基于共有表位甲型流感病毒抗體通用型競(jìng)爭(zhēng)性elisa檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于共有表位甲型流感病毒抗體通用型競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法，采用包含甲型流感病毒特異性表位序列的多肽作為包被抗原，采用特異性型單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，以提高檢測(cè)特異性；應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法，酶標(biāo)二抗統(tǒng)一采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgGFc片段的多克隆抗體，能檢測(cè)除鼠以外的所有動(dòng)物，包括野生哺乳動(dòng)物和野生鳥(niǎo)類(lèi)等及人血清樣品中的甲型流感病毒抗體，排除宿主動(dòng)物種類(lèi)的限制；包被抗原和單克隆抗體均基于甲型流感病毒共有表位，檢測(cè)甲型流感病毒共有的型特異性抗體，不受感染病毒亞型限制。本發(fā)明適用于檢測(cè)動(dòng)物及人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中甲型流感病毒抗體。
【專(zhuān)利說(shuō)明】基于共有表位甲型流感病毒抗體通用型競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于甲型流感病毒檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種基于共有表位甲型流感病毒抗體通用型競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]抗體檢測(cè)是監(jiān)測(cè)傳染病病原感染狀況，分析疫病三間(時(shí)間、空間、種群間)分布和評(píng)估疫苗免疫效果的重要技術(shù)手段，甲型流感病毒具有亞型眾多、自然感染宿主動(dòng)物范圍廣的特點(diǎn)，現(xiàn)有流感病毒抗體檢測(cè)方法有兩種:血凝抑制試驗(yàn)和ELISA，血凝抑制試驗(yàn)具有亞型特異性，檢測(cè)結(jié)果和檢測(cè)方法受所感染的不同亞型流感病毒得限制或干擾，且除雞血清以外，其余動(dòng)物及人血清樣品必須經(jīng)預(yù)處理去除非特異性抑制素后，方能進(jìn)行檢測(cè)，操作繁瑣，有效抗體丟失較多，降低了檢測(cè)敏感性，ELISA若采用針對(duì)宿主IgG的抗體作為二抗，則檢測(cè)對(duì)象僅限于該種宿主動(dòng)物血清樣品，例如采用抗人IgG的抗體作為二抗，僅能檢測(cè)人血清樣品，而不能檢測(cè)蝙蝠、野生鳥(niǎo)類(lèi)等動(dòng)物血清中的流感病毒抗體，若二抗采用兔抗鼠IgG，則必須要采用特性強(qiáng)、覆蓋范圍廣的單克隆抗體，目前尚無(wú)有效的檢測(cè)方法和試劑盒。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)方案:
[0004]1.1血凝抑制試驗(yàn)
[0005]來(lái)源于中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS285-2008)、中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》(GB15994-1995)；
[0006]1.1.1 原理
[0007]一些動(dòng)物紅細(xì)胞(如雞、豚鼠等)以及人“O”型血紅細(xì)胞上有流感病毒受體，遇流感病毒可產(chǎn)生紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，簡(jiǎn)稱(chēng)血凝，若將特異性抗體與流感病毒(血凝素)預(yù)先作用后再加入紅細(xì)胞則不產(chǎn)生凝集，稱(chēng)為血凝抑制現(xiàn)象，用定量血凝素與不同稀釋度血清抗體作用后，能完全抑制血凝的最高稀釋度，即為血凝抑制抗體效價(jià)；
[0008]1.1.2主要材料
[0009]90孔微量血凝試驗(yàn)板，微量移液器；
[0010]1.1.3雙份血清收集及處理
[0011]急性期血清于發(fā)病3d內(nèi)采取，恢復(fù)期血清于發(fā)病后2?4周采取，取0.1mL已分離的血清加入0.9 (或0.4) mL霍亂濾液(RDE)(即1: 10或1: 5稀釋)搖勻，于37°C水浴中過(guò)夜，以去除血清中的非特異性抑制素，次日置56°C水浴50min以滅活多余的RDE ；
[0012]1.1.4流感病毒血凝素制備
[0013]流感病毒接種雞胚后48h收獲的尿囊液，加入1/10000硫柳汞防腐，為了延遲尿鹽沉淀可先用無(wú)菌生理鹽水做等量稀釋?zhuān)?°C備用；
[0014]1.1.5雞紅細(xì)胞懸液的制備
[0015]從靜脈或心臟抽取正常健康雞血，保存于阿氏(Alsevr’ s)液中，置4°C保存，用前以生理鹽水洗3次，末次經(jīng)2000r/min離心lOmin，將紅細(xì)胞用生理鹽水配成1%濃度；[0016]1.1.6血凝素滴定
[0017]將流感病毒血凝素在90孔微量血凝試驗(yàn)板內(nèi)用生理鹽水從1: 5開(kāi)始做系列倍比稀釋?zhuān)靠?0 μ L再加入等量1%雞紅細(xì)胞懸液，搖勻，置室溫孵育30min?45min后觀察結(jié)果，以出現(xiàn)“++”血凝的血凝素最高稀釋度為其血凝效價(jià)，即為I個(gè)血凝單位，實(shí)驗(yàn)時(shí)采用4個(gè)紅細(xì)胞凝集單位(指25 μ L體積中含有4個(gè)紅細(xì)胞凝集單位)，按所需病毒工作液總量換算配制，試驗(yàn)前須復(fù)核滴定確保準(zhǔn)確無(wú)誤；
[0018]1.1.7血凝抑制試驗(yàn)步驟
[0019]1.1.7.1將上述已處理的待檢血清(I: 10或1: 5)再用生理鹽水做系列倍比稀釋?zhuān)靠准?0 μ L ;
[0020]1.1.7.2加入等量已配好的4個(gè)單位血凝素；
[0021]1.1.7.3每孔加入50 μ Ll%雞紅細(xì)胞懸液，搖勻置室溫孵育30min?45min ；
[0022]1.1.8結(jié)果觀察
[0023]觀察結(jié)果時(shí)將血凝板傾斜數(shù)十秒鐘，待陰性孔內(nèi)紅細(xì)胞自由下滑呈淚滴狀時(shí)讀結(jié)果，以出現(xiàn)完全抑制的血清最高稀釋度的倒數(shù)為抗體的效價(jià)，在檢測(cè)患者雙份血清時(shí)需在同一次試驗(yàn)中進(jìn)行，并以恢復(fù)期血清抗體效價(jià)較急性期抗體效價(jià)升高4倍或4倍以上為陽(yáng)性，具有亞型特異性，檢測(cè)結(jié)果和檢測(cè)方法受不同流感病毒亞型感染的限制或干擾，且除雞血清以外，其它動(dòng)物血清樣品必須經(jīng)預(yù)處理去除非特異性紅細(xì)胞凝集因子后方能進(jìn)行檢測(cè)，操作繁瑣，有效抗體丟失較多，降低了檢測(cè)敏感性；
[0024]1.2人甲型流感病毒抗體間接ELISA檢測(cè)方法
[0025]1.2.1 原理
[0026]利用酶標(biāo)記的二抗以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體，首先將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原，受檢抗體與固相抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，酶標(biāo)二抗與固相復(fù)合物中受檢抗體的FC片段結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量，加底物顯色后根據(jù)顏色深度(0D值)進(jìn)行抗體定性檢測(cè)，用于檢測(cè)人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中甲型流感病毒抗體；
[0027]1.2.2操作步驟
[0028]1.2.2.1包被抗原:將純化的流感病毒抗原稀釋后包被于90孔酶標(biāo)板后，用1%明膠或1-2%脫脂奶溶封閉；
[0029]1.2.2.2加標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本:在包被好的酶標(biāo)板上，分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣本孔和空白對(duì)照孔，記錄各孔位置，在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50μ L ;待測(cè)樣本孔中先加入待測(cè)樣本10 μ L，再加樣本稀釋液40 μ L (即樣本稀釋5倍)；空白對(duì)照孔不加；
[0030]1.2.2.3溫育:37°C水浴鍋或恒溫箱溫育30min ；
[0031]1.2.2.4洗板:棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置lmin，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板4次(也可用洗板機(jī)按說(shuō)明書(shū)操作洗板)；
[0032]1.2.2.5加酶標(biāo)二抗(抗人IgGFC片段的多克隆抗體):每孔加入酶標(biāo)二抗工作液50 μ L，空白對(duì)照孔不加；
[0033]1.2.2.6溫育:37°C水浴鍋或恒溫箱溫育30min ；
[0034]1.2.2.7 洗板:同 1.2.2.4 ;
[0035]1.2.2.8顯色:每孔先加入100 μ L底物，平板混勻器混勻30s (或用手輕輕震蕩混勻30s)，37°C避光顯色15min ；
[0036]1.2.2.9終止:取出酶標(biāo)板，每孔加終止液50 μ L，終止反應(yīng)(顏色由藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)；
[0037]1.2.2.10測(cè)定:以空白孔調(diào)零，在終止后15分鐘內(nèi)，用450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光值(0D值)；
[0038]1.2.2.11根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程，再根據(jù)樣本的OD值，在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度，也可以使用各種應(yīng)用軟件來(lái)計(jì)算，最終濃度為實(shí)際測(cè)定濃度乘以稀釋倍數(shù)。
[0039]同步檢測(cè)不同亞型流感病毒感染不同宿主動(dòng)物產(chǎn)生的特異性抗體，是分析流感病毒感染狀況和疫病三間分布態(tài)勢(shì)的重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。要求所采用的抗體檢測(cè)技術(shù)不僅要具有高敏感性和高特異性，而且還應(yīng)具有通用性一一能檢測(cè)來(lái)源不同宿主動(dòng)物、不同亞型流感病毒感染產(chǎn)生的特異性抗體。血凝抑制試驗(yàn)具有亞型特異性，檢測(cè)結(jié)果和檢測(cè)方法受不同流感病毒亞型感染的限制或干擾，且除雞血清以外，其它動(dòng)物血清樣品必須經(jīng)預(yù)處理去除非特異性抑制素后方能進(jìn)行檢測(cè)，操作繁瑣，有效抗體丟失較多，降低了檢測(cè)敏感性。ELISA若采用針對(duì)宿主IgG的抗體作為二抗，則檢測(cè)對(duì)象僅限于該種宿主動(dòng)物血清樣品，例如采用抗人IgG的抗體作為二抗，僅能檢測(cè)人血清樣品，而不能檢測(cè)蝙蝠、野生鳥(niǎo)類(lèi)等動(dòng)物血清中的流感病毒抗體。若二抗采用兔抗鼠IgG，則必須要采用特性強(qiáng)、覆蓋范圍廣的單克隆抗體，目前尚無(wú)有效的檢測(cè)方法和試劑盒。
[0040]現(xiàn)有甲型流感病毒抗體檢測(cè)方法特異性不強(qiáng)、受宿主動(dòng)物種類(lèi)限制、受不同病毒亞型的限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0041]本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種基于共有表位甲型流感病毒抗體通用型競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法，旨在解決現(xiàn)有甲型流感病毒抗體檢測(cè)方法特異性不強(qiáng)、受宿主動(dòng)物種類(lèi)限制、受不同病毒亞型限制的問(wèn)題。
[0042]本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種基于共有表位甲型流感病毒抗體通用型競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法，該基于共有表位甲型流感病毒抗體通用型競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法包括以下步驟:
[0043]步驟一，采用分別含有甲型流感病毒核蛋白上的2個(gè)型特異性表位和甲型流感病毒基質(zhì)蛋白上的I個(gè)型特異性表位序列的多肽，使用前預(yù)混合，作為包被抗原；
[0044]步驟二，將包被抗原用0.05mol / L碳酸鹽緩沖液稀釋到工作濃度，加至96孔ELISA板，每孔加50 μ L，振蕩混勻，4°C保濕過(guò)夜，用PBST洗板5次，鋁箔紙密封4°C保存；
[0045]步驟三，采用2株針對(duì)甲型流感病毒核蛋白的型特異性單克隆抗體和I株針對(duì)甲型流感病毒基質(zhì)蛋白的型特異性單克隆抗體，使用前預(yù)混合，作為檢測(cè)抗體；
[0046]步驟四，加樣，將待檢血清用PBST-SM作1:5稀釋?zhuān)靠准?0 μ L，每份樣品使用兩孔，空白對(duì)照兩孔，各加PBST-SM50 μ L ;強(qiáng)陽(yáng)性血清對(duì)照兩孔，各孔加50 μ L ;弱陽(yáng)性血清對(duì)照兩孔，各加入50 μ L ;陰性血清對(duì)照兩孔，各加入50 μ L ;置37°C溫箱振蕩溫育反應(yīng)30min ；
[0047]步驟五，將檢測(cè)抗體用PBST-SM稀釋到工作濃度，每孔加50 μ L ;置37°C溫箱振蕩溫育反應(yīng)30min ;用PBST洗板5次，甩干；加酶標(biāo)二抗，將HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgGFC片段的多克隆抗體用PBST-SM稀釋到工作濃度，每孔加50 μ L ;置37°C溫箱振蕩溫育反應(yīng)30min ；洗板，用PBST洗板5次，甩干；
[0048]步驟六，加底物和終止，按以下比例配置底物工作液:9.7mL乙酸一檸檬酸緩沖液+50 μ L30%過(guò)氧化氫+300 μ L四甲基聯(lián)苯胺儲(chǔ)存液，每孔100 μ L加至ELISA板，室溫避光反應(yīng)IOmin?20min,用2mol / L的硫酸每孔50 μ L,終止反應(yīng)；
[0049]步驟七,讀數(shù)和判定,讀數(shù):在終止反應(yīng)15min內(nèi)，用酶標(biāo)讀板儀讀取450nm波長(zhǎng)的每孔吸光度值，計(jì)算抑制率；判定條件:陰性對(duì)照OD值應(yīng)在0.8?1.4范圍內(nèi)，強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照抑制率應(yīng)大于85%，弱陽(yáng)性抑制率應(yīng)在35%?50%之間，如果實(shí)際值與此值偏離較大，則不具備判定條件，需重復(fù)或重新滴定各組份工作濃度。
[0050]進(jìn)一步，在步驟七中，抑制率的計(jì)算公式為(1-待檢樣品OD值/陰性樣品OD值)XlOOo
[0051]進(jìn)一步，樣品的抑制率大于60%判定為甲型流感病毒抗體陽(yáng)性，小于40%判定為陰性；40%?60%之間應(yīng)重復(fù)，若仍為此值可判定為弱陽(yáng)性。
[0052]本發(fā)明提供的基于共有表位甲型流感病毒抗體通用型競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法，采用包含甲型流感病毒特異性表位序列的多肽作為包被抗原，采用特異性型單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，以提高檢測(cè)特異性；應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法，酶標(biāo)二抗統(tǒng)一采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgGFc片段的多克隆抗體，能檢測(cè)除鼠以外的所有動(dòng)物，包括野生哺乳動(dòng)物和野生鳥(niǎo)類(lèi)等及人血清樣品中的甲型流感病毒抗體，排除宿主動(dòng)物種類(lèi)的限制；包被抗原和單克隆抗體均基于甲型流感病毒共有表位，檢測(cè)甲型流感病毒共有的型特異性抗體，不受感染病毒亞型限制。
[0053]本發(fā)明受檢抗體與檢測(cè)抗體(單克隆抗體)針對(duì)同一抗原表位，通過(guò)分析受檢抗體和檢測(cè)抗體與表位的結(jié)合是否存在競(jìng)爭(zhēng)、競(jìng)爭(zhēng)的強(qiáng)弱，判定是否存在特異性抗體，并對(duì)抗體滴度高低作定性分析。首先將包含甲型流感病毒型特異性共有表(擬)位序列的多肽與固相載體連接，形成固相抗原。加待檢樣品，樣品中的受檢抗體和固相抗原結(jié)合。加檢測(cè)抗體，檢測(cè)抗體與未結(jié)合受檢抗體的固相抗原結(jié)合。酶標(biāo)二抗與檢測(cè)抗體的FC片段結(jié)合，從而使檢測(cè)抗體間接地標(biāo)記上酶。固相載體上的酶量就代表檢測(cè)抗體的量(檢測(cè)抗體結(jié)合量越大，受檢抗體含量越低，反之，檢測(cè)抗體結(jié)合量越小，受檢抗體含量越高)。加底物顯色后根據(jù)顏色深度(吸光度或光密度值，OD值)計(jì)算抑制率，進(jìn)行抗體定性檢測(cè)。適用于檢測(cè)動(dòng)物及人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中甲型流感病毒抗體。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0054]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的基于共有表位甲型流感病毒抗體通用型競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0055]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。[0056]下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。
[0057]如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的基于共有表位甲型流感病毒抗體通用型競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法包括以下步驟:
[0058]SlOl:采用分別含有甲型流感病毒核蛋白上的2個(gè)型特異性表位和甲型流感病毒基質(zhì)蛋白上的I個(gè)型特異性表位序列的多肽，使用前預(yù)混合，作為包被抗原；
[0059]S102:將包被抗原用0.05mol / L碳酸鹽緩沖液稀釋到工作濃度，加至96孔ELISA板，每孔加50 μ L，振蕩混勻，4°C保濕過(guò)夜，用PBST洗板5次，鋁箔紙密封4°C保存；
[0060]S103:采用2株針對(duì)甲型流感病毒核蛋白的型特異性單克隆抗體和I株針對(duì)甲型流感病毒基質(zhì)蛋白的型特異性單克隆抗體，使用前預(yù)混合，作為檢測(cè)抗體；
[0061]S104:加樣，將待檢血清用PBST-SM作1:5稀釋?zhuān)靠准?0 μ L，每份樣品使用兩孔，空白對(duì)照兩孔，各加PBST-SM50y L ;強(qiáng)陽(yáng)性血清對(duì)照兩孔，各孔加50 μ L ;弱陽(yáng)性血清對(duì)照兩孔，各加入50 μ L ;陰性血清對(duì)照兩孔，各加入50 μ L ;置37 °C溫箱振蕩溫育反應(yīng)30min ；
[0062]S105:將檢測(cè)抗體用PBST-SM稀釋到工作濃度，每孔加50 μ L ;置37°C溫箱振蕩溫育反應(yīng)30min ;用PBST洗板5次，甩干；加酶標(biāo)二抗，將HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgGFC片段的多克隆抗體用PBST-SM稀釋到工作濃度，每孔加50 μ L ;置37°C溫箱振蕩溫育反應(yīng)30min ;洗板，用PBST洗板5次，甩干；
[0063]S106:加底物和終止，按以下比例配置底物工作液:9.7mL乙酸一檸檬酸緩沖液+50 μ L30%過(guò)氧化氫+300 μ L四甲基聯(lián)苯胺儲(chǔ)存液，每孔100 μ L加至ELISA板，室溫避光反應(yīng)IOmin?20min,用2mol / L的硫酸每孔50 μ L,終止反應(yīng)；
[0064]S107:讀數(shù)和判定，讀數(shù):在終止反應(yīng)15min內(nèi)，用酶標(biāo)讀板儀讀取450nm波長(zhǎng)的每孔吸光度值，計(jì)算抑制率；判定條件:陰性對(duì)照OD值應(yīng)在0.8?1.4范圍內(nèi)，強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照抑制率應(yīng)大于85%，弱陽(yáng)性抑制率應(yīng)在35%?50%之間，如果實(shí)際值與此值偏離較大，則不具備判定條件，需重復(fù)或重新滴定各組份工作濃度。
[0065]在步驟S107中，抑制率的計(jì)算公式(I)，I (%)= (1-待檢樣品OD值/陰性樣品OD 值)XlOO ；
[0066]判定:樣品的抑制率大于60%判定為甲型流感病毒抗體陽(yáng)性，小于40%判定為陰性；40%?60%之間應(yīng)重復(fù)，若仍為此值可判定為弱陽(yáng)性；
[0067]本發(fā)明具體包括以下步驟:
[0068]1.1包被抗原，采用分別含有甲型流感病毒核蛋白上的2個(gè)型特異性表位和甲型流感病毒基質(zhì)蛋白上的I個(gè)型特異性表位序列的多肽，使用前預(yù)混合，作為包被抗原；
[0069]1.2檢測(cè)抗體，采用2株針對(duì)甲型流感病毒核蛋白的型特異性單克隆抗體和I株針對(duì)甲型流感病毒基質(zhì)蛋白的型特異性單克隆抗體，使用前預(yù)混合，作為檢測(cè)抗體；
[0070]1.3操作步驟:試劑溶液如表I所示；
[0071]1.3.1抗原包被，將包被抗原用0.05mol / L碳酸鹽緩沖液稀釋到工作濃度，加至96孔ELISA板，每孔加50 μ L，振蕩混勻，4°C保濕過(guò)夜，用PBST洗板5次，鋁箔紙密封4°C保存；
[0072]1.3.2加樣，將待檢血清用PBST-SM作1:5稀釋?zhuān)靠准?0 μ L，每份樣品使用兩孔，空白對(duì)照兩孔，各加PBST-SM50 μ L ;強(qiáng)陽(yáng)性血清對(duì)照兩孔，各孔加50 μ L ;弱陽(yáng)性血清對(duì)照兩孔,各加入50 μ L ;陰性血清對(duì)照兩孔，各加入50 μ L ;
[0073]1.3.3溫育，置37°C溫箱振蕩溫育反應(yīng)30min ；
[0074]1.3.4加檢測(cè)抗體，將檢測(cè)抗體用PBST-SM稀釋到工作濃度，每孔加50 μ L ;
[0075]1.3.5溫育，置37°C溫箱振蕩溫育反應(yīng)30min ；
[0076]1.3.6洗板，用PBST洗板5次，甩干；
[0077]1.3.7加酶標(biāo)二抗，將HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgGFC片段的多克隆抗體用PBST-SM稀釋到工作濃度，每孔加50μ L ;
[0078]1.3.8溫育，置37°C溫箱振蕩溫育反應(yīng)30min ；
[0079]1.3.9洗板，用PBST洗板5次，甩干；
[0080]1.3.10加底物和終止，按以下比例配置底物工作液:9.7mL乙酸一檸檬酸緩沖液+50 μ L30 %過(guò)氧化氫+300 μ L四甲基聯(lián)苯胺儲(chǔ)存液，每孔100 μ L加至ELISA板，室溫避光反應(yīng)10min~20min,用2mol / L的硫酸每孔50 μ L,終止反應(yīng)；
[0081]1.3.11讀數(shù)和判定,讀數(shù):在終止反應(yīng)15min內(nèi)，用酶標(biāo)讀板儀讀取450nm波長(zhǎng)的每孔吸光度值(0D值)，計(jì)算抑制率(I)，I (%) = (1-待檢樣品OD值/陰性樣品OD值)XlOO ；
[0082]判定條件:陰性對(duì)照OD值應(yīng)在0.8~1.4范圍內(nèi)，強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照抑制率應(yīng)大于85%，弱陽(yáng)性抑制率應(yīng)在35%~50%之間，如果實(shí)際值與此值偏離較大，則不具備判定條件，需重復(fù)或重新滴定各組份工作濃度；
[0083]判定:樣品的抑制率大于60%判定為甲型流感病毒抗體陽(yáng)性，小于40%判定為陰性；40%~60%之間應(yīng)重復(fù)，若仍為此值可判定為弱陽(yáng)性；
[0084]表1試劑溶液
[0085]
【權(quán)利要求】
1.一種基于共有表位甲型流感病毒抗體通用型競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法，其特征在于，該基于共有表位甲型流感病毒抗體通用型競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法包括以下步驟: 步驟一，采用分別含有甲型流感病毒核蛋白上的2個(gè)型特異性表位和甲型流感病毒基質(zhì)蛋白上的1個(gè)型特異性表位序列的多肽，使用前預(yù)混合，作為包被抗原； 步驟二，將包被抗原用0.05mol / L碳酸鹽緩沖液稀釋到工作濃度，加至96孔ELISA板，每孔加50 μ L，振蕩混勻，4°C保濕過(guò)夜，用PBST洗板5次，鋁箔紙密封4°C保存； 步驟三，采用2株針對(duì)甲型流感病毒核蛋白的型特異性單克隆抗體和I株針對(duì)甲型流感病毒基質(zhì)蛋白的型特異性單克隆抗體，使用前預(yù)混合，作為檢測(cè)抗體； 步驟四，加樣，將待檢血清用PBST-SM作1:5稀釋?zhuān)靠准?0 μ L，每份樣品使用兩孔，空白對(duì)照兩孔，各加PBST-SM50 μ L ;強(qiáng)陽(yáng)性血清對(duì)照兩孔，各孔加50 μ L ;弱陽(yáng)性血清對(duì)照兩孔，各加入50 μ L ;陰性血清對(duì)照兩孔，各加入50 μ L ;置37°C溫箱振蕩溫育反應(yīng)30min ；步驟五，將檢測(cè)抗體用PBST-SM稀釋到工作濃度，每孔加50 μ L ;置37°C溫箱振蕩溫育反應(yīng)30min ;用PBST洗板5次，甩干；加酶標(biāo)二抗，將HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgGFC片段的多克隆抗體用PBST-SM稀釋到工作濃度，每孔加50 μ L ;置37°C溫箱振蕩溫育反應(yīng)30min ;洗板，用PBST洗板5次，甩干； 步驟六，加底物和終止，按以下比例配置底物工作液:9.7mL乙酸一檸檬酸緩沖液+50 μ L30%過(guò)氧化氫+300 μ L四甲基聯(lián)苯胺儲(chǔ)存液，每孔100 μ L加至ELISA板，室溫避光反應(yīng)10min~20min,用2mol / L的硫酸每孔50 μ L,終止反應(yīng)； 步驟七，讀數(shù)和判定，讀數(shù):在終止反應(yīng)15min內(nèi)，用酶標(biāo)讀板儀讀取450nm波長(zhǎng)的每孔吸光度值，計(jì)算抑制率；判定條件:陰性對(duì)照OD值應(yīng)在0.8~1.4范圍內(nèi)，強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照抑制率應(yīng)大于85 %，弱陽(yáng)性抑制率應(yīng)在35 %~50%之間，如果實(shí)際值與此值偏離較大，則不具備判定條件，需重復(fù)或重新滴定各組份工作濃度。
2.如權(quán)利要求1所述的基于共有表位甲型流感病毒抗體通用型競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法，其特征在于，在步驟七中，抑制率的計(jì)算公式為(1-待檢樣品OD值/陰性樣品OD值)XlOOo
3.如權(quán)利要求1或2所述的基于共有表位甲型流感病毒抗體通用型競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法，其特征在于，樣品的抑制率大于60%判定為甲型流感病毒抗體陽(yáng)性，小于40%判定為陰性；40%~60%之間應(yīng)重復(fù)，若仍為此值可判定為弱陽(yáng)性。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103901202SQ201410135641
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年4月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月4日
【發(fā)明者】張富強(qiáng), 張文東, 范泉水, 宋建領(lǐng), 趙煥云, 張應(yīng)國(guó), 胡挺松, 邱薇, 鄭穎 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心