍耳病的中藥復方，包含如下藥物:金銀花25重量 份，知母15重量份，赤芍12.5重量份，貫眾12.5重量份，柴胡12.5重量份，魚腥草12.5重量 份，甘草10重量份，重量份是指復方中各種藥物占整個復方的重量比例。
[0033] 金銀花:甘，寒；歸肺、心、胃經(jīng);主要功效主是清熱解毒和疏散風熱。含有綠原酸、 木犀草素苷等藥理活性成分，對溶血性鏈球菌、金黃葡萄球菌等多種致病菌及上呼吸道感 染致病病毒等有較強的抑制力，在復方中為君藥。知母:苦，寒；歸肺、胃、腎經(jīng);主要功效為 清熱瀉火，滋陰潤燥，在復方中為臣藥。柴胡:性味苦、微寒，歸肝、膽經(jīng);有和解表里，疏肝升 陽之功效。魚腥草:味辛，性寒涼，歸肺經(jīng)；能能清熱解毒，利尿消腫，柴胡和魚腥草同為佐 藥。甘草:氣微，味甜而特殊，主要功效為補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，在復方 中為使藥。
[0034] 下述實施例中所用實驗材料如下：
[0035] ( - )試驗動物
[0036] 9-11日齡SPF雞胚購自廣東大華農禽蛋有限公司；SPF級15g±2g BALB/c小鼠購自 廣東省醫(yī)學實驗動物中心。
[0037](二)溶液或試劑配制
[0038] 1上85的配制：稱取恥(：18.(^、恥2冊〇4 3.638、1((：10.28冊2?〇4〇.248溶于適量 超純水，調pH值至7.4,定容至1000 mL; 100mL/瓶分裝，15鎊高壓滅菌30min，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0039] 2.1 %雞紅細胞懸液的配制：先用滅菌注射器吸取3.8%枸櫞酸鈉溶液(其用量為 所需血量的1/5 )，從雞翅靜脈抽血至所需要血量，置滅菌離心管內，加滅菌PBS為抗凝血的2 倍，以2000r/min離心10min，棄上清液，再加生理鹽水懸浮血球，同上法離心沉淀，如此將紅 細胞洗滌三次，最后根據(jù)所需用量，用滅菌PBS配成1 %懸液，現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0040] 3.中藥的提取:采用水煎煮方法進行粗提，具體步驟是：
[0041 ] (1)按金銀花25重量份，知母15重量份，赤芍12.5重量份，貫眾12.5重量份，柴胡 12.5重量份，魚腥草12.5重量份，甘草10重量份比例，稱取各中藥，組成100g中藥復方； [0042] (2)將100g中藥復方粉碎到20目，加入2倍水，浸泡lh，水煎2次，每次煮沸30min，合 并2次煎液；
[0043] (3)將煎液在常壓真空抽濾及濃縮，定容至IOOmL水煎液，每毫升相當于0.51g生藥 (即 1000mg/mL);
[0044] (4)將水煎液進行高壓滅菌，保存至溫度為4°C冰箱內備用。
[0045] 中藥復方制劑的體外抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)效果
[0046] I .PRRSV對MARC-145細胞的半數(shù)致死量(TCID50)測定
[0047]將待測病毒按10倍比系列稀釋10個濃度梯度，在長滿Marc-145細胞的96孔板，按 100μΙ/孔的劑量加入病毒液，每個梯度做8個重復，最后2列為細胞對照組，37°C吸附1.5h后 棄去病毒液，并加入維持液1〇〇μ1，放置C02細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0048] 每天觀察細胞病變情況，在病變達到75 %以后用MTT法測定各孔OD值。病毒對細胞 的生長抑制率=(細胞對照組OD值-病毒對照組OD值)/細胞對照組OD值。病毒的半數(shù)毒性濃 度(TCID50)運用Reed-Muench兩氏法進行計算。
[0049] 2.中藥復方制劑對MARC-145細胞的最大安全濃度的測定
[0050] 在96孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)單層Marc-145細胞，棄去原液，利用I3BS洗滌1次。第1到第12 孔分別加入1〇〇μ1 DMEM維持液，然后取100μΙ中藥成分的原液從第1孔到第10孔依次進行2 倍倍比稀釋，第10孔棄去100μΙ，第11、12孔為細胞對照，各稀釋度重復4孔。置于37°(：、二氧 化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，每天觀察細胞生長情況以及形態(tài)變化。72h后棄去培養(yǎng)液，用MTT法 在490nm波長下測定OD值。根據(jù)下述公式計算中藥成分對Marc-145細胞的安全濃度：
[0051 ] 不同濃度中藥成分對細胞的生長抑制率=(細胞對照組OD值-藥物組OD值)/細胞 對照組OD值，以對細胞的生長抑制率為0來確定中藥成分的安全濃度。
[0052] 3.中藥復方制劑體外抗PRRSV效果的測定
[0053]將細胞傳到96孔培養(yǎng)板，采用三種加藥方式：
[0054]方式一、先加中藥再加病毒（中藥對PRRSV的阻斷作用）：在96孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)生長 至單層的Marc-145細胞后，加入以安全濃度為始的中藥提取物，每孔IOOyL，37°C、二氧化碳 培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后棄去藥液，每孔加入100μΙ的100TCID50PRRSV液，37°C、二氧化碳培養(yǎng)箱培 養(yǎng)2h后棄去病毒液，最后每孔加入100μΙ的DMEM培養(yǎng)液。
[0055]方式二、先加病毒再加中藥（中藥對PRRSV的抑制作用）：
[0056] 在96孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)生長至單層的Marc-145細胞后，每孔加入100μΙ的 100TCID50PRRSV液，37°C、二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后棄去病毒液，再加入以安全濃度起始的 中藥提取物，每孔1〇〇μ1，37°C、二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后棄去藥液，最后每孔加入100μΙ 的DMEM培養(yǎng)液。
[0057] 方式三、中藥病毒混合后一起加（中藥對PRRSV的直接殺滅作用）：
[0058]在96孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)生長至單層的Marc-145細胞，配制以板藍根多糖安全濃度起 始，倍比稀釋且含100TCID50病毒液的不同濃度中藥提取物的培養(yǎng)液，依次加入96孔培養(yǎng)板 中，每孔100μΙ，37°C、二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后棄藥液，最后每孔加入DMEM培養(yǎng)100μΙ。
[0059]同時設立病毒對照和陰性對照。
[0000]用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，先計算各組490nm的平均OD值，再根據(jù)公式計算對 細胞的保護率，計算公式為：中藥對感染病毒的Marc-145細胞的保護率=(藥物組OD值-病 毒對照組OD值)/(細胞對照組OD值-病毒對照組OD值）。最后根據(jù)細胞保護率來評價各中藥 提取物的抗病毒效果，細胞保護率越大則表明藥物抗PRRSV作用越強。
[0061 ] 4.數(shù)據(jù)處理
[0062]數(shù)據(jù)以it:S.E表示，用SPSS19·0軟件統(tǒng)計分析。 「00631 串1 .由熱售 玄對PRRSV的陽斷你田
[0065] 表2:中藥復方對PRRSV的抑制作用
[0069] 注:A表不與病毒對照相比P<0.01，差異極顯著，a表不P<0.05，差異顯著；B表不與 空白對照相比P<〇. 01，差異極顯著，b表示P<0.01，差異顯著。
[0070] 表1顯示本發(fā)明所述的中藥復方在MARC-145細胞上對PRRSV的直接殺滅作用明顯 強于利巴韋林與麻杏石甘散，最強的阻斷和抑制作用雖然略弱于利巴韋林和麻杏石甘散， 但是中藥復方的抗PRRSV的作用非常穩(wěn)定，隨濃度的降低其抗病毒作用沒有急劇下降，而且 每個作用方式中的每個濃度與病毒組相比都有極顯著的差異，說明其具有明顯的抗PRRSV 效果。
[0071] 中藥復方對小鼠感染HlNl和H3N2亞型豬流感病毒的防治效果
[0072] I .HlNl和H3N2亞型豬流感病毒對雞胚半數(shù)感染量(EID5q)的測定
[0073]將病毒液依次作10倍倍比稀釋，接種于10日齡雞胚尿囊腔內，每個稀釋度接種 0.2ml/枚，作4個重復，同時設正常雞胚對照。置37°C恒溫箱內孵化72h，棄去24h內死亡胚， 收獲24h后死亡胚及72h活胚的尿囊液，進行HA效價的測定。按Reed-Muench兩氏法計算 EID5〇〇
[0074] 2.中藥復方對HlNl和H3N2亞型豬流感病毒感染小鼠肺炎的影響
[0075] (1)實驗動物分組
[0076]將BALB/c小鼠隨機分為中藥復方組、利巴韋林組、麻杏石甘散組、模型對照組、正 常對照組，共5組，每組10只，并進行標記。
[0077] (2)實驗動物給藥
[0078]各組小鼠均以灌胃給藥，2次/d，0.2ml/次。中藥各組于感染前I d開始給藥，連續(xù) 7d。同時，正常對照組、模型對照組給予等量蒸餾水。
[0079] (3)實驗動物攻毒
[0080] 將小鼠用乙醚麻醉后，除正常對照組外，各組滴鼻接種106EID50流感病毒50μ1，正 常對照組接種50μ1滅菌PBS。
[0081] (4)第8天(禁食8h以上）稱重，摘眼球放血處死小鼠，無菌摘取肺臟，用PBS沖洗并 用無菌濾紙吸去表面多余液體后分別稱量肺重。
[0082] 肺指數(shù)與肺指數(shù)抑制百分率計算公式如下：
[0083] 肺指數(shù)=肺臟重量(g)/小鼠重量(g) X 100
[0084] 肺指數(shù)抑制百分率=(模型對照組肺指數(shù)均數(shù)-實驗組肺指數(shù)均數(shù))/模型對照組 數(shù) X 100%
[0085] (5)統(tǒng)計分析:用SPSS17 · 0軟件統(tǒng)計分析，詳見表3: 「00861 串4.由熱售 玄制卯沏燒盛咸癥羞咸細Α?? _洛的默喻
[0090] 注：以上數(shù)據(jù)與模型對照組相比，A表示Ρ<0.01，差異極顯著，a表示Ρ<0.05,差異顯 著。
[0091] 從表4可以看出，中藥復方組的不僅肺指數(shù)抑制百分率有8.73%，而且肺指數(shù)還低 于麻杏石甘散經(jīng)典復方組，說明其對于經(jīng)HlNl亞型豬流感病毒感染的小鼠的肺保護作用要 強于經(jīng)典復方組。
[0092] 3.中藥復方對豬流感病毒感染小鼠體重的影響
[0093] (1)實驗動物分組、給藥、造模同2 (1) (2) (3)
[0094] (2)體重的測定
[0095] 從給藥第1天開始，每天早上給藥前稱取每一只小鼠體重，共七天，對每一組小鼠 的體重變化進行分析。
[0096] (3)統(tǒng)計分析:小鼠體重變化如圖1和2所示，圖中的柱狀從左至右分別代表實驗的 第1至第7天。
[0097]從圖1可以看出，中藥復方組對HlNl亞型豬流感病毒的抵抗力較強，只在第4天的 時候體重出現(xiàn)減輕，但恢復快，體重增長幅度大，到第7天平均體重與正常對照組接近。而麻 杏石甘散組和利巴韋林組明顯受HlNl亞型豬流感病毒的影響很大，體重下降幅度大，而且 時間長，恢復慢，麻杏石甘散組直至第7天才出現(xiàn)體重回升。從圖2可知，H3N2亞型豬流感病 毒的毒力較HlNl亞型豬流感病毒強，所有組別的小鼠體重均出現(xiàn)明顯的變化，但是從圖中 可以看出，中藥復方組在四個感染組中仍然抵抗力較強恢復較快，雖然到第6天體重才出現(xiàn) 上升，但是仍遠強于麻杏石甘散組。因此，綜合兩種病毒感染的實驗結果可知，中藥復方組 具有明顯的抗豬流感效果。
[0098] 4.中藥復方對小鼠感染豬流感病毒后的肺部病理變化
[0099] (1)實驗動物分組、給藥、造模同I (1) (2) (3)
[0100] (2)第8天(禁食8h以上)稱重，摘眼球放血處死小鼠，無菌摘取肺臟，并制成石蠟切 片。
[0101] (3)切片結果分析：
[0102] 豬流感感染后的小鼠的主要產(chǎn)生間質性肺炎并有充血、水腫等病理變化。從圖3A 至圖4E可以看出，與正常對照組相比較，模型對照組肺泡間隔增寬，肺泡壁不完整，并伴有 出血現(xiàn)象。中藥復方組雖然也出現(xiàn)了出血，但是明顯癥狀較麻杏石甘散組和利巴韋林組弱， 而且肺泡壁完整。因此可知，中藥復方組對HlNl和H3N2兩種亞型的豬流感有防治效果，并且 強于麻杏石甘散組和利巴韋林組。
[0103] 最后應說明的是：以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管 參照實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述 各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換，但是凡在 本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護 范圍之內。
【主權項】
1. 一種抗豬流感以及藍耳病的中藥復方，其特征在于： 包含如下藥物：金銀花20~30重量份，知母10~20重量份，赤芍10~15重量份，貫眾10 ~15重量份，柴胡10~15重量份，魚腥草10~15重量份，甘草5~15重量份。2. 根據(jù)權利有1所述一種抗豬流感以及藍耳病的中藥復方，其特征在于：包含如下藥 物:金銀花25重量份，知母15重量份，赤芍12.5重量份，貫眾12.5重量份，柴胡12.5重量份， 魚腥草12.5重量份，甘草10重量份。3. 根據(jù)權利有1或2所述一種抗豬流感以及藍耳病的中藥復方的提取方法，其特征在 于，包括以下步驟： (1) 按上述配比稱量各藥物； (2) 將稱量后的藥復方粉碎到20目，加入兩倍量的水，浸泡Ih，水煎2次，每次煮沸 30min，合并2次煎液； (3) 將煎液在常壓真空抽濾及濃縮，定容至IOOmL水煎液，每毫升相當于Ig生藥； (4) 將水煎液進行高壓滅菌，在4 °C冰箱內保存?zhèn)溆谩?br>【文檔編號】A61K36/8964GK105943820SQ201610465823
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月21日
【發(fā)明人】王丙云, 劉櫻, 何永明, 冼瓊珍, 鄭閎升, 計慧琴, 陳勝鋒, 陳志勝, 張輝華, 張貝瑩
【申請人】佛山科學技術學院