分離大豆蛋白的方法
【專利說明】分離大豆蛋白的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種分離大豆蛋白的方法，以及由所述方法獲得的純化的大豆蛋白、 0-伴大豆球蛋白（beta-Conglycinin)和胰蛋白酶抑制劑蛋白。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 大豆是人類和動物的一種重要的蛋白質(zhì)來源，無論以其未經(jīng)處理的、還是經(jīng)過處 理的形式。大豆提供了低成本蛋白的良好來源，并因其廣泛存在、具有獨(dú)特的化學(xué)組成、良 好的營養(yǎng)價(jià)值、廣泛的用途和有益健康的功效，已成為一種重要的世界商品。盡管低于約 5%的大豆蛋白可用于食品，但該百分比有可能增長。近幾年一家主要研宄機(jī)構(gòu)已經(jīng)重點(diǎn)研 宄了各個(gè)貯藏蛋白（如大豆球蛋白，伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制劑），并將它們與工 業(yè)上的重要功能特性和有益健康的功效聯(lián)系起來。盡管有了這種廣泛的研宄，各個(gè)這些蛋 白質(zhì)或其富集的部分還不能以低成本廣泛可用。
[0004] 大豆蛋白（即從大豆獲得的蛋白質(zhì)）還含有抗?fàn)I養(yǎng)因子，其阻止了食物中的營養(yǎng) 物質(zhì)的吸收。特別是在許多大豆蛋白中發(fā)現(xiàn)的胰蛋白酶抑制劑（TI)蛋白，其抑制胰蛋白酶 (一種存在于消化系統(tǒng)中的水解蛋白質(zhì)的絲氨酸蛋白酶）的活性。因此，盡管這些蛋白在其 它應(yīng)用中具有有益功能，但是如果用于食品或動物飼料成分的部分，這些蛋白質(zhì)會對消化 酶系統(tǒng)產(chǎn)生負(fù)面的影響，并可能導(dǎo)致營養(yǎng)不良和疾病。
[0005] 因此，為了降低大豆蛋白中天然存在的胰蛋白酶抑制劑蛋白的活性已經(jīng)采取了特 別的努力。一般方法是簡單地加熱大豆蛋白，該方法變性/破壞了胰蛋白酶抑制劑蛋白。然 而，這種技術(shù)也破壞或變性了大豆蛋白中的其他蛋白，從而減少了他們的蛋白功能（例如 形成凝膠、結(jié)合脂肪或乳化）。含有賴氨酸的蛋白質(zhì)對熱尤其敏感。加熱還能降低大豆蛋白 的水溶性。
[0006] 加熱大豆蛋白以破壞胰蛋白酶抑制劑（TI)蛋白的一種替代方法是將所述胰蛋白 酶抑制劑（TI)蛋白與大豆蛋白的其余部分分離。這種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是避免了熱，又能夠提供 分離的胰蛋白酶抑制劑（TI)蛋白（其本身可成為一種有用的藥用產(chǎn)品）。
[0007] 因此研宄努力集中在了大豆蛋白的純化以分離其中含有的胰蛋白酶抑制劑（TI) 蛋白。Bajpai等人（Foodchemistry，89(2005)，497-501)討論了使用固定化金屬親和層析 法結(jié)合胰蛋白酶抑制劑和大豆植物凝集素。
[0008] TO2011/082358、TO2011/082359 和TO2011/082360 全部涉及從大豆蛋白中分離和 純化胰蛋白酶抑制劑的的各個(gè)方面。
[0009] 發(fā)明目的
[0010] 盡管迄今為止取得了一定的進(jìn)展，仍然需要用于從大豆蛋白水性提取物或溶液純 化和分離蛋白的替代方法。 發(fā)明概要
[0011] 本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)了對大豆蛋白中各種蛋白質(zhì)具有選擇親和性的某些配體。
[0012] 因此，本發(fā)明的第一方面涉及分離大豆蛋白的方法，所述方法包含以下步驟：
[0013] i.提供大豆蛋白的水性提取物或大豆蛋白溶液，所述大豆蛋白提取物或溶液包含 至少兩種類型的大豆蛋白；
[0014] ii.使所述大豆蛋白水性提取物或溶液通過至少一個(gè)膨脹床吸附過程，其中所述 膨脹床吸附過程包括使所述大豆蛋白水性提取物或溶液與至少一種吸附樹脂接觸，所述吸 附樹脂選擇性地吸附至少第一類型的大豆蛋白以提供非結(jié)合蛋白組分和結(jié)合蛋白組分，所 述的吸附樹脂包含：
[0015]至少一種配體（L1)，所述至少一種配體（L1)包含芳族或雜芳族環(huán)系統(tǒng)和一個(gè)或 多個(gè)酸性基團(tuán)，或
[0016]至少一種配體（L2)，所述至少一種配體（L2)包含烷基胺或烷基芳基胺，其中所述 的在配體（L2)中的烷基胺或烷基芳基胺部分包含被選自下列的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)所取代的 胺：
[0017]a.芳基、芐基或雜芳基；
[0018]b.具有4-16碳原子的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基，
[0019] 或它們的組合；
[0020]iii.通過洗脫非結(jié)合蛋白組分或者洗脫結(jié)合蛋白組分從所述吸附樹脂分離所述 第一種類型的大豆蛋白，以及
[0021] iv.從所述吸附樹脂分離第二種類型的大豆蛋白以提供所述第一種類型的大豆蛋 白被去除了的第二種大豆蛋白組合物。
[0022] 在下面的本發(fā)明的詳細(xì)描述和所附的權(quán)利要求書中給出了該方法以及所述配體 L1和L2的進(jìn)一步細(xì)節(jié)。
[0023] 本發(fā)明還提供了由本發(fā)明方法獲得的大豆蛋白組合物。此外還提供了第一種組合 的大豆蛋白產(chǎn)品，其通過將由本發(fā)明方法獲得的變性的TI蛋白與由本發(fā)明方法獲得的TI 蛋白被去除了的第一種大豆蛋白組合物組合而成。通過將變性的TI蛋白與TI蛋白被去除 了的第二種大豆蛋白組合物組合獲得的第二種組合的大豆蛋白產(chǎn)品。
【附圖說明】
[0024] 圖1-19闡明了本發(fā)明實(shí)施例的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)凝膠。
[0025] 發(fā)明的詳細(xì)公開
[0026] 如上所述，本發(fā)明提供了分離大豆蛋白的方法，所述方法包含以下步驟：
[0027] i.提供大豆蛋白的水性提取物或大豆蛋白溶液，所述大豆蛋白提取物或溶液包含 至少兩種類型的大豆蛋白；
[0028] ii.使所述大豆蛋白水性提取物或溶液通過至少一個(gè)膨脹床吸附過程，其中所述 膨脹床吸附過程包括使所述大豆蛋白水性提取物或溶液與至少一種吸附樹脂接觸，所述吸 附樹脂選擇性地吸附至少第一類型的大豆蛋白以提供非結(jié)合蛋白組分和結(jié)合蛋白組分，所 述的吸附樹脂包含：
[0029]至少一種配體（L1)，所述至少一種配體（L1)包含芳族或雜芳族環(huán)系統(tǒng)和一個(gè)或 多個(gè)酸性基團(tuán)，或
[0030] 至少一種配體（L2)，所述至少一種配體（L2)包含烷基胺或烷基芳基胺，其中所述 的在配體（L2)中的烷基胺或烷基芳基胺部分包含被選自下列的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)所取代的 胺：
[0031] a.芳基、芐基或雜芳基；
[0032] b.具有4-16碳原子的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基，
[0033] 或它們的組合；
[0034] iii.通過洗脫非結(jié)合蛋白組分或者洗脫結(jié)合蛋白組分從所述吸附樹脂分離所述 第一種類型的大豆蛋白，以及
[0035] iv.從所述吸附樹脂分離第二種類型的大豆蛋白以提供所述第一種類型的大豆蛋 白被去除了的第二種大豆蛋白組合物。
[0036] 所述方法適宜按順序進(jìn)行，無插入步驟。
[0037] 大豆和大豆蛋白
[0038] 大豆，即黃豆（Glycinemax)，是生長于世界許多地方的豆科作物。大豆作為食用 油、高蛋白食物、食物成分和飼料以及多種工業(yè)產(chǎn)品的來源具有巨大的經(jīng)濟(jì)意義。
[0039] 大豆蛋白是大豆中存在的蛋白質(zhì)的通用術(shù)語。大豆粉含有至少50%的蛋白質(zhì)，由 大豆碎片磨制而成。由于其相對高的蛋白含量，許多應(yīng)用中需要大豆蛋白的組合物。除了 人和動物飼料，大豆蛋白具有形成凝膠、結(jié)合脂肪以及乳化的有用性質(zhì)。
[0040] 大豆蛋白不是均一的組分。根據(jù)由超離心分析得到的其沉淀系數(shù)，大豆蛋白傳統(tǒng) 上被分為以下四大組：2S(主要是白蛋白、酶和胰蛋白酶抑制劑），7S(主要是e-伴大豆球 蛋白），11S(主要是大豆球蛋白）和15S(主要是大豆球蛋白的二聚體）組，分別具有大約 25000、160000、350000和600000的峰值分子量。典型的商業(yè)方法通過水抽提可以產(chǎn)生大 約22%的2S、37%的7S、31%的11S和11%的15S蛋白，但是取決于種類、農(nóng)作物年份、操 作和進(jìn)行的熱處理，所述的數(shù)量可明顯不同。
[0041] 為了使這些蛋白彼此分離開發(fā)了復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)室方法。這些技術(shù)不能實(shí)際應(yīng)用于商 業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)。因?yàn)椴襟E中的小變化會顯著改變產(chǎn)品的最終組成，這些技術(shù)的一些也很難 重現(xiàn)。
[0042] 0-伴大豆球蛋白
[0043] 近來對獲得純化的0_伴大豆球蛋白組分的興趣不斷增加，主要對其有益性質(zhì)的 研宄，諸如降低膽固醇和預(yù)防某些類型的癌癥。伴大豆球蛋白是分子量大約180kDa的 三聚體蛋白。它由(~71kDa)、a(~67kDa)、和0 (~50kDa)三種亞基組成。
[0044] 大豆球蛋白和0-伴大豆球蛋白占了大豆中蛋白質(zhì)的大約70%。已經(jīng)推斷可以通 過改變這些蛋白的比例來改善在食物體系中大豆蛋白成分的功能特性。以前曾經(jīng)通過提高 大豆球蛋白對伴大豆球蛋白的比例來改善豆腐類大豆凝膠的產(chǎn)量和質(zhì)量，并為了營養(yǎng) 目的提高含硫氨基酸的含量。每單位蛋白中大豆球蛋白比0-伴大豆球蛋白多含3到4倍 的半胱氨酸和甲硫氨酸。因此認(rèn)為增加大豆球蛋白的含量并降低伴大豆球蛋白的含量 會增強(qiáng)蛋白質(zhì)量。
[0045] 膜蛋白酶抑制劑蛋白
[0046] 大豆蛋白中也含有大量的胰蛋白酶抑制劑蛋白（TI)。已知該抑制劑為絲氨酸蛋白 酶抑制劑，其抑制胰蛋白酶，并且也經(jīng)常抑制其它絲氨酸蛋白酶。胰蛋白酶抑制劑結(jié)合胰蛋 白酶的活性位點(diǎn)，從而阻礙肽鍵的催化斷裂?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)方法確定胰蛋白酶抑制劑的存 在和含量，所述標(biāo)準(zhǔn)方法包括使用標(biāo)記的胰蛋白酶特異性肽底物的競爭性實(shí)驗(yàn)，當(dāng)分析的 樣品中存在胰蛋白酶抑制劑時(shí)，所述的肽底物會以較低的速度降解。其它比較簡單的實(shí)驗(yàn) 是基于凝膠擴(kuò)散技術(shù)，其中活性胰蛋白酶分子裂解沉淀的蛋白底物，從而產(chǎn)生澄清的區(qū)帶， 其大小取決于胰蛋白酶抑制劑的存在與否。
[0047] 胰蛋白酶，一種絲氨酸蛋白酶，負(fù)責(zé)斷裂消化體系中的肽鍵（特別是在精氨酸或 賴氨酸處）。但是，如果胰蛋白酶抑制劑（特別是KTI)的存在會使大部分的胰蛋白酶失活， 消化的蛋白則未被降解。該胰蛋白酶抑制的影響可能包括胃部疼痛、胰腺增生（細(xì)胞增殖） 和/或肥大（細(xì)胞增大）。
[0048]Kunitz-胰蛋白酶抑制劑（KTI，也稱為Kunitz大豆胰蛋白酶抑制劑）是一類胰 蛋白酶抑制劑蛋白，其成員具有大約170-200個(gè)氨基酸，分子量在20至25kDa之間，并主要 作用于胰蛋白酶。Kunitz-胰蛋白酶蛋白酶抑制劑大多為單鏈多肽，由4個(gè)半胱氨酸連接 成兩個(gè)二硫橋，每個(gè)二硫橋形成的環(huán)中存在一個(gè)反應(yīng)性位點(diǎn)。第二類抑制劑含有60-85個(gè) 氨基酸，分子量范圍是6-10kDa，含有較高數(shù)目的二硫鍵，相對熱穩(wěn)定，在不同的連接位點(diǎn)對 胰蛋白酶和靡蛋白酶都有抑制。Bowman-Birk抑制劑（BBI)是該類抑制劑的一個(gè)實(shí)例。大 豆中存在的蛋白酶抑制劑的平均水平分別是大約1. 4%的KTI和0. 6%的BBI。值得注意的 是，如此低的水平使分離臨床應(yīng)用的天然蛋白酶抑制劑不切實(shí)際。
[0049] 因此，一方面，所述的蛋白酶抑制劑（TI)是指Kunitz-胰蛋白酶抑制劑（KTI)或 Bowman-Birk抑制劑（BBI)，優(yōu)選KTI。
[0050] 發(fā)明方法
[0051] 本發(fā)明方法從大豆蛋白的粗水性提取物或大豆蛋白溶液開始。通常所述的大豆蛋 白的水性提取物通過用水或稀酸或堿抽提大豆或大豆制品（例如，粉碎的大豆、大豆粗粉 或脫脂的大豆粉）獲得。提取優(yōu)選在1-60°C溫度下進(jìn)行0.1-20小時(shí)。水可以是接近中性 的pH(pH6. 5-7. 5)或可以是堿性，例如pH9. 0-pH12。在某些情況下，通過加入含水堿使 提取混合物的pH在提取過程中保持恒定在優(yōu)選的范圍內(nèi)。
[0052] 在某些情況下，大豆蛋白是通過進(jìn)一步加工從粗提取物獲得的大豆蛋白溶液，例 如沉淀、離心和過濾，所述的過濾包括膜過濾，例如超濾、納米過濾和微濾。在優(yōu)選的實(shí)施方 案中，所述的大豆蛋白溶液是從通過對接近中性或堿性的大豆蛋白提取物的酸化得到的蛋 白沉淀而制備的。
[0053] 優(yōu)選的大豆蛋白溶液是大豆奶。大豆奶可以由完整的大豆或全脂的大豆粉制備。 根據(jù)水的溫度，干燥的豆子在水中浸泡過夜或至少3個(gè)小時(shí)或以上。然后再水化的豆子在 足夠的水加入下進(jìn)行濕磨，得到所需固體含量的最終產(chǎn)品。水與豆子的重量比例應(yīng)該是大 約10:1。將所得到的漿或糊煮沸，加熱失活大豆胰蛋白酶抑制劑而提高其營養(yǎng)價(jià)值，改善其 味道并消毒所述的產(chǎn)品。在沸點(diǎn)或接近沸點(diǎn)的溫度下持續(xù)加熱一段時(shí)間，15-20分鐘，然后 通過過濾除去未溶的殘?jiān)ù蠖估w維或豆渣）。傳統(tǒng)的中國豆奶和日本豆奶加工過程存在 簡單但深奧的區(qū)別：中國方法是冷卻過濾后煮沸濾液（豆奶），而日本方法是先煮沸豆?jié){， 然后熱過濾所述豆?jié){。后一方法導(dǎo)致較高的豆奶產(chǎn)量，但是在煮沸步驟需要使用防泡沫劑 或天然除沫劑。將過濾后的豆奶煮沸避免了產(chǎn)生泡沫的問題。通常其顏色為不透明的、白 色或米色，與牛奶的稠度接近。特別優(yōu)選的是熱處理前的豆奶。
[0054]其它優(yōu)選的大豆蛋白溶液可通過洗滌、再溶解和/或酶處理大豆纖維（豆渣）廢 料獲得。制備豆腐產(chǎn)生的廢料也構(gòu)成了優(yōu)選的大豆蛋白溶液。
[0055] 為了符合分離方法中的pH，所述大豆蛋白水性提取物或溶液可在步驟（ii)前調(diào) 節(jié)pH，優(yōu)選調(diào)節(jié)pH在2. 0-9. 0之間。調(diào)節(jié)pH可能導(dǎo)致在水性提取物中的蛋白沉淀，因此可 以對pH調(diào)節(jié)后的大豆蛋白提取物傾析、離心或過濾，在步驟（ii)前去除不溶性物質(zhì)。
[0056] 大豆蛋白水性提取物或溶液至少包含兩種類型的大豆蛋白一第一種類型和第二 種類型。
[0057] 將大豆蛋白水性提取物或溶液通過至少一個(gè)分離過程，所述的分離過程包含將所 述大豆蛋白水性提取物與至少一種吸附樹脂接觸。
[0058] 所述的吸附樹脂選擇性吸附至少第一種類型的大豆蛋白，并有可能吸附其它大豆 蛋白質(zhì)。因此獲得了非結(jié)合的蛋白組分和結(jié)合的蛋白組分。
[0059] 所述的分離過程是固相吸附過程：膨脹床吸附（EBA)。
[0060] 膨脹床吸附（EBA)
[0061] 在近年來發(fā)展的各種工業(yè)性層析分離技術(shù)中，膨脹床（EBA)已經(jīng)被成功地引用到 生物技術(shù)工業(yè)的某些領(lǐng)域。EBA是一種液化床吸附，其中保持最低水平的回混。與其它層析 分離技術(shù)相比，EBA因其可以直接應(yīng)用非澄清原料而具有明顯的優(yōu)勢。
[0062] 在EBA過程中，當(dāng)液體流過時(shí)，吸附樹脂床可以在層析柱內(nèi)膨脹。床的膨脹通 常在每個(gè)末端具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的柱中進(jìn)行，該網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)遮蓋了柱子的橫截面，或在一些其 它有孔的裝置中進(jìn)行，其不會在流動中產(chǎn)生渦流。例如參見WO-A-9218237(Amersham PharmaciaBiotechAB，瑞典）。在使用攪拌的進(jìn)入流的體系中可以發(fā)現(xiàn)相同的效果， W0-A-9200799(UpFrontChromatographyA/S).
[0063] 在膨脹床狀態(tài)，吸附劑樹脂顆粒之間的間距可以導(dǎo)致原料流中微粒雜質(zhì)的自由通 過。相反地，傳統(tǒng)的填充床作用就像深度過濾器，其可能堵塞，引起反向壓力增加，除非原料 是完全澄清的。因?yàn)樵贓BA柱中沒有明顯的壓力產(chǎn)生，所以使用沒有大小限制的EBA是可 能的，而流速通常與填充床的柱子相關(guān)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，吸附過程 不涉及填充床。
[0064]EBA過程的特征可能在于柱內(nèi)非常有限的液體回混，與非常熟知的渦旋液化床相 反。床的回混通常以軸向擴(kuò)散（'容器擴(kuò)散數(shù)"）來測量，參見Levenspiel的"化學(xué)反應(yīng)工 程（ChemicalReactionEngineering) "，第二版，JohnWiley&Sons(1972) 〇
[0065] 以至少3cm/min，諸如至少5cm/min，例如至少8cm/min，諸如至少10cm/min，例 如20cm/min的線性流速通過將大豆蛋白的水性提取物應(yīng)用到吸附劑柱子上可有效地進(jìn)行 純化。典型地，選擇所述的流速在5-50cm/min的范圍內(nèi)，諸如5-15cm/min的范圍，例如 l〇-30cm/min范圍，諸如 25-50cm/min的范圍。
[0066] 大豆蛋白溶液/提取物的溫度優(yōu)選在1°C-90°C的范圍內(nèi)，諸如在5°C-18°C的范 圍內(nèi)，諸如在7°C-15°C的范圍內(nèi)，諸如在19°C-80°C的范圍內(nèi)，諸如在19°C-70°C的范圍 內(nèi)，諸如在25°C-65°C的范圍內(nèi)，諸如在45°C-60°C的范圍內(nèi)。
[0067] 當(dāng)將大豆蛋白水性提取物或