一種用于檢測山羊副流感病毒3型和小反芻獸疫病毒的引物對的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動物病毒學(xué)與動物傳染病學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種檢測山羊副流感病毒3型和小反芻獸疫病毒的引物對。
【背景技術(shù)】
[0002]山羊副流感病毒 3 型(Caprine parainfluenza virus type 3，CPIV3)是副黏病毒科(Paramyxoviridae)副黏病毒亞科(Paramyxovirinae)呼吸道病毒屬(Respirovirus)的成員，該病毒可導(dǎo)致山羊輕重不等的呼吸道感染，如感冒、咳嗽、眼鼻分泌物增加、支氣管炎、毛細(xì)支氣管炎和肺炎等。2014年本實驗室首次從表現(xiàn)為嚴(yán)重呼吸道癥狀的山羊臨床病料中分離鑒定出該病毒(屬國內(nèi)外首次)，通過人工感染試驗證明了該病毒對山羊的致病性。小反當(dāng)獸疫(Peste des petits ruminants virus，PPRV)是副黏病毒科(Paramyxovirinae)麻疹病毒屬(Morbillivirus)的成員，可導(dǎo)致山羊、綿羊等小反當(dāng)動物發(fā)熱、眼鼻出現(xiàn)大量分泌物、肺炎、上消化道潰瘍和腹瀉等臨床癥狀，亞臨床感染的山羊可通過分泌物和排泄物持續(xù)排毒。
[0003]病毒分離是檢測病原的常用方法，但其耗時較長且不利于臨床快速診斷，RT-PCR方法與之相比更加簡便快速，適合實驗室診斷。CPIV3為本實驗室新發(fā)現(xiàn)的病毒，PPRV自2014年傳入國內(nèi)多數(shù)省區(qū)后危害巨大，二者均為引起山羊呼吸道疫病的主要病原，臨床上存在混合感染，需要通過分子生物學(xué)方法來區(qū)分兩者。目前臨床上僅有檢測PPRV的RT-PCR方法，但是，單獨檢測CPIV3和同時檢測CPIV3和PPRV的RT-PCR方法尚未投入應(yīng)用。
[0004]CPIV3基質(zhì)蛋白(M)基因和PPRV核蛋白(N)基因序列高度保守，因此，針對CPIV3M蛋白基因和PPRV N蛋白基因的保守區(qū)進行雙重RT-PCR檢測方法的建立，能夠提高RT-PCR檢測方法的特異性和敏感性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]技術(shù)問題
[0006]本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、特異性強、敏感性高、成本低，能單獨或/和同時檢測CPIV3和PPRV的引物對；所述CPIV3為山羊副流感病毒3型，PPRV為小反芻獸疫病毒。
[0007]技術(shù)方案
[0008]本發(fā)明參考GenBank登錄的山羊副流感病毒3型M基因序列(GenBank登錄號:KJ850331)以及小反芻獸疫病毒N基因序列(GenBank登錄號:JN647718)，利用MPprimer軟件設(shè)計了 10組引物組合(共20對引物)，然后使用多因素引物特異性評估系統(tǒng)MFEprimer對所有引物組合進行嚴(yán)格的特異性評估，最終選擇了未發(fā)現(xiàn)存在非特異性擴增的引物對組合引物對A (346bp)、引物對B (189bp)。
[0009]—種檢測山羊副流感病毒3型和小反芻獸疫病毒的引物對，其特征在于，包括引物對A和/或引物對B:
[0010]弓丨物對A，包括引物I和引物2:
[0011]引物1: 5，-GCAATCCACCAAAGCATGGGGT-3，；
[0012]引物2:5’ -GGGGCAAGTGCTACTTTTTGAGCA-3’ ；
[0013]引物對B，包括引物3和引物3:
[0014]引物3:5 ’ -GCTGACTCAGAACTGAGAAGGTGGGT-3 ’ ；
[0015]引物4:5，-TGCAATCCTTGGCTTGTTGCCG-3，。
[0016]用所述引物對A和引物對B擴增待測樣本RNA，如擴增產(chǎn)物同時出現(xiàn)346bp和189bp兩條條帶，則待測樣本為陽性，即山羊副流感病毒3型和小反芻獸疫病毒同時存在；如擴增產(chǎn)物出現(xiàn)346bp條帶，則待測樣本山羊副流感病毒3型為陽性，即山羊副流感病毒3型存在；如擴增產(chǎn)物出現(xiàn)189bp條帶，則待測樣本小反芻獸疫病毒為陽性，即小反芻獸疫病毒存在；如擴增產(chǎn)物無346bp和189bp條帶，判為陰性，即山羊副流感病毒3型和小反芻獸疫病毒都不存在。
[0017]用所述引物對A擴增待測樣本RNA，如擴增產(chǎn)物出現(xiàn)346bp條帶，則待測樣本判為陽性，即山羊副流感病毒3型存在；如擴增產(chǎn)物無346bp，判為陰性，即山羊副流感病毒3型不存在。
[0018]用所述引物對B擴增待測樣本RNA，如擴增產(chǎn)物出現(xiàn)189bp條帶，則待測樣本判為陽性，即小反芻獸疫病毒存在；如擴增產(chǎn)物無189bp，判為陰性，即小反芻獸疫病毒不存在。
[0019]所述的一種檢測山羊副流感病毒3型和小反芻獸疫病毒的引物對用于檢測待測樣本病毒的方法，包括:
[0020](I)待測樣本病毒RNA的提取:取200 μ L待測樣本血清/鼻拭子溶解液，或取10mg的動物組織加入ImL PBS緩沖液進行充分研磨，_70°C反復(fù)凍融3次，12000rpm 4°C離心lOmin，取上清液200 μ L置于1.5mL的EP管中，加入Trizol試劑800 μ L，混勻后室溫靜置5min ;加入氯仿200 yL，振蕩30s，室溫靜置3min，12000rpm 4°C離心15min ;轉(zhuǎn)移上清至新的1.5mL的EP管中，加入與上清等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置lOmin，12000rpm 4°C離心1min ;加入75%的乙醇ImL洗滌，12000rpm4°C離心5min，棄去液體，這時候可以看到EP管底部有少量白色沉淀，室溫干燥5min ;加入RNA溶解液20 μ L溶解沉淀，即為檢測用待檢樣品RNA ；
[0021](2)采用20 yL的RT-PCR反應(yīng)體系，在0.2ml PCR反應(yīng)管中分別加入2XR_MixBufferlO μ L，CPIV3 上下游引物各 0.5 μ L，PPRV 上下游引物各 0.7 μ L，E-Mix 0.4 μ L，RNA模版4 μ L，無Rnase水加至總體積，混勾；
[0022](3)擴增條件為:45 °C 反轉(zhuǎn)錄 40min ；94 °C 預(yù)變性 5min ；94 °C 30s，54 °C 30s，72°C 45s，共35個循環(huán)；最后72°C延伸1min ；
[0023](4)取PCR產(chǎn)物于I %的瓊脂糖凝膠上電泳。
[0024]有益效果
[0025]本發(fā)明根據(jù)GenBank中發(fā)表的有關(guān)山羊副流感病毒3型(CPIV3)和小反芻獸疫病毒(PPRV)的基因序列，經(jīng)過序列比對分析，選取CPIV3M基因(GenBank登錄號:KJ850331)和PPRVN基因(GenBank登錄號:JN647718)中保守的片段設(shè)計并合成一對特異性引物，對CPIV3和PPRV進行RT-PCR擴增，得到約346bp和189bp的特異性條帶。
[0026]本研究建立的山羊副流感病毒3型和小反芻獸疫病毒雙重RT-PCR檢測方法對其他常見山羊病原體(山羊痘病毒、藍(lán)舌病病毒、邊界病病毒、呼吸道合胞病毒、牛病毒性腹瀉病毒、偽狂犬病毒)均無反應(yīng)；敏感性試驗表明，最小檢出量為103ng/μ L。
[0027]病毒感染山羊的血清、鼻拭子等RNA提取物用本發(fā)明建立的RT-PCR方法檢測，均擴增出相應(yīng)片段，適用于臨床檢測。
【附圖說明】
[0028]圖1:雙重RT-PCR引物最佳量的測定結(jié)果
[0029]M表示Trans2K plus DNAMarker ;1_5泳道表示在固定CPIV3引物的量為0.5 μ L情況下，PPRV引物量分別為1.5 μ L、1.0 μ L、0.7 μ L、0.5 μ L、0.3 μ L的結(jié)果；泳道6為陰性對照。圖2:雙重RT-PCR最佳退火溫度的測定結(jié)果
[0030]M 表示 Trans2K plus DNAMarker ;泳道 1-8 退火溫度分別為 55°C、54°C、53°C、52 °C、51°C、50 °C、49 °C、48 °C ;泳道 9 為陰性對照。
[0031 ] 圖3:CPIV3和PPRV雙重RT-PCR擴增結(jié)果
[0032]M 表示 Trans2K plus DNAMarker ;泳道 I 為陰性對照；泳道 2 為 PPRV RT-PCR 擴增結(jié)果；泳道3為CPIV3RT-PCR擴增結(jié)果；泳道4為CPIV3和PPRV雙重RT-PCR擴增結(jié)果。圖4:特異性試驗電泳結(jié)果圖
[0033]泳道I為山羊副流感病毒3型和小反芻獸疫病毒；泳道2-7分別為:山羊痘病毒、藍(lán)舌病病毒、邊界病病毒、呼吸道合胞病毒、牛病毒性腹瀉病毒、偽狂犬病毒；泳道8為陰性對照；M 表不 Trans2Kplus DNA Marker0
[0034]圖5:敏感性試驗電泳結(jié)果圖
[0035]M表示Trans2K plus DNA Marker ;泳道1-15為連續(xù)10倍稀釋的RNA模板；泳道16為陰性對照。
【具體實施方式】
[0036]I引物設(shè)計與合成
[0037]CPIV3為本實驗室新發(fā)現(xiàn)的病毒，此前雖已公開發(fā)表，但還沒有對外公開發(fā)放，PPRV自2014年傳入國內(nèi)多數(shù)省區(qū)后危害巨大，二者均為引起山羊呼吸道疫病的主要病原，臨床上存在混合感染，需要通過分子生物學(xué)方法來區(qū)分兩者。目前臨床上僅有檢測PPRV的RT-PCR方法，但是，單獨檢測CPIV3和同時檢測CPIV3和PPRV的RT-PCR方法尚未投入應(yīng)用。
[0038]引物設(shè)計是決定多重PCR成敗的關(guān)鍵。本發(fā)明通過長期研究和對本實驗室新發(fā)現(xiàn)的病毒CPIV3的系統(tǒng)性研究，通過序列分析比對，分別選擇CPIV3M蛋白基因和PPRVN蛋白基因的保守區(qū)進行引物設(shè)計，在確保鑒定病原正確的同時，又避免出現(xiàn)同種不同株病原的漏檢情況。本發(fā)明所使用的引物利用多重PCR引物設(shè)計系統(tǒng)MPprimer軟件設(shè)計完成，在設(shè)計多重引物時，除考慮單對引物的Tm值、GC含量、AG和引物是否特異等因素外，還確保了這些引物對之間有相近的Tm值，同時對各個擴增產(chǎn)物的大小進行了限定，保證不同的擴增產(chǎn)物能夠很清晰地用肉眼分辨。當(dāng)引物設(shè)計完成時，還需對各個引物對的特異性進行嚴(yán)格地審查，確保引物對不存在非特異性擴增。
[0039]參考GenBank登錄的山羊副流感病毒3型M基因序列(GenBank登錄號:KJ850331)以及小反芻獸疫病毒N基因序列(GenBank登錄號:JN647718)，利用MPprimer軟件設(shè)計了10組引物組合(共20對引物)，然后使用多因素引物特異性評估系統(tǒng)MFEprimer對所有引物組合進行嚴(yán)格的特異性評估，最終選擇了未發(fā)現(xiàn)存在非特異性擴增的引物對組合引物對A(346bp)、引物對 B(189bp)。
[0040]引物對A:
[0041]引物1:5’ -GCAATCCACCAAAGCATGGGGT-3’，在基因組中的位置為 134_155bp ；
[0042]引物2:5’ -GGGGCAAGTGCTACTTTTTGAGCA-3’，在基因組中的位置為 456_479bp
[0043]引物對B:
[0044]引物3:5’ -GCTGACTCAGAACTGAGAAGGTGGGT-3’，在基因組中的位置為 555_580bp ；
[0045]引物4:5’ -TGCAATCCTTGGCTTGTTGCCG-3’，在基因組中的位置為 732_753bp
[0046]2 總 RNA 提取
[0047]取200 μ L CPIV3 病毒液(16TCID5q)，(李文良等，A novel parainfluenzavirus type 3(PIV3)identified from goat herds with respiratory diseases ineastern China.Veterinary Microb1logy, 2014Nov 7 ; 174 (1-2): 100-106.)/PPRV 弱毒苗(14TCIDm) (PPRVNigeria 75/1株，購自新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司)置于1.5mL的EP管(RNase free)中，加入Trizol試劑800 μ L，混勻后室溫靜置5min ;加入氯仿200 μ L，振蕩30s，室溫靜置3min，12000rpm 4°C離心15min ;轉(zhuǎn)移上清至新的1.5mL的EP管(RNase free)中，加入與上清等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置lOmin，12000rpm4°