合物"是包括免疫原（如HA多肽）的組合物。
[0049] 免疫：通過例如疫苗接種，使受試對象免受傳染病。
[0050] 流感病毒：分段的負(fù)鏈RNA病毒，其屬于正粘病毒科。有A、B和C三個型的流感病 毒。A型流感病毒可以感染多種鳥類和哺乳動物，其中包括人、馬、海洋哺乳動物、豬、雪貂 和雞類。在動物中，大多數(shù)A型流感病毒引起呼吸道和腸道的輕度局部感染。然而，高病原 性的A型流感毒株，如H5N1，在家禽中可以引起全身性的感染，并且死亡率可以達(dá)到100%。 在2009年，H1N1流感是引起人類流感的最普遍原因。在2009年，出現(xiàn)了豬源H1N1的新毒 株，其被世界衛(wèi)生組織公布為流行病。這一毒株稱為"豬流感"。H1N1A型流感病毒也是引 起1918年西班牙大流感、1976年FortDix流感爆發(fā)、以及1977-1978年俄羅斯流感傳染病 的原因。
[0051] 分離的："分離的"生物成分（如核酸、蛋白質(zhì)或病毒）已經(jīng)從其它生物成分（如細(xì) 胞碎片、或其它蛋白或核酸）中被充分地分離或者純化出來。已經(jīng)被"分離"的生物組分包 括那些采用標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化后的組分。該術(shù)語也包括重組核酸、蛋白質(zhì)或病毒（或VLP)、 以及化學(xué)合成的核酸或肽。
[0052] 連接基團(tuán)：在融合蛋白的兩個多肽之間起間隔物的作用的一個或多個氨基酸。
[0053] 基質(zhì)（Ml)蛋白：是發(fā)現(xiàn)于病毒包膜的流感病毒結(jié)構(gòu)蛋白。Ml被認(rèn)為起裝配和出 芽的功能。
[0054] 神經(jīng)氨酸酶（NA):是流感病毒的膜糖蛋白。NA參與病毒HA的細(xì)胞受體破壞，該破 壞是通過在感染的細(xì)胞表面上的碳水化合物部分切割末端唾液酸殘基來實(shí)現(xiàn)的。NA也自病 毒蛋白切割唾液酸殘基以阻止病毒的聚合。NA(連同HA)是兩種主要的流感病毒抗原決定 簇之一。
[0055] 可操作連接：當(dāng)以與第二核酸序列成功能關(guān)系的方式放置第一核酸序列時，所述 第一核酸序列是可操作地與第二核酸序列連接的。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄 或表達(dá)，該啟動子就是可操作地連接到編碼序列上。通常，可操作連接的DNA序列是連續(xù) 的，并在同一個閱讀框下必須連接兩個蛋白編碼區(qū)。
[0056] 優(yōu)化的流感HA蛋白：按本發(fā)明的用法，"優(yōu)化的流感HA蛋白"是指HA蛋白共有 序列，該HA蛋白共有序列是通過選定的在1918-2012之間分離的H1N1流感病毒的序列比 對生成的（如下面的實(shí)施例1所述）。針對在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)，經(jīng)由密碼子優(yōu)化和 RNA優(yōu)化（如增加RNA穩(wěn)定性）來進(jìn)一步或可以進(jìn)一步優(yōu)化編碼優(yōu)化的HA蛋白的核苷酸 序列。本發(fā)明所公開的優(yōu)化的流感HA蛋白（且在本文中被闡明為SEQIDNO:1-7)也被稱 為"COBRA"序列。設(shè)計優(yōu)化的HA多肽，以在受試對象中引起廣泛的免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的 上下文中，"廣泛反應(yīng)性"是指該蛋白序列在受試對象中引起免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答足以抑 制、中和或預(yù)防一系列廣泛的流感病毒（如在特定亞型中的大多數(shù)或全部的流感病毒）的 感染。在一些實(shí)例中，優(yōu)化的流感HA蛋白能夠針對大多數(shù)或全部H1N1流感病毒分離物引 起免疫應(yīng)答，例如保護(hù)性免疫應(yīng)答。
[0057]爆發(fā)：按本發(fā)明的用法，流感病毒"爆發(fā)"指在給定的年份中來自于單個國家內(nèi)的 病毒分離物的組群。
[0058] 藥學(xué)上可接受的載體：在本公開中有用的藥學(xué)上可接受的載體（載體 (vehicles))是常見的。在E.W.Martin的Remington'sPharmaceuticalSciences,Mack publishingCo.，Easton，PA，15thEdition(1975)中描述了適合一種或多種治療組合物的 藥物學(xué)輸送的組合物和制劑，例如一種或多種流感疫苗，以及額外的藥劑。
[0059]在一般情況下，載體的性質(zhì)取決于所利用的特定施用方式。例如，腸胃外制劑通常 包括可注射液體，其包括藥物學(xué)上和生理學(xué)上可接受的液體如水、生理鹽水、平衡鹽溶液、 葡萄糖水、甘油等作為載體。而對于固體組合物（例如粉末、丸劑、片劑、或膠囊的形式），常 規(guī)的無毒固體載體可包括，例如藥物級甘露醇、乳糖、淀粉、或硬脂酸鎂。除了生物學(xué)上的中 性生物載體外，被施用的藥物學(xué)組合物也可以包含少量無毒輔助物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、 防腐劑和pH緩沖劑等，例如醋酸鈉或山梨醇單月桂酸酯。
[0060] 多肽：是其中單體是通過酰胺鍵連接在一起的氨基酸殘基。當(dāng)氨基酸為a-氨基 酸時，無論是L型的光學(xué)異構(gòu)體或D型的光學(xué)異構(gòu)體都可以使用。本發(fā)明所使用的"多肽" 或"蛋白質(zhì)"這些術(shù)語意圖包含任何氨基酸序列和包括例如糖蛋白等經(jīng)修飾的序列。"多肽" 這一術(shù)語明確地用于涵蓋自然生成的蛋白質(zhì)，和那些通過重組或合成所產(chǎn)生的蛋白。術(shù)語 "殘基"或"氨基酸殘基"則是指合并入蛋白、多肽或肽的氨基酸。
[0061] 保守氨基酸置換是這樣的置換：在進(jìn)行保守氨基酸置換時，盡量對原蛋白屬性產(chǎn) 生最小的影響，也就是說，蛋白的結(jié)構(gòu)尤其是功能是保守的并且不能通過這樣的置換來顯 著地改變。保守置換的例子如下所示：
[0062]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 重組流感血凝素（HA)多肽，其包括氨基酸序列，所述氨基酸序列 (i) 與SEQIDNO: 1具有至少96 %的同一性或與SEQIDNO: 1的殘基2-566具有至少 96 %的同一性； (ii) 與SEQIDNO:2具有至少99%的同一性或與SEQIDNO:2的殘基2-566具有至 少99%的同一性； (iii) 與SEQIDNO:3具有至少99%的同一性或與SEQIDNO:3的殘基2-566具有至 少99%的同一性； (iv) 與SEQIDNO:4具有至少99%的同一性或與SEQIDNO:4的殘基2-566具有至 少99%的同一性； (V)與SEQIDNO:5具有至少98. 4%的同一性或與SEQIDNO:5的殘基2-566具有至 少98. 4%的同一1性； (vi) 與SEQIDNO:6具有至少99%的同一性或與SEQIDNO:6的殘基2-565具有至 少99%的同一性； (vii) 與SEQIDNO:7具有至少97%的同一性或與SEQIDNO:7的殘基2-566具有至 少97 %的同一性；或 (viii) 包括SEQIDNO:8。
2. 重組流感HA多肽，包括： (i) 相對于SEQIDNO:1的不超過10個氨基酸置換； (ii) 相對于SEQIDNO:2的不超過8個氨基酸置換； (iii) 相對于SEQIDNO:3的不超過6個氨基酸置換； (iv) 相對于SEQIDNO:4的不超過7個氨基酸置換； (V)相對于SEQIDNO: 5的不超過9個氨基酸置換； (vi) 相對于SEQIDNO:6的不超過6個氨基酸置換；或 (vii) 相對于SEQIDNO:7的不超過10個氨基酸置換。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的重組流感HA多肽，其包括下述的氨基酸序列：SEQIDNO: 1 的殘基 2-566、SEQIDNO:2 的殘基 2-566、SEQIDNO:3 的殘基 2-566、SEQIDNO:4 的 殘基 2-566、SEQIDNO:5 的殘基 2-566、SEQIDNO:6 的殘基 2-565 或SEQIDNO:7 的殘 基 2-566〇
4. 如權(quán)利要求1或2所述的重組流感HA多肽，其由以下氨基酸序列構(gòu)成：SEQIDNO: 1 的殘基 2-566、SEQIDNO:2 的殘基 2-566、SEQIDNO:3 的殘基 2-566、SEQIDNO:4 的 殘基 2-566、SEQIDNO:5 的殘基 2-566、SEQIDNO:6 的殘基 2-565 或SEQIDNO:7 的殘 基 2-566〇
5. 如權(quán)利要求1或2所述的重組流感HA多肽，其包括下述的氨基酸序列：SEQIDNO: 1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6 或SEQIDNO:7。
6. 如權(quán)利要求1或2所述的重組流感HA多肽，其由以下氨基酸序列構(gòu)成：SEQIDNO: 1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6 或SEQIDNO:7。
7. 分離的核酸，所述分離的核酸編碼如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的流感HA多肽。
8. 如權(quán)利要求7所述的分離的核酸，其中所述核酸是針對哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)經(jīng)密 碼子優(yōu)化的。
9. 載體，所述載體包括如權(quán)利要求7或8所述的核酸。
10. 如權(quán)利要求9所述的載體，所述載體進(jìn)一步包括啟動子，所述啟動子可操作地連接 至所述編碼流感HA多肽的核酸。
11. 分離的細(xì)胞，所述分離的細(xì)胞包括如權(quán)利要求9或10所述的載體。
12. 流感病毒樣顆粒（VLP)，所述流感病毒樣顆粒包括如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的 流感HA多肽。
13. 如權(quán)利要求12的流感VLP，所述流感VLP進(jìn)一步包括流感神經(jīng)氨酸酶（NA)蛋白、 流感基質(zhì)（Ml)蛋白、或它們兩者。
14. 流感VLP，所述流感VLP包括如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的流感HA多肽，且通過 在足以允許表達(dá)HA、Ml和NA蛋白的條件下，以編碼HA多肽的載體、編碼流感NA蛋白的載 體和編碼流感Ml蛋白的載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞而產(chǎn)生。
15. 融合蛋白，所述融合蛋白包括如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的流感HA多肽的。
16. 組合物，所述組合物包括如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的流感HA多肽、如權(quán)利要求 15所述的融合蛋白、或如權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述的VLP，和藥學(xué)上可接受的載體。
17. 在受試對象體內(nèi)引起對流感病毒的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括施用如權(quán)利要 求1-7中任一項(xiàng)所述的流感HA多肽、如權(quán)利要求16所述的融合蛋白、如權(quán)利要求12-14中 任一項(xiàng)所述的VLP、或如權(quán)利要求16所述的組合物。
18. 使受試對象對流感病毒免疫的方法，所述方法包括對受試對象施用組合物，所述組 合物包括如權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)所述的VLP和藥學(xué)上可接受載體。
19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述組合物進(jìn)一步包括佐劑。
20. 如權(quán)利要求18或19所述的方法，其中所述組合物通過肌肉注射施用。
21. 如權(quán)利要求18-20所述的方法，其中所述組合物包括約1-約25yg的所述VLP。
22. 如權(quán)利要求21的方法，其中所述組合物包括約15yg的所述VLP。
【專利摘要】本發(fā)明描述了用于針對H1N1流感病毒分離物引發(fā)廣泛反應(yīng)性免疫應(yīng)答的優(yōu)化的H1N1流感HA多肽的生成。優(yōu)化的HA多肽是基于選定的來自1918-2012的分離的H1N1病毒，通過一系列的HA蛋白比對，以及隨后的共有序列的產(chǎn)生而生成的。本發(fā)明提供了優(yōu)化的H1N1 HA多肽，和包括所述HA多肽的組合物、融合蛋白和VLP。本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼HA多肽的密碼子優(yōu)化的核酸序列。本發(fā)明也提供了在受試對象體內(nèi)引起針對流感病毒的免疫應(yīng)答的方法。
【IPC分類】A61K39-145, C12N15-44, C07K14-11, A61K38-16
【公開號】CN104797594
【申請?zhí)枴緾N201380060899
【發(fā)明人】T·M·羅斯, 小D·M·卡特, C·J·克里瓦爾
【申請人】高等教育聯(lián)邦系統(tǒng)-匹茲堡大學(xué)
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2013年11月27日
【公告號】CA2891682A1, EP2925773A1, US20140147459, WO2014085616A1