計(jì)算優(yōu)化的廣泛反應(yīng)性h1n1流感抗原的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 交叉引用相關(guān)申請(qǐng)
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年11月27日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/730, 186的權(quán)益，在此 整體引入該申請(qǐng)的內(nèi)容。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開涉及優(yōu)化的流感血凝素蛋白，該流感血凝素蛋白對(duì)H1N1病毒分離物引起 廣泛的反應(yīng)性免疫應(yīng)答，以及該流感血凝素蛋白作為疫苗的使用。
【背景技術(shù)】
[0004] 流感病毒是正粘病毒科的成員。有3個(gè)亞型的流感病毒，分別命名為A型流感病 毒，B型流感病毒和C型流感病毒。流感病毒的病毒粒子含有分段的負(fù)股（negative-sense) 的RNA基因組，其編碼下列蛋白：血凝素（HA)、神經(jīng)氨酸酶（NA)、基質(zhì)（M1)、質(zhì)子離子通道 蛋白（M2)、核蛋白（NP)、聚合酶堿性蛋白1(PB1)、聚合酶堿性蛋白2(PB2)、聚合酶酸性蛋白 (PA)、非結(jié)構(gòu)蛋白2 (NS2)。HA、NA、Ml和M2為膜相關(guān)蛋白，而NP、PB1、PB2、PA和NS2為核 衣殼相關(guān)蛋白。在流感病毒粒子中Ml蛋白是最豐富的蛋白。HA和NA蛋白為包膜糖蛋白， 負(fù)責(zé)病毒的附著和病毒粒子滲入細(xì)胞，并且對(duì)于病毒中和和保護(hù)性免疫來(lái)說(shuō)是主要的免疫 顯性表位來(lái)源。HA和NA蛋白兩者都被認(rèn)為是預(yù)防性流感病毒疫苗的最重要成分。
[0005] 每年，僅在美國(guó)，季節(jié)性流感都會(huì)導(dǎo)致超過(guò)300, 000人住院和36,000人死亡 (Simonsen等，LancetInfectDis7:658-66,2007)。在 2009 年，新流感病毒H1N1 的出現(xiàn) 演示了新的流感大流行能夠如何迅速地席卷全球。
[0006] 目前，在美國(guó)有兩種許可的流感疫苗方式，分別為滅活的裂解疫苗和減毒活疫苗。 滅活疫苗可以有效地誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，但通常不能很好地引起細(xì)胞免疫應(yīng)答。因?yàn)榭赡?會(huì)增加感染的風(fēng)險(xiǎn)，活毒疫苗不能施用于免疫功能低下者和懷孕的病人。因此，存在對(duì)更廣 泛的保護(hù)性流感病毒疫苗的需要。 發(fā)明概要
[0007] 本發(fā)明公開了優(yōu)化的H1N1流感HA多肽的產(chǎn)生，該優(yōu)化的H1N1流感HA多肽用于 引發(fā)針對(duì)H1N1流感病毒分離物的廣泛反應(yīng)性免疫應(yīng)答。優(yōu)化的HA多肽是基于選定的來(lái)自 1918-2012的分離的H1N1病毒，通過(guò)一系列的HA蛋白比對(duì)（alignments)，以及隨后產(chǎn)生共 有序列而開發(fā)的。
[0008] 本發(fā)明提供了重組流感病毒HA多肽，該重組流感病毒HA多肽具有優(yōu)化的氨基酸 序列，用于對(duì)H1N1流感引起廣泛的反應(yīng)性免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，所述HA多肽包含 氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、 SEQIDN0:5、SEQIDN0:6 或SEQIDN0:7 相比，至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、或至少99%是相同的。在一些實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列相對(duì)于SEQIDNO: 1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6 或SEQIDNO: 7,包括不超過(guò)5個(gè)、不超過(guò)6個(gè)、不超過(guò)7個(gè)、不超過(guò)8個(gè)、不超過(guò)9個(gè)、或不超過(guò)10個(gè)的氨 基酸置換。在一些實(shí)施方案中，HA多肽包含SEQIDNO:8。在一些實(shí)施方案中，流感HA多 肽缺少N末端的蛋氨酸殘基。
[0009] 本發(fā)明也提供了編碼重組HA多肽的分離的核酸分子和載體。進(jìn)一步提供了包括 這樣的載體的分離的細(xì)胞。
[0010] 本發(fā)明也提供了包括本文所公開的優(yōu)化的HA多肽的流感病毒樣粒子（VLP)和融 合蛋白。
[0011] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了組合物，所述組合物包含在藥學(xué)上可接受的載體中的本發(fā)明 所公開的優(yōu)化的流感HA多肽、融合蛋白或VLP。本公開也提供通過(guò)對(duì)受試對(duì)象施用所公開 的組合物、融合蛋白或VLP而引起對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答的方法。
[0012] 本發(fā)明也提供了通過(guò)對(duì)受試對(duì)象施用包括VLP的組合物而使受試對(duì)象對(duì)流感病 毒免疫的方法，該VLP含有優(yōu)化的HA多肽。
[0013] 通過(guò)以下參考附圖的詳細(xì)描述，本發(fā)明上述的和其它的目標(biāo)、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得 更加清晰。
[0014] 附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0015] 圖1是根據(jù)方法X-1的用于生成H1N1HA共有序列的工藝的原理圖。
[0016] 圖2是根據(jù)方法X-2的用于生成H1N1HA共有序列的工藝的原理圖。
[0017] 圖3是根據(jù)方法X-3的用于生成H1N1HA共有序列的工藝的原理圖。
[0018] 圖4是根據(jù)方法X-4的用于生成H1N1HA共有序列的工藝的原理圖。
[0019] 圖5是根據(jù)方法X-5的用于生成H1N1HA共有序列的工藝的原理圖。
[0020] 圖6是根據(jù)方法X-6的用于生成H1N1HA共有序列的工藝的原理圖。
[0021] 圖7是根據(jù)方法A-5的用于生成H1N1HA共有序列的工藝的原理圖。
[0022] 圖8A-8B展示了在此處闡明為SEQIDNO:1-7的H1N1HA蛋白的序列比對(duì)。
[0023] 圖9A-9F的圖展示了血凝抑制（HAI)血清抗體效價(jià)，該血凝抑制血清抗體效價(jià)來(lái) 自針對(duì)H1N1流感分離物的群組的經(jīng)接種疫苗（0、4、12周）的小鼠。在第14周使用H1N1流 感病毒確定每個(gè)疫苗組的HAI效價(jià)。所展示是的接種VLP的小鼠的HAI效價(jià)，所述VLP包含 方法X-1HA(圖9A)、方法X-2HA(圖9B)、方法X-3HA(圖9C)、方法X-4HA(圖9D)、方法 X-5HA(圖9E)、和方法X-6HA(圖9F)。數(shù)值表示log2轉(zhuǎn)化效價(jià)的幾何平均效價(jià)（+95% 置信區(qū)間）。
[0024] 序列表
[0025] 如37C.F.R1.822中定義，通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)字母縮寫表示核苷酸堿基、三字母代碼 表示氨基酸，而示出列于所附的序列表中的核酸和氨基酸序列。每個(gè)核酸序列只有一條鏈 被表示，而互補(bǔ)鏈被理解為通過(guò)任意參照所顯示的鏈而被包括。序列表以2013年9月6日 創(chuàng)建的、大小42. 9KB的ASCII文本文件的形式提交。在此通過(guò)參考引入本發(fā)明。在所附序 列表中：
[0026] SEQIDN0:l-7是優(yōu)化的H1N1HA蛋白的氨基酸序列，這些序列也在圖8中展示。
[0027]SEQIDN0:8是優(yōu)化的H1N1HA蛋白的共有氨基酸序列。
【具體實(shí)施方式】
[0028] I?縮寫
[0029] COBRA :計(jì)算優(yōu)化的廣泛反應(yīng)性抗原
[0030] HA :血凝素
[0031] HAI :血凝抑制
[0032] HRP :辣根過(guò)氧化物酶
[0033] Ml :基質(zhì)蛋白1
[0034] NA :神經(jīng)氨酸酶
[0035] PFU :空斑形成單位
[0036] VLP :病毒樣顆粒
[0037] II.術(shù)語(yǔ)和方法
[0038] 除非另有說(shuō)明，以常規(guī)用法使用技術(shù)術(shù)語(yǔ)。分子生物學(xué)中常用術(shù)語(yǔ)的定義可 在以下中找到：BenjaminLewin，GenesV，OxfordUniversityPress出版，1994(ISBN 0-19-854287-9) ;Kendrew等（編），TheEncyclopediaofMolecularBiology，Blackwell ScienceLtd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9);以及RobertA.Meyers(ed.)，Molecular BiologyandBiotechnology：aComprehensiveDeskReference,VCHPublishers,Inc. 出版，1995(ISBN1-56081-569-8)。
[0039] 為便于理解本發(fā)明的各實(shí)施方案，下面提供了對(duì)特定術(shù)語(yǔ)的解釋：
[0040]佐劑：非特異性提高對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的物質(zhì)或載體（vehicle)。佐劑可以包括 吸收抗原的礦物質(zhì)（明礬、氫氧化鋁、或磷酸鹽）的懸浮液；或者油包水的乳劑，在所述油 包水的乳劑中，抗原溶液被乳化在礦物油中（例如：弗氏不完全佐劑），有時(shí)包含殺死的分 枝桿菌（弗氏完全佐劑）以進(jìn)一步提高抗原性。免疫刺激性寡核苷酸（例如包括CpG基 序的那些）也可以作為佐劑使用（例如見美國(guó)專利號(hào)6, 194, 388 ;6, 207, 646 ;6, 214, 806 ; 6, 218, 371 ;6, 239, 116 ;6, 339, 068 ;6, 406, 705 ;和 6, 429, 199)。佐劑也包括生物分子，例如 共刺激分子。典型的生物佐劑包括IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-a、INF-y、G-CSF、LFA-3、 CD72、B7-2、0X-40L和 41BBL。
[0041] 施用：按本發(fā)明的用法，將組合物施用于受試對(duì)象的含義是給予、施加或帶入組合 物與受試對(duì)象相接觸。施用可以通過(guò)多種途徑中的任一途徑來(lái)完成，例如局部、口服、皮下、 肌肉、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)和皮內(nèi)。
[0042] 抗體：具有特定氨基酸序列的由B淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫球蛋白分子?？贵w是在 人或其它動(dòng)物體內(nèi)通過(guò)特定抗原（免疫原）引起的?？贵w的特征在于以某種可論證的方式 特異性地與抗原的反應(yīng)，抗體和抗原各自被彼此所定義。"引起抗體應(yīng)答"是指抗原或其它 分子誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的能力。
[0043] 抗原：可以在動(dòng)物體內(nèi)刺激抗體產(chǎn)生或T細(xì)胞應(yīng)答的化合物、組合物、或物質(zhì)，其 中包括注射或吸收到動(dòng)物體內(nèi)的組合物?？乖c特異性的體液或細(xì)胞免疫的產(chǎn)物（包括由 異種免疫原所誘導(dǎo)的那些）進(jìn)行反應(yīng)。在所公開的組合物和方法的一些實(shí)施方案中，所述 抗原是流感HA蛋白。
[0044] 密碼子優(yōu)化："密碼子優(yōu)化"核酸是指已經(jīng)改變的核酸序列，以使得這些密碼子對(duì) 于在特定的系統(tǒng)（如物種的群體中的特定物種）中的表達(dá)是最理想的。例如，為了在哺乳 動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，可以優(yōu)化核酸序列。密碼子的優(yōu)化不改變所編碼的蛋白的氨基酸序列。
[0045]融合蛋白：通過(guò)從編碼兩個(gè)不同（異源）蛋白的至少部分的核酸序列所設(shè)計(jì)的核 酸序列的表達(dá)所生成的蛋白。為了創(chuàng)造融合蛋白，核酸序列必須在相同的閱讀框中并且含 有（containto)內(nèi)部終止密碼子。例如，融合蛋白包含融合至異種蛋白的流感HA。
[0046] 血凝素（HA):是流感病毒的表面糖蛋白。HA介導(dǎo)病毒粒子與宿主細(xì)胞的結(jié)合以及 隨后的病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。在該領(lǐng)域中許多流感HA蛋白的核苷酸和氨基酸序列都是已知 的，并且是公開可用的，例如那些存儲(chǔ)在GenBank中的序列。HA(連同NA)是兩種主要的流 感病毒抗原決定簇之一。
[0047] 免疫應(yīng)答：免疫系統(tǒng)的細(xì)胞（如B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或多形核細(xì)胞 (polymorphonucleocyte))對(duì)于刺激物（如抗原或疫苗）的應(yīng)答。免疫應(yīng)答可以包括參與 宿主防御反應(yīng)的主體（body)的任何細(xì)胞，例如包括分泌干擾素或細(xì)胞因子的上皮細(xì)胞。免 疫應(yīng)答包括但不限于先天免疫應(yīng)答或炎癥。本發(fā)明所使用的保護(hù)性免疫應(yīng)答是指保護(hù)對(duì)象 免于感染（預(yù)防感染或阻止與感染相關(guān)的疾病的發(fā)展）的免疫應(yīng)答。衡量免疫應(yīng)答的方法 在本領(lǐng)域中是已知的，例如測(cè)量淋巴細(xì)胞（如B或T細(xì)胞）的增殖和/或活性、細(xì)胞因子或 趨化因子的分泌、炎癥、抗體的產(chǎn)生等。
[0048] 免疫原：是在適合的條件下，可以刺激免疫應(yīng)答（例如在動(dòng)物內(nèi)的抗體的產(chǎn)生或T細(xì)胞的應(yīng)答）的化合物、組合物或物質(zhì)，免疫原包括注射或吸收到動(dòng)物體內(nèi)的組合物。本發(fā) 明所使用的"免疫原性組