專利名稱：通過抑制冷誘導(dǎo)rna結(jié)合蛋白(cirp)治療炎性疾病的制作方法
通過抑制冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(CIRP)治療炎性疾病相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2009年4月13日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/212，584的優(yōu)先權(quán)。上述申請(qǐng)的全部教導(dǎo)在此引入作為參考。政府資助本發(fā)明在國立衛(wèi)生研究院(the National Institutes of Health)授予的第ROl HL 076179號(hào)項(xiàng)目款的政府支持下完成。政府擁有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
炎癥是血管組織對(duì)有害刺激(例如病原體、受損細(xì)胞或刺激物)的復(fù)雜生物響應(yīng)。 它是有機(jī)體為了去除有害刺激并啟動(dòng)組織康復(fù)過程的保護(hù)性努力。在不存在炎癥的情況下，創(chuàng)傷和感染至多只能夠更慢地愈合，而組織的進(jìn)行性破壞會(huì)損害有機(jī)體的存活。然而， 不加抑制的炎癥也能夠?qū)е略S多疾病。炎癥可分為急性或慢性。急性炎癥是身體對(duì)有害刺激的最初響應(yīng)，其通過來自血液的血漿和白細(xì)胞向受傷組織的移動(dòng)增加來發(fā)生。一系列生物化學(xué)事件促發(fā)了涉及局部血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和受傷組織中的多種細(xì)胞的炎性響應(yīng)并使其成熟。延長的炎癥，即慢性炎癥，會(huì)導(dǎo)致發(fā)生炎癥處的細(xì)胞類型進(jìn)行性變化，其特征為在炎性過程中組織的破壞和愈合同時(shí)發(fā)生。雖然近期對(duì)于急性炎癥患者的治療已有進(jìn)步(例如，膿毒癥、外傷出血以及內(nèi)臟缺血再灌注損傷)，但是仍有大量病人死于并發(fā)的循環(huán)性休克和多器官衰竭。休克和多器官衰竭持續(xù)作為醫(yī)療和外科重癥室中的死亡主因，具有難以接受的高致死率。雖然已經(jīng)對(duì)多種療法和藥物進(jìn)行了研究來預(yù)防循環(huán)性衰竭并降低死亡率，但還沒有一種是完全成功的。今天現(xiàn)代醫(yī)學(xué)開始承認(rèn)慢性炎癥是導(dǎo)致慢性變性疾病的主要因素。促炎性細(xì)胞因子是我們免疫系統(tǒng)的一部分，其可以攻擊并殺死具有氧化性化學(xué)物質(zhì)的細(xì)胞。如果不進(jìn)行治療，炎癥可能傷害組織和器官。例如，炎癥導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎患者軟骨退化并對(duì)糖尿病患者的胰臟造成傷害；且其現(xiàn)在被認(rèn)為在心血管疾病和癌癥中發(fā)揮作用。目前為止，對(duì)于治療人類的急性和慢性炎性癥狀只有非常有限的特定治療方法。 從而，對(duì)于具有最小副作用的有效治療炎性癥狀的新方法存在很大的未滿足的醫(yī)療需求。發(fā)明概述本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)對(duì)于冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(Cold-Inducible RNA-Binding Protein,CIRP)進(jìn)行抑制可以減弱炎性響應(yīng)。更具體的，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)對(duì)CIRP的抑制與不進(jìn)行治療的對(duì)照相比能降低出血性休克動(dòng)物模型中的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肝髓過氧物酶 (MPO)、乳酸鹽、TNF、血清TNF和血清、肺和肝IL-6的水平(圖7-8)。另外，對(duì)CIRP的抑制降低了出血導(dǎo)致的死亡率(圖6)。基于該發(fā)現(xiàn)，公開了治療炎性癥狀的藥物組合物和方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明為藥物組合物，其包含藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑和CIRP抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明為治療患有炎性癥狀的受試者的方法，該方法包括對(duì)受試者施用有效量的CIRP抑制劑。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明為分離的抗體，其特異性結(jié)合CIRP(" CIRP抗體") 或其抗原性片段，其中所述抗體或抗原性片段抑制CIRP的一種或多種生物活性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明為抑制CIRP活性的方法，該方法包括對(duì)有需求的受試者施用有效量的CIRP抑制劑。附圖簡述

圖1是人的CIRP氨基酸序列(SEQ ID NO 1)。圖2顯示了 CIRP基因在出血?jiǎng)游锬Ｐ椭械母?、心臟和血液中的過表達(dá)與假手術(shù) (sham)(不出血)對(duì)照進(jìn)行對(duì)比。圖3是描述施用重組CIRP(rCIRP)后AST和ALT提高的兩幅圖。圖4顯示了施用rCIRP后血液、肝和腸中TNF和HMGBl的增加。圖5顯示了 rCIRP促進(jìn)和增加釋放自巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞因子(TNF、IL_6、 HMGB1)的時(shí)間進(jìn)程和效果。圖6描述了在出血?jiǎng)游锬Ｐ椭屑尤肟?CIRP抗體后與未治療的對(duì)照對(duì)比存活率增加。圖7是一系列描述在出血?jiǎng)游锬Ｐ椭惺┯每?CIRP抗體組合物后與未治療的對(duì)照對(duì)比血清AST、ALT和乳酸鹽降低的圖。圖8包括了描述在出血?jiǎng)游锬Ｐ椭惺┯每?CIRP抗體后與未治療的對(duì)照進(jìn)行對(duì)比抗-CIRP抗體降低血清、肺和肝IL-6的圖。發(fā)明詳述申請(qǐng)人:驚訝地發(fā)現(xiàn)在炎性響應(yīng)期間，CIRP表達(dá)被上調(diào)，并被釋放至循環(huán)系統(tǒng)。申請(qǐng)人還發(fā)現(xiàn)一旦CIRP進(jìn)入血液，其就會(huì)作為強(qiáng)效的促炎性介導(dǎo)物或細(xì)胞因子并導(dǎo)致組織損傷甚至死亡。本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，S卩，與未治療的對(duì)照相比，對(duì)CIRP的抑制會(huì)導(dǎo)致在膿毒癥動(dòng)物模型中的炎性介導(dǎo)物和標(biāo)志物的水平降低，該炎性介導(dǎo)物和標(biāo)志物包括但不限于天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肝髓過氧物酶(MPO)、乳酸鹽、TNF、血清TNF和血清IL-6、肺IL-6和肝 IL-6。這些降低反映并在某些情況下解釋了在炎性疾病和病癥的治療中靶向CIRP的有益效果。此外，這些降低顯示了 CIRP抑制劑和拮抗劑在治療這些疾病和病癥中的治療益處。CIRP是一種因溫和冷應(yīng)激(32°C )在培養(yǎng)的細(xì)胞中誘導(dǎo)出的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)，優(yōu)選為人蛋白質(zhì)。CIRP包括一個(gè)N末端RNA結(jié)合域和一個(gè)C末端甘氨酸富集域。人CIRP氨基酸序列見圖 1,SEQ ID NO :1(參見Nishiyama等人，The Journal of Cell Biology,Volume 137，1997)。“哺乳動(dòng)物CIRP”包括具有與天然存在或內(nèi)源性的相應(yīng)哺乳動(dòng)物CIRP相同的氨基酸序列的蛋白(如重組蛋白、合成蛋白(即用合成有機(jī)化學(xué)產(chǎn)生的蛋白))。該術(shù)語還涵蓋了 CIRP的多態(tài)性變異體或等位變異體和其他同種型(如選擇性剪接或其他細(xì)胞學(xué)方法所產(chǎn)生的)以及前述的修飾或未修飾形式(如脂化、糖基化和非糖基化)。這類蛋白可從例如天然產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物CIRP的來源進(jìn)行回收和分離。CIRP在冷誘導(dǎo)細(xì)胞增殖抑制方面發(fā)揮不可或缺的作用。在此定義的“CIRP抑制劑”是一種結(jié)合CIRP并抑制(例如，減少、阻止、降低、中和)CIRP —種或多種生物活性的試劑(例如，分子、天然或合成核酸或核酸類似物、反義分子、小干擾RNA(siRNA)、蛋白質(zhì)、肽、抗體、抗原性片段、化合物等等)；或一種抑制CIRP基因
5和/或蛋白質(zhì)表達(dá)或CIRP生物活性釋放的試劑。術(shù)語“CIRP的生物活性”表示CIRP受體結(jié)合、CIRP信號(hào)傳導(dǎo)、CIRP介導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子的釋放、CIRP介導(dǎo)的炎癥和/或CIRP介導(dǎo)的其它活性。術(shù)語"拮抗劑"可以與術(shù)語"抑制劑"可互換使用。CIRP抑制劑可以是抗體，其結(jié)合并抑制(例如，減少、阻止或中和)CIRP的一種或多種生物活性或功能?？贵w可為多克隆或單克隆的，術(shù)語“抗體”意在涵蓋多克隆和單克隆抗體。術(shù)語多克隆和單克隆指抗體制劑的同質(zhì)程度，不限于特定的生產(chǎn)方法。本文中用到的術(shù)語“抗體” 也涵蓋抗體的功能性片段，包括嵌合抗體、人源化抗體、靈長類化(primatized)抗體、雜合 (veneered)抗體或單鏈抗體的片段。功能性片段包括與哺乳動(dòng)物CIRP結(jié)合的抗原結(jié)合片段。這樣的片段可通過酶裂解或通過重組技術(shù)產(chǎn)生。例如，木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或其他具有所需底物特異性的蛋白酶也可用來產(chǎn)生片段。也可用其中在天然終止位點(diǎn)上游已引入一個(gè)或多個(gè)終止密碼子的抗體基因生產(chǎn)為多種截短形式的抗體。包括源自不同物種的片段的單鏈抗體、和嵌合、人源化或靈長類化(CDR-移植) 或雜合抗體以及嵌合、CDR-移植或雜合單鏈抗體等也涵蓋在本發(fā)明和術(shù)語“抗體”的范圍內(nèi)。這些抗體的各種片段可通過常規(guī)技術(shù)化學(xué)結(jié)合于一起，或可采用基因工程技術(shù)制備作為相鄰的蛋白。例如，編碼嵌合或人源化鏈的核酸可被表達(dá)來產(chǎn)生相鄰的蛋白。參見例如Cabilly等人的美國專利4，816，567 ；Cabi Ily等人的歐洲專利0，125，023B1 ； Boss等人的美國專利4，816，397 ；Boss等人的歐洲專利0，120，694B1 ；Neuberger, M. S等人的 WO 86/01533 ；Neuberger, M. S.等人的歐洲專利 0，194，276B1 ；Winter 的美國專利 5，225，539 ；Winter 的歐洲專利 0，239，400B1 ；Queen 等人的歐洲專利 0 451 216 Bl ；和 Padlan, Ε. A.等人的EP 0 519 596 Al。也參見關(guān)于靈長類化抗體的文獻(xiàn)Newman，R.等人的BioTechnology，10 1455-1460 (1992)，以及關(guān)于單鏈抗體的文獻(xiàn)Ladner等人的美國專利 4，946，778 和 Bird, R. Ε.等的 Science, 242 :423_426 (1988))。人源化抗體可用合成或重組DNA技術(shù)使用標(biāo)準(zhǔn)方法或其他適宜技術(shù)生產(chǎn)。也可用PCR誘變方法構(gòu)建編碼人源化可變區(qū)的核酸(如cDNA)序列以改變編碼人或人源化鏈的 DNA序列，如來自先前人源化可變區(qū)的DNA模板(參見例如Kamman，Μ.等人，Nucl. Acids Res. , 17 5404(1989) ；Santo, K.等人，Cancer Research, 53 :851_856 (1993) ；Daugherty, B. L.等人，Nucleic Acids Res. , 19(9) :2471_2476 (1991)和 Lewis，A. P. ^P J. S. Crowe, Gene,101 =297-302 (1991)) 0使用這些或其他適宜方法，也可容易地產(chǎn)生變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以對(duì)克隆的可變區(qū)進(jìn)行突變，并可篩選具有所需特異性的編碼變體的序列(例如從噬菌體庫；參見例如Krebber等人的美國專利5，514，548;1993年4月1日公開的 Hoogenboom 等的 WO 93/06213)。對(duì)哺乳動(dòng)物(如人)CIRP具有特異性的抗體可用適宜的免疫原得到，例如SEQ ID NO 1的分離的和/或重組的人蛋白或其片段(包括合成分子如合成肽)?？贵w也可通過免疫具有表達(dá)CIRP的細(xì)胞的適宜宿主(如小鼠)得到。此外，表達(dá)CIRP的細(xì)胞可用作免疫原或用于篩選結(jié)合CIRP的抗體。免疫抗原的制備及多克隆和單克隆抗體的生產(chǎn)可用任何適宜技術(shù)進(jìn)行。文獻(xiàn)中已描述了多種方法(參見例如Kohler等人，Nature, 256 495-497 (1975)和Eur. J.Immunol. 6 :511_519(1976) ；Milstein 等人，Nature 266 :550_552(1977) ；KoprowskiD. Lane, 1988，Antibodies :A Laboratory Manual (抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè))，(Cold Spring Harbor Laboratory :Cold Spring Harbor, N. Y. ) ；Current Protocols In Molecular Biology (分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè))，第 2 卷(增刊 27，1994 年夏)，Ausubel, F. M.等人編輯，(John ffiley&Sons :New York, N. Y.)，第 11 章，(1991))。一般來說，通過將適宜的無限增殖細(xì)胞系(例如骨髓瘤細(xì)胞系如SP2/0、 P3X63Ag8. 653或雜合骨髓瘤)與產(chǎn)生抗體的細(xì)胞進(jìn)行融合來產(chǎn)生雜交瘤。產(chǎn)生抗體的細(xì)胞可從用目的抗原免疫的人或其他適宜動(dòng)物的周圍血或優(yōu)選脾或淋巴結(jié)獲得。融合細(xì)胞(雜交瘤)可用篩選性培養(yǎng)條件分離，并采用有限稀釋法克隆。產(chǎn)生具有所需特異性的抗體的細(xì)胞可通過適宜的檢測法(如ELISA)篩選?？梢允褂卯a(chǎn)生或分離具有所需特異性的抗體(如人抗體或抗原結(jié)合片段)的其他適宜方法，包括例如從文庫(如噬菌體展示文庫)中篩選重組抗體的方法，或基于對(duì)能產(chǎn)生人抗體譜的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)進(jìn)行免疫的方法(參見例如Jakobovits等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 2551-2555 (1993) Jakobovits 等人，Nature, 362 255-258 (1993) ；Lonberg 等的美國專利 5，545，806 ； Surani 等的美國專利 5，545，807 ； Lonberg等的W097/13852)。這些免疫和分離方法是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員公知的?？乖云问且环N當(dāng)進(jìn)入體內(nèi)時(shí)會(huì)刺激產(chǎn)生抗體的物質(zhì)。抗原可以包括毒素、細(xì)菌、外源血細(xì)胞和/或移植器官的細(xì)胞。CIRP抑制劑可以是特異性結(jié)合和抑制(減少、阻止、降低、中和)CIRP的活性的肽 (例如，合成、重組、融合或衍生的肽)。肽可以是線性、分支或環(huán)化的，例如，包含一些酰胺鍵的含有雜環(huán)原子結(jié)構(gòu)的肽。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述肽是環(huán)肽。肽表示含有約2 至約100氨基酸殘基的化合物，其中一個(gè)氨基酸的氨基通過肽鍵連接到另一個(gè)氨基酸的羧基。這些肽的長度一般少于約100個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選約10、約20、約30、約40或約50個(gè)殘基?？梢援a(chǎn)生選擇性結(jié)合CIRP特定結(jié)構(gòu)域(例如，獨(dú)特域)的肽。例如，可以通過酶促或化學(xué)裂解從天然蛋白質(zhì)中衍生或分離肽，或可以通過合適的方法合成肽，該方法例如，固相肽合成(例如，Merrifield型合成)(參見，例如，Bodanszky等人?！甈印tide Synthesis" ,John Wiley & Sons, Second Edition，1976)。作為 CIRP 抑制劑的肽還可以通過使用例如重組DNA方法或其它合適方法產(chǎn)生(參見，例如，Sambrook J.和Russell D. W.， Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 3rd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,2001)。CIRP抑制劑還可以是融合到例如載體蛋白(例如，myC, his、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶)上的和/或被標(biāo)記(例如，放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記)的融合肽。肽可以含有任何合適的L-和/或D-氨基酸，例如，常規(guī)α氨基酸(例如丙氨酸、 甘氨酸、纈氨酸)、非α氨基酸(例如，β-丙氨酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、肌氨酸、抑胃酶氨酸(statine))、以及非常規(guī)氨基酸(例如，瓜氨酸、高瓜氨酸、高絲氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、鳥氨酸)。肽的氨基、羧基和/或其它官能團(tuán)可以是游離的(例如，未修飾的)或使用合適的保護(hù)基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)。合適的氨基和羧基的保護(hù)基團(tuán)、以及添加或移除保護(hù)基團(tuán)的方法是本領(lǐng)域公知的，并公開于，例如，Green和Wuts，‘‘ Protecting Groups in Organic Synthesis" ,John Wiley & Sons，1991。肽的官能團(tuán)也可以通過公知的方法進(jìn)行衍生(例如，烷基化)?？梢詫?duì)肽進(jìn)行合成并組裝至包含有一些到很多離散分子種屬的文庫中。這些文庫可以使用組合化學(xué)方法進(jìn)行制備，并使用任何合適的方法進(jìn)行篩選以判斷該文庫是否包含具有目標(biāo)生物活性的肽。然后可以將這些肽抑制劑通過合適的方法進(jìn)行分離。如果需要的話，多肽可以包括修飾(例如，氨基酸接頭、酰化、乙?；Ⅴ０坊?、甲基化、末端修飾(例如，環(huán)化修飾))。多肽還可以包括化學(xué)修飾(例如，N-甲基-α-氨基取代)。另外，肽抑制劑可以是已知肽和/或天然產(chǎn)生肽的類似物，例如，具有保守氨基酸殘基取代的肽類似物。這些修飾可以改進(jìn)肽的不同性質(zhì)(例如，溶解性、結(jié)合)，包括其CIRP 抑制活性。擬肽是指并非多肽、但是模擬其結(jié)構(gòu)方面的分子。擬肽拮抗劑可通過常規(guī)化學(xué)方法制備(參見例如，Damewood J. R, “ Peptide Mimetic Design with the Aid of Computational Chemistry" ,Reviews in Computational Biology,20o7,Vol. 9,pp. 1-80, John Wiley & Sons, Inc. , New York,1996 ；Kazmierski W. K. , " Methods of Molecular Medicine :Peptidomimetic Protocols, " Humana Press,New Jersey, 1999)。例如，可以制備具有相同官能團(tuán)的多糖作為肽?？梢酝ㄟ^例如確立肽試劑在其被結(jié)合或?qū)⒈唤Y(jié)合至目標(biāo)分子的環(huán)境下的三維結(jié)構(gòu)來設(shè)計(jì)擬肽。擬肽包括至少兩個(gè)部分結(jié)合部分和骨架或支撐結(jié)構(gòu)。結(jié)合部分是能與例如在配體結(jié)合位點(diǎn)處或附近具有氨基酸的目標(biāo)分子反應(yīng)或形成復(fù)合物(例如，通過疏水或離子相互作用)的化學(xué)原子或基團(tuán)。例如，擬肽的結(jié)合部分可以與肽或蛋白抑制劑的結(jié)合部分相同。結(jié)合部分可以是通過與肽抑制劑的結(jié)合部分相同或相似的方式與受體反應(yīng)的原子或化學(xué)基團(tuán)。例如，可以使用計(jì)算化學(xué)來設(shè)計(jì)與CIRP結(jié)合的擬肽來抑制CIRP的活性。適合用于肽的堿性氨基酸的擬肽設(shè)計(jì)的結(jié)合部分的例子包括含氮的基團(tuán)，例如胺、銨、胍、和酰胺或磷鐺。適合用于肽的酸性氨基酸的擬肽設(shè)計(jì)的結(jié)合部分的例子包括例如羧基、低烷基羧酸酯、磺酸、低烷基磺酸酯或磷酸或其酯。支撐結(jié)構(gòu)是當(dāng)結(jié)合至結(jié)合部分的時(shí)候能夠提供擬肽的三維構(gòu)型的化學(xué)實(shí)體。支撐結(jié)構(gòu)可以是有機(jī)或無機(jī)的。有機(jī)支撐結(jié)構(gòu)的例子包括多糖、聚合物或有機(jī)合成聚合物低聚物(如聚乙烯醇或聚交酯)。優(yōu)選的，支撐結(jié)構(gòu)基本上具有與肽骨架或肽支撐結(jié)構(gòu)相同的大小和規(guī)格。這可以通過計(jì)算或測量肽和擬肽的原子和鍵的尺寸來進(jìn)行確定。在一個(gè)實(shí)施方式中，肽鍵的氮可以用氧或硫來取代，例如，形成聚酯骨架。在另一個(gè)實(shí)施方式中，羰基可以用磺?；騺喕酋；〈瑥亩纬删埘０?例如，聚磺酰胺)。可以制備肽的反式酰胺 (例如，將一個(gè)或多個(gè)-CONH基團(tuán)取代為-NHCO基團(tuán))。在另一個(gè)實(shí)施方式中，肽骨架可以被聚硅烷骨架取代。這些化合物可通過已知方法生產(chǎn)。例如，聚酯擬肽可通過將氨基酸上對(duì)應(yīng)的α氨基取代為羥基，從而制備羥基酸并進(jìn)而酯化羥基酸，可選地封閉堿基和酸基側(cè)鏈以使得副反應(yīng)最小化。一般可以通過確定化學(xué)結(jié)構(gòu)來容易地確定合適的化學(xué)合成路徑?？梢詫?duì)擬肽進(jìn)行合成并組裝至包含有一些到很多離散分子種屬的文庫中。這些文庫可以使用已知組合化學(xué)方法進(jìn)行制備，并進(jìn)行篩選以判斷該文庫是否包含一種或多種具有目標(biāo)活性的擬肽。然后可以將這些擬肽抑制劑通過合適的方法進(jìn)行分離。其它CIRP抑制劑，例如，非肽化合物或小分子，可以在自然界中發(fā)現(xiàn)(例如，鑒定、分離、純化)和/或生產(chǎn)(例如，合成)。可以對(duì)化合物和/或文庫(例如，化合物、肽、核酸文庫)進(jìn)行篩選，例如高通量篩選，以檢測試劑的CIRP結(jié)合特異性?？梢詮臒o數(shù)可獲得的化合物文庫中鑒定化合物或小分子，該文庫例如，來自于Chemical Repository of the National Cancer Institute、Molecular Libraries Small Molecules Repository(PubChem)和其它商業(yè)可獲得的文庫。這些文庫或分子集合也可以使用公知的化學(xué)方法進(jìn)行制備，例如公知的組合化學(xué)方法?？梢院Y選文庫以鑒定結(jié)合和抑制CIRP的化合物。鑒定的化合物可以作為前導(dǎo)化合物通過公知的藥物化學(xué)方法來進(jìn)一步多樣化。例如，可以制備前導(dǎo)化合物結(jié)構(gòu)變體的化合物集合并用于篩選CIRP結(jié)合和/或抑制活性。這可能導(dǎo)致結(jié)構(gòu)活性關(guān)系的發(fā)展，其將化合物結(jié)構(gòu)與生物活性相聯(lián)系。具有合適的結(jié)合和抑制活性的化合物可以進(jìn)一步研發(fā)用于體內(nèi)。在一個(gè)例子中，小分子NaN3抑制CIRP轉(zhuǎn)錄， 參見〃 Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by HIF-l-independent mechanism" , S. Wellmann 等人，Journal of Cell Science, 117, 1785-1794,2004。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，CIRP抑制劑具有低于1000道爾頓的分子量。CIRP抑制劑也可以是抑制(減少、降低、中和、阻止)CIRP表達(dá)的試劑。抑制CIRP 基因表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)錄、mRNA加工、翻譯)的試劑(分子、化合物、核酸、寡核苷酸)是有效的 CIRP抑制劑。反義寡核苷酸(例如，DNA，核糖核酸探針(riboprobes))也可以用作CIRP抑制劑來抑制CIRP亞基表達(dá)。反義寡核苷酸一般是短(13至25核苷酸)的單鏈核酸，其特異性與目標(biāo)核酸序列(例如，mRNA)雜交并誘導(dǎo)目標(biāo)核酸的降解(例如，通過RNase H依賴機(jī)理進(jìn)行的RNA的降解)或空間上阻礙剪接或翻譯機(jī)構(gòu)的進(jìn)行(參見例如，DiasN.和Stein C.A.，Mol Can. Ther. 1 :347 355，2002)。有很多不同類型的反義寡核苷酸可用作CIRP抑制劑，包括甲基膦酸酯寡核苷酸、硫代磷酸酯寡核苷酸、在核糖2'位處的氫被0-烷基(例如甲基)取代的寡核苷酸、聚酰胺核酸(PNA)、磷二酰胺嗎啉低聚物(脫氧核糖部分被嗎啉環(huán)取代)、PN(在核糖3'位處的氧被氨基進(jìn)行N31—〉P5'置換)和嵌合寡核苷酸(例如， 2' -0-甲基/硫代磷酸酯)?？梢允褂妙A(yù)測性算法將反義寡核苷酸設(shè)計(jì)為CIRP特異性的。(參見例如，Ding, Y.禾口 Lawrence，C. Ε. ，Nucleic Acids Res. ,29 1034—1046，2001 ；Sczakiel，G. ，F(xiàn)ront. Biosci. ,5 :D 194-D201,2000 ；Scherr, Μ.等人，Nucleic Acids Res.，28 :2455_2461，
2000；Patzel, V.等人，Nucleic Acids Res. , 27 4328-4334,1999 ；Chiang, Μ. Y.等人， J. Biol Chem. ,266 18162-18171,1991 ；Stuil, R. Α.等人，Nucleic Acids Res. ,20 3501-3508，1992 ；Ding, Y.禾口 Lawrence，C. Ε.，Comput. Chem. ,25. -387—400，1999 ；Lloyd, B. H.等人，Nucleic Acids Res. ,29 :3664_3673，2001 ；Mir, K. U.和 Southern, Ε. Μ.，Nat Biotechnol，17 :788-792，1999 ;Sohail，Μ.等人，Nucleic Acids Res. ,29. :2041_2051，
2001；Altman, R. K.等人，J. Comh. Chem.，7 :493_508，1999)。反義寡核苷酸可以通過合適的方法產(chǎn)生；例如，使用自動(dòng)核酸合成儀(來自，例如，Applied Biosystems)合成核酸(例如，DNA，RNA，PNA)(還參見 Martin，P.，Helv. Chim. Ada 78 :486_504，1995)。反義寡核苷酸也可以在含有合適表達(dá)載體的細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。反義寡核苷酸可以通過吸附性內(nèi)吞作用被目標(biāo)細(xì)胞吸收。從而，在對(duì)受試者(例如，哺乳動(dòng)物)進(jìn)行治療中，反義CIRP可以通過例如注射或輸液被遞送至目標(biāo)細(xì)胞。例如，純化的寡核苷酸或siRNA/shRNA，可單獨(dú)給藥或在具有合適的給藥載體(例如，脂質(zhì)體、陽離子聚合物(例如，聚-L-賴氨酸’ PAMAM樹枝狀聚合物(dendrimer)，聚氰基丙烯酸烷基酯納米顆粒和聚乙烯亞胺))的制劑中進(jìn)行給藥，或偶聯(lián)至合適的載體肽(例如，同源轉(zhuǎn)錄因子、觸角足(antennapedia)肽、HIV-1 的 Tat 蛋白、E5CA 肽)。鑒定CIRP拮抗劑(例如，抗體)的方法將在下文描述。包含CIRP的組合物可被用于結(jié)合分析以檢測和/或鑒定能夠結(jié)合CIRP的試劑， 包括本發(fā)明的抗體。適于結(jié)合分析的組合物包括，例如，天然表達(dá)哺乳動(dòng)物CIRP或其功能性變體的細(xì)胞以及表達(dá)哺乳動(dòng)物CIRP或其功能性變體的重組細(xì)胞。適于結(jié)合分析的組合物還包括，包含哺乳動(dòng)物CIRP或其功能性變體的膜制劑。這些膜制劑可包含天然的(例如，質(zhì)膜)或合成的膜。優(yōu)選的，膜制劑是含有哺乳動(dòng)物CIRP或其功能性變體的細(xì)胞的膜部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，檢測和/或鑒定能夠結(jié)合哺乳動(dòng)物CIRP的試劑(例如抗體) 的方法是競爭性結(jié)合分析，其中評(píng)價(jià)待測試劑(例如，抗體)抑制參比試劑(例如，配體或另一種已知特異性的抗體)的結(jié)合的能力。例如，可以使用如下所述的合適的標(biāo)記物對(duì)參比試劑進(jìn)行標(biāo)記，從而可以確定要飽和測試中存在的CIRP所需要的帶標(biāo)記的參比試劑的量?？梢詫柡土康膸?biāo)記的參比試劑和不同量的待測試劑與包含哺乳動(dòng)物CIRP或其功能性變體的組合物在適宜結(jié)合和復(fù)合物形成被確定的條件下進(jìn)行接觸?？梢允褂煤线m的對(duì)照(例如，未標(biāo)記的試劑、單獨(dú)的標(biāo)記物)來確定CIRP和待測試劑之間形成復(fù)合物的特異性。參比或待測試劑與CIRP或其片段(包括如上所述免疫原性肽)間復(fù)合物的形成可直接或間接地用適宜的方法檢測或測定。例如，可將試劑用適宜的標(biāo)記物標(biāo)記，從而復(fù)合物的形成可通過標(biāo)記物的檢測測定。復(fù)合物的特異性可采用適宜的對(duì)照(如未標(biāo)記的試劑或單獨(dú)的標(biāo)記物)來測定。適用于試劑與哺乳動(dòng)物CIRP或其功能性變體間形成的復(fù)合物的檢測中的標(biāo)記物包括例如放射性同位素、表位、親和標(biāo)記物(如生物素、抗生物素蛋白)、 自旋標(biāo)記物、酶、熒光基團(tuán)或化學(xué)發(fā)光基團(tuán)。就用來測定待測試劑如抗體與CIRP結(jié)合的能力的競爭性結(jié)合測定法而論，這種能力可以50%抑制(IC50值)標(biāo)記參比試劑的特異性結(jié)合所需的待測試劑濃度給出。特異性結(jié)合優(yōu)選定義為總結(jié)合(如復(fù)合物中的總標(biāo)記物)減去非特異性結(jié)合。非特異性結(jié)合優(yōu)選定義為在過量未標(biāo)記參比試劑的存在下形成的復(fù)合物中仍檢測到的標(biāo)記物的量。適用于該方法中的參比試劑包括特異性地與哺乳動(dòng)物CIRP或其功能性變體結(jié)合的分子和化合物，例如CIRP的配體或抗體。優(yōu)選的參比試劑為已知對(duì)人CIRP (SEQ ID NO=D片段具有特異性的抗體。CIRP結(jié)合試劑可被進(jìn)一步研究評(píng)價(jià)其抑制(例如，降低、阻止、中和)一種或多種 "CIRP的生物活性”的能力。如前定義的術(shù)語“CIRP的生物活性”是指CIRP受體結(jié)合、CIRP 信號(hào)傳導(dǎo)、CIRP介導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子的釋放、CIRP介導(dǎo)的炎癥和/或CIRP介導(dǎo)的其它活性。從而，檢測這些CIRP介導(dǎo)的功能的分析可用于評(píng)價(jià)待測試劑的活性抑制(例如，待測試劑抑制CIRP的一種或多種功能的能力)。對(duì)一種試劑(例如，抗體)抑制CIRP生物活性的評(píng)價(jià)可以通過，例如，檢測抗體是否抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子的釋放來確定。合適的細(xì)胞因子的例子包括TNF、IL-6
對(duì)于這些方法，細(xì)胞可以是能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子的任何細(xì)胞。該細(xì)胞是免疫細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、或中性粒細(xì)胞。對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制進(jìn)行評(píng)價(jià)可以采用任何已知的方法，包括細(xì)胞因子定量 (例如，通過ELISA)、或生物分析(例如，確定促炎性細(xì)胞因子活性是否被降低)、或檢測促炎性細(xì)胞因子mRNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用這些分析手段的任何一種而不必進(jìn)行過度的實(shí)驗(yàn)。關(guān)于CIRP抑制試劑抑制促炎性細(xì)胞因子釋放的非限制性的實(shí)施例參見圖4和8。 圖8A顯示了在出血?jiǎng)游锬Ｐ椭杏每?CIRP抗體處理的血清TNF的減少與未治療的對(duì)照進(jìn)行對(duì)比。圖8B-C顯示了在出血?jiǎng)游锬Ｐ椭杏每?CIRP抗體處理的組織TNF的減少與未治療的對(duì)照進(jìn)行對(duì)比。圖8D-F顯示了在出血?jiǎng)游锬Ｐ椭杏每?CIRP抗體處理的IL-6 (例如， 血清、肺和肝IL-6)的減少與未治療的對(duì)照進(jìn)行對(duì)比。另一種檢測促炎性細(xì)胞因子釋放的方法包括用抗體與刺激促炎細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)的試劑一道處理哺乳動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選的試劑為細(xì)菌脂多糖(LPS)。所述化合物可在所述試劑之前、與所述試劑同時(shí)或在所述試劑之后給予哺乳動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選所述化合物在所述試劑之前給予。參見例如美國專利6，610，713，其相關(guān)公開在此引入作為參考?？梢杂糜谠u(píng)價(jià)CIRP抑制的CIRP的其它可檢測的生物活性包括動(dòng)物模型中的AST 水平、動(dòng)物模型中的肝MPO水平和動(dòng)物模型中的乳酸鹽水平。這些標(biāo)志物的水平通常在炎性響應(yīng)期間上升。相對(duì)于未處理的對(duì)照而言，CIRP生物活性的抑制劑可以降低在炎性響應(yīng)動(dòng)物模型中的一種或多種這些標(biāo)志物的水平。實(shí)施例部分的圖7A-C給出了評(píng)價(jià)CIRP抑制劑抑制這些標(biāo)志物釋放的方法。圖7A顯示了在出血?jiǎng)游锬Ｐ椭锌?CIRP抗體對(duì)于AST水平的抑制效果與未治療的對(duì)照進(jìn)行對(duì)比。圖8G顯示了在出血?jiǎng)游锬Ｐ椭杏每?CIRP抗體處理的肝MPO水平的降低與未治療的對(duì)照進(jìn)行對(duì)比。圖7B-C給出了抗-CIRP抗體導(dǎo)致的血清ALT和乳酸鹽的減少。這些方法可在體內(nèi)進(jìn)行，其中，動(dòng)物如大鼠用所述化合物與刺激促炎細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)的試劑一道處理，并通過例如測定血清TNF水平來測定所述試劑對(duì)促炎細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)的誘導(dǎo)的影響。但由于用細(xì)胞培養(yǎng)物相較用全動(dòng)物進(jìn)行這些類型的檢測的相對(duì)容易性，所述方法優(yōu)選在體外進(jìn)行，例如用巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物。治療方法如在此使用的，“炎性疾病或病癥”表示導(dǎo)致個(gè)體炎癥增加的疾病或病癥。炎性疾病或病癥也表示感染性疾病或病癥，其導(dǎo)致個(gè)體炎癥增加。所述炎性疾病或病癥可以是“慢性炎性疾病或病癥”。慢性炎性疾病或病癥是在幾周、幾個(gè)月或更久的時(shí)間內(nèi)無法解決的炎性癥狀。慢性炎性癥狀可以繼發(fā)于急性炎性癥狀，或?qū)τ谝恍┘膊』虿“Y而言可以在不存在急性炎性疾病或病癥的情況下發(fā)生?？蛇x地，炎性癥狀可以是急性炎癥發(fā)作的結(jié)果。在此使用的“急性炎癥發(fā)作”是指增加的免疫響應(yīng)。急性炎癥的癥狀包括發(fā)紅、發(fā)熱、腫脹、疼痛、以及功能損失，例如關(guān)節(jié)移動(dòng)的損失。例如，慢性炎性疾病或病癥的急性炎癥發(fā)作在以下方面不同于典型的慢性炎性疾病或病癥的癥狀。通常，在急性炎性響應(yīng)期間，肝合成急性期蛋白質(zhì)或急性期反應(yīng)物，其可在血液中檢測到。急性期反應(yīng)物包括C-反應(yīng)蛋白(CRP)； α 1-抗胰蛋白酶；α 1-抗凝乳蛋白酶；α 2_巨球蛋白；凝血因子例如纖維蛋白原、纖維蛋白、凝血素、凝血酶、因子VIII和纖溶酶原；補(bǔ)充蛋白，以及血清淀粉體蛋白。另外，在急性炎癥發(fā)作期間，局部炎性細(xì)胞例如中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向血液中分泌若干細(xì)胞因子，最主要的有IL-1、IL-6、IL-11、HMGB1和TNF-α ( “細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)”)?？梢允┯肅IRP抑制劑以抑制、降低或另外減輕一些或全部的這些炎性癥狀的試劑和標(biāo)志物?？梢酝ㄟ^本發(fā)明有效治療的炎性癥狀的非限制性的例子選自闌尾炎、消化性潰瘍、胃潰瘍和十二指腸潰瘍、腹膜炎、胰腺炎、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、腸梗阻、會(huì)厭炎、弛緩不能、膽管炎、膽囊炎、肝炎、惠普耳氏病(Whipple' s疾病)、哮喘、變態(tài)反應(yīng)、過敏性休克、免疫復(fù)合疾病、器官缺血-再灌注損傷、器官壞死、花粉熱、膿毒癥、敗血病-感染性休克、敗血病、內(nèi)毒素性休克、惡病質(zhì)、高熱、嗜曙紅細(xì)胞肉芽腫、肉芽腫病、結(jié)節(jié)病、膿毒性流產(chǎn)、附睪炎、陰道炎、前列腺炎、尿道炎、支氣管炎、氣腫、鼻炎、肺炎、矽肺病 (pneumoultramicroscopic silicovolcanoconiosis)、月市泡炎(alvealitis)、細(xì)支氣管炎、 咽炎、胸膜炎、竇炎、流行性感冒、呼吸道合胞體病毒感染、皰疹感染、HIV感染、乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、彌漫性菌血癥、登革熱、念珠茵病、瘧疾、絲蟲病、阿米巴病、包蟲囊腫(hydatid cysts)、血管炎(vasulitis)、脈管炎、心內(nèi)膜炎、動(dòng)脈炎、動(dòng)脈硬化癥、血栓性靜脈炎、心包炎、心肌炎、局部缺血、結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周圍炎、風(fēng)濕熱、乳糜泄、成人呼吸窘迫綜合征、慢性阻塞性肺病、腦膜炎、腦炎、神經(jīng)炎、神經(jīng)痛、脊髓損傷、癱瘓、葡萄膜炎、關(guān)節(jié)炎疹、關(guān)節(jié)痛、骨髓炎、筋膜炎、佩吉特氏病、痛風(fēng)、牙周病、關(guān)節(jié)炎、滑膜炎、重癥肌無力、甲狀腺炎(thryoiditis)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、同種異體移植物排異反應(yīng)、移植物抗宿主疾病、古德帕斯徹氏綜合征、白塞氏綜合征、強(qiáng)直性脊柱炎、貝格爾氏病、Retier氏綜合征、何杰金氏病、牛皮癬、心肌梗塞、中風(fēng)、炎性腸病、壞死性腸炎和外傷出血。在另一個(gè)實(shí)施方式中，炎性癥狀選自闌尾炎、消化性潰瘍、胃潰瘍或十二指腸潰瘍、腹膜炎、胰腺炎、肝炎、哮喘、變態(tài)反應(yīng)、過敏性休克、器官壞死、花粉熱、膿毒癥、敗血病-感染性休克、敗血病、內(nèi)毒素性休克、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、腸梗阻、惡病質(zhì)、膿毒性流產(chǎn)、彌漫性菌血癥、乳糜泄、成人呼吸窘迫綜合征、慢性阻塞性肺病、關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、同種異體移植物排異反應(yīng)、移植物抗宿主疾病、脊髓損傷、癱瘓、牛皮癬、腸缺血_再灌注、肝缺血_再灌注、腎缺血_再灌注、心臟缺血_再灌注、腦缺血_再灌注和四肢缺血_再灌注、心肌梗塞、中風(fēng)、炎性腸病、壞死性腸炎和外傷出血。在另一個(gè)實(shí)施方式中，炎性癥狀選自腹膜炎、胰腺炎、膿毒癥、敗血病-感染性休克、敗血病、內(nèi)毒素性休克、克羅恩氏病，潰瘍性結(jié)腸炎、腸梗阻，成人呼吸窘迫綜合征、慢性阻塞性肺病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腸缺血_再灌注、肝缺血_再灌注、腎缺血_再灌注、心臟缺血_再灌注、腦缺血_再灌注和四肢缺血_再灌注、心肌梗塞、中風(fēng)、炎性腸病、壞死性腸炎、哮喘和外傷出血?？蛇x地，炎性癥狀選自外傷出血、敗血病_感染性休克、腸缺血_再灌注、肝缺血_再灌注、腎缺血_再灌注、心臟缺血_再灌注、腦缺血_再灌注和四肢缺血_再灌注、心肌梗塞、中風(fēng)、炎性腸病和壞死性腸炎。給藥方式CIRP抑制劑的給藥途徑取決于待治療的疾病。例如，靜脈注射對(duì)于全身性疾病如膿毒性休克的治療可能是優(yōu)選的，而口服對(duì)于胃腸道疾病如胃潰瘍的治療可能是優(yōu)選的。按照所述方法，本發(fā)明的一種或多種CIRP抗體可通過適宜的途徑或單獨(dú)或與另一種藥物聯(lián)合地給予患者。應(yīng)給予有效量的試劑(即CIRP抑制劑)。“有效量”為給藥條件下足以獲得所需治療或預(yù)防效果的量，如足以抑制炎性響應(yīng)和減輕或治愈炎性癥狀的量。 所述試劑可以單劑量或多劑量給藥。劑量可通過本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法確定并取決于例如所選擇的特定試劑、受試者的年齡、藥敏性和耐藥性、以及整體的健康狀態(tài)?？贵w的適宜劑量可為每次治療約0. 01mg/kg到約100mg/kg體重。有多種可能的給藥途徑，包括例如口服、飲食給藥、局部給藥、經(jīng)皮給藥、直腸給藥、腸胃外給藥(如靜脈、動(dòng)脈、肌肉、皮下注射、皮內(nèi)注射)和吸入(如支氣管內(nèi)、鼻內(nèi)或口腔吸入、鼻內(nèi)滴入)給藥途徑，具體取決于試劑和待治療的病患或疾病?？砂粗甘揪植炕蛉斫o藥。優(yōu)選的給藥方式可隨所選擇的特定試劑(CIRP抑制劑)以及待治療的特定疾病 (如病患)而異。靜脈內(nèi)給藥、口服或腸胃外給藥是優(yōu)選的。所述試劑可以中性化合物或以藥學(xué)可接受的鹽給藥?？赏ㄟ^例如與適宜的有機(jī)或無機(jī)酸如氯化氫、溴化氫、乙酸、高氯酸等反應(yīng)獲得含胺或其他堿性基團(tuán)的化合物的鹽。具有季銨基團(tuán)的化合物也含有抗衡陰離子如氯離子、溴離子、碘離子、乙酸根、高氯酸根等。含羧酸或其他酸性官能團(tuán)的化合物的鹽可通過與適宜的堿如氫氧化物堿反應(yīng)制備。酸性官能團(tuán)的鹽含有抗衡陽離子如鈉離子、鉀離子等。本文中用到的所公開化合物的“藥學(xué)可接受的鹽”為使本發(fā)明的化合物與適合給予受試者的酸或堿反應(yīng)所得到的含離子鍵的產(chǎn)物。例如，含胺或其他堿性基團(tuán)的化合物的酸性鹽可通過使化合物與適宜的有機(jī)或無機(jī)酸如氯化氫、溴化氫、乙酸、高氯酸等反應(yīng)獲得。這類鹽的其他實(shí)例包括鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、甲基磺酸鹽、硝酸鹽、馬來酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽(如(+)_酒石酸鹽、(-)_酒石酸鹽或其混合物，包括外消旋混合物)、琥珀酸鹽、苯甲酸鹽以及與氨基酸如谷氨酸的鹽。當(dāng)所述化合物包含酸官能團(tuán)如-COOH或-SO3H時(shí)，鹽也可與適宜的有機(jī)堿形成。適于與本發(fā)明的化合物形成藥學(xué)可接受的堿加成鹽的這類堿包括無毒且強(qiáng)度足以與酸官能團(tuán)反應(yīng)的有機(jī)堿。這類有機(jī)堿是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的，包括氨基酸(如精氨酸和賴氨酸)、單_、二-和三乙醇胺、膽堿、單_、二-和三烷基胺(如甲胺、二甲胺和三甲胺)、胍、N-芐基苯乙胺、N-甲基葡糖胺、N-甲基哌嗪、嗎啉、乙二胺、三(羥甲基)氨基甲烷等。所述試劑可作為包括CIRP抑制劑和藥學(xué)可接受載體的藥物組合物的一部分給予個(gè)體。本文中用到的“藥物組合物”為以適于向受試者給藥的形式的包含所公開的CIRP 拮抗劑(例如抗-CIRP抗體)和藥學(xué)可接受的稀釋劑或載體的制劑。適宜的藥學(xué)可接受的載體包括惰性固體填充物或稀釋劑和無菌水或有機(jī)溶液。制劑將隨所選擇的給藥途徑而異 (如溶液、乳劑、膠囊劑)。適宜的藥物載體可含不與CIRP促進(jìn)劑(激動(dòng)劑)或抑制劑(拮抗齊U)相互作用的惰性成分?？刹捎脴?biāo)準(zhǔn)的藥物制劑技術(shù)，如Remington's Pharmaceutical Sciences (雷氏藥學(xué)大全)，Mack Publishing Company, Easton, Pa.中所描述的那些。對(duì)于腸胃外給藥而言適宜的藥物載體包括例如無菌水、生理鹽水、抑菌鹽水(含約0. 9% mg/ ml苯甲醇的鹽水)、磷酸鹽緩沖鹽水、Hank溶液、乳酸林格氏(Ringer’ s)液等。包封組合物(如硬明膠或環(huán)狀糊精的包衣)的方法是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的(Baker等人，“Controlled Release of Biological Active Agents，，，John Wiley and Sons, 1986)。對(duì)于吸入，所述試劑可溶液化并裝載于適宜的分藥器中(例如霧化器、噴霧器或加壓氣霧器)。所述藥物組合物可呈散劑或單位劑量形式。單位劑量形式可呈任何形式，包括例如膠囊劑、靜脈注射袋、片劑、一次泵送氣霧劑或小瓶劑。單位劑量組合物中活性成分(即所公開的化合物或其鹽的制劑)的量為有效的量，可隨所涉及的特定治療而異?？梢岳斫?， 可能有必要根據(jù)病人的年齡和狀況改變劑量。劑量也將取決于給藥的途徑。本文中用到的“受試者”包括哺乳動(dòng)物(如人)、伴侶動(dòng)物(如狗、貓、鳥等)、家畜 (如母牛、羊、豬、馬、家禽等)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(如大鼠、小鼠、豚鼠等)。在所公開方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述受試者為人。除非另有指出，本發(fā)明的實(shí)施將采取細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，其在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的。這類技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳盡的描述。參見例如 Sambrook 等人，1989，“Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè))，，，Cold Spring Harbor Laboratory Press ;Ausubel 等人(1995) ,“Short Protocols in Molecular Biology (精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南)”，John Wiley and Sons ；Methods in Enzymology (酶學(xué)方法)(若干卷)；Methods in Cell Biology (細(xì)胞生物學(xué)方法)(若干卷)和Methods in Molecular Biology (分子生物學(xué)方法)(若干卷)。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案在下面的實(shí)施例中描述。根據(jù)本文中所公開的本發(fā)明的說明書或?qū)嵤┓绞?，本文?quán)利要求范圍內(nèi)的其他實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。該說明書和實(shí)施例僅應(yīng)視為示例性的，本發(fā)明的范圍和精神由實(shí)施例后的權(quán)利要求書指定。
實(shí)施例材料和方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性Sprague-Dawley 大鼠(體重為 275_325g)購自 Charles River Laboratories (Wilmington, ΜΑ)，并置于12小時(shí)光/暗循環(huán)的控溫房間內(nèi)用標(biāo)準(zhǔn)Purina 大鼠飼料喂養(yǎng)。在出血休克誘導(dǎo)前，將大鼠禁食過夜，但是允許隨意飲水。本實(shí)驗(yàn)按照美國國立衛(wèi)生研究院(BetheSda，MD)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用指南來進(jìn)行。本項(xiàng)目已獲得Feinstein Institute for Medical Research(Manhasset, NY)的 Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)的批準(zhǔn)。出血性休克動(dòng)物模型本實(shí)驗(yàn)所用出血性休克模型按之前的詳述而略有修改 (Wang PiHauptman JG,Chaudry IH !Hemorrhage produces depression in microvascular blood flow which persists despite fluid resuscitation. Circ Shock 32 :307_318， 1990. ；Wu RiDong W,Zhou M，Cui X，Simms H H,Wang P :A novel approach to maintaining cardiovascular stability after hemorrhagic shock :beneficial effects of adrenomedullin and its binding protein. Surgery 137 :2005)。簡而言之，使大鼠吸入異氟烷進(jìn)行麻醉。在小心分離股神經(jīng)和血管后將導(dǎo)管(PE-50管)置于股靜脈和動(dòng)脈內(nèi)。在另一側(cè)的股動(dòng)脈中也插入導(dǎo)管。用一根動(dòng)脈內(nèi)置管通過血壓分析儀(Digi-Med，Louisville， KY)來監(jiān)控平均動(dòng)脈壓(MAP)和心率(HR)，其它內(nèi)置管用于抽取血液，靜脈管用于體液復(fù)蘇。在IOmin內(nèi)使大鼠出血至MAP為40mmHg。通過進(jìn)一步抽取小體積的血液或提供小體積的乳酸林格氏液維持該壓力90min。在該低血壓階段的最后，用乳酸林格氏液(相當(dāng)于最大出血體積的4倍，大約60%的血液體積計(jì)算值)復(fù)蘇大鼠60分鐘。流出的血液不用于復(fù)蘇，且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在出血前、出血過程中或出血后不進(jìn)行肝素化。4h后，收集血樣并置于冰上進(jìn)行凝血。然后將樣品在4°C下1200g離心lOmin，血清樣品儲(chǔ)存于-80°C直到分析。還收集組織樣品并馬上存于液氮中，然后儲(chǔ)存于-80°C直到分析。實(shí)施假手術(shù)的動(dòng)物進(jìn)行同樣的手術(shù)過程但是既不出血也不進(jìn)行復(fù)蘇。重組蛋白(rCIRP)我們使用了一系列方法用于從細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)和純化具有六組氨酸標(biāo)簽(His-tag)的重組蛋白。cDNA如下制備通過使用修飾的寡聚d(T16)引物用50U的MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)4 μ g的大鼠心臟總組織RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，如之前所述(Dwivedi AJ, Wu R, Nguyen Ε, Higuchi S, Wang H, Krishnasastry K, Marini CP, Ravikumar TS, Wang P:Adrenomedullin and adrenornedul1 in binding protein-1 prevent acute lung injury after gut ischemia-reperfusion. J Am Coll Surg 205 :284_293，2007)。為了得到CIRP蛋白，通過PCR從CIRP的cDNA擴(kuò)增了編碼CIRP的序列，其中使用引物正義 5' -CACCAT GGC ATC AGA TGA AGG-3‘ (SEQ ID No. 2)和反義 5' -CTCGTT GTG TGT AGC ATA GC-3*(SEQ ID No. 3)，對(duì)該引物進(jìn)行合成(根據(jù) GenBank :NM_031147，NCBI 進(jìn)行設(shè)計(jì)) 并用于分離大鼠CIRP克隆。然后用EcoRV和NotI消化PCR產(chǎn)物并克隆至pENTR載體，即， C末端六組氨酸標(biāo)簽(His-tag)系統(tǒng)(描述于Irwitrogen)，然后作為得到的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E. coli BL21 (DE3)。CIRP的誘導(dǎo)表達(dá)在數(shù)升BL21 (DE3)細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行，然后按照生產(chǎn)商(Novagen，Madison，WI)的說明進(jìn)行CIRP的分離和純化。為了避免不慎發(fā)生脂多糖(LPS) 污染，我們應(yīng)用Triton X-114萃取以除去可能的內(nèi)毒素污染，并使用鱟阿米巴樣細(xì)胞溶解物(LAL)分析(BioWhittaker lnc,ffalkersville,MD)測定 LPS 的終濃度，如前所述(Ertel W,Morrison ΜΗ,Wang P,Ba ZF,Ayala A,Chaudry IH :The complex pattern of cytokines in sepsis. Association between prostaglandins, cachectin, and interleukins. Ann Swrg 214 :141-148,1991)。rCIRP的給藥對(duì)額外的健康ιΗ常動(dòng)物組施用了 rCIRP (lmg/kgBff)或緩沖液(等體積，Iml)。治療完成4小時(shí)后，收集血樣并置于冰上進(jìn)行凝血，然后在4°C下1200g離心lOmin，血清樣品儲(chǔ)存于-80°C直到分析。還收集組織樣品并馬上存于液氮中，然后儲(chǔ)存于-80°C直到分析。在另一組出血?jiǎng)游镏?，出血?jiǎng)游飶?fù)蘇開始后15min通過股靜脈管施用 CIRP抗體(3mg/kg Bff)或緩沖液(等體積，lml)45min。治療完成1. 5小時(shí)后，如上述收集組織或血液樣品?？?CIRP抗體的生產(chǎn)通過用純化的重組CIRP以三周或更久的間隔對(duì)兔進(jìn)行注射來根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程生產(chǎn)多克隆抗CIRP血清(Covancc Research Products, Denver, PA)。 使用固定化的免疫純化蛋白-A/G柱根據(jù)供應(yīng)商的說明(Pierce，Rockford, IL)從血清中對(duì)抗-CIRP抗體的IgG進(jìn)行親和純化?？贵w滴度通過96孔板直接ELISA進(jìn)行測定(參見 Covance Research Products, Denver, PA的描述)。純化的抗體制劑中用鱟阿米巴樣細(xì)胞溶解物分析(BioWhittaker)檢測不到LPS的存在。CIRP基因表達(dá)的檢測為了確定在出血中CIRP基因的表達(dá)是否發(fā)生變化，檢測了出血組織并通過實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)進(jìn)行定量。對(duì)使用鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶(Applied Biosystems)反轉(zhuǎn)錄來自 4 μ g RNA 的 cDNA樣品進(jìn)行Q-PCR。使用 QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒(Qiagen，Valencia, CA)，反應(yīng)在24 μ 1的終體積中進(jìn)行，其中含有 2口11101的正義和反義引物，12口 IWQuantiTect Master Mix，以及 1 μ 1 的 cDNA。根據(jù) Qiagen 的推薦使用Applied Biosystems 7300實(shí)時(shí)PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)大鼠G3PDH mRNA的表達(dá)量對(duì)各樣品進(jìn)行歸一化，各特定mRNA的分析進(jìn)行兩個(gè)平行。mRNA的相對(duì)表達(dá)使用AACt 方法進(jìn)行計(jì)算，其結(jié)果以相對(duì)于對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)對(duì)照的倍數(shù)變化的形式給出。使用下述大鼠引物:CIRP(NM_031147) 5' -GGG TCC TAC AGA GAC AGC TAC GA-3H正向)，(SEQ ID No. 4)， 5' -CTG GAC GCA GAG GGC TTT TA-3'(反向)，(SEQ ID No. 5) ；G3PDH(XM 579386) 5' -ATG ACT CTA CCC ACG GCA AG-3'(正向)，(SEQ ID No. 6)，5' -CTG GM GAT GGT GAT GGG TT-3'(反向)，(SEQ ID No. 7)。通過 RT-PCR 評(píng)價(jià)了 TNF-α 的基因表達(dá)。TNF-α 和看家基因的引物如下大鼠TNF-α，5' CCC AGA CCC TCA CAC TCA GA 3'，(SEQ ID No. 8)， 5' GCC ACT ACT TCA GCA TCT CG 3' (SEQ ID No. 9) ；G3PDH，5' TGA AGG TCG GTG TCA ACG GAT TTG GC 3' (SEQ ID No. 10),5' CAT GTA GGC CAT GAG GTC CAC CAC 3' (SEQ ID No. 11)，如前所述(ffu R, Zhou Μ, Wang P :Adrenomedullin and adrenomedullin binding protein-1 downregulate TNF—alpha in macrophage cell line and rat Kupffer cells. Regul Pept 112:19-26,2003)。蛋白質(zhì)印跡分析使用兔CIRP多克降抗體(Protein Tech Group, Chicago, IL) 用蛋白質(zhì)印跡分析檢測了 CIRP蛋白在血清和組織中的表達(dá)。簡而言之，在4-12% NuPAGE Bis-Tris凝膠(Invitrogen，Carlsbad, CA)上將等量的血清(體積)和組織勻漿物(蛋白質(zhì)mg/道)進(jìn)行分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，然后在含有5%的脫脂奶粉的TBST緩沖液 (IOmM Tris-HCl[pH 7. 5], 150mMNaCl,0. 1 % Tween 20)中室溫培養(yǎng) Ih 進(jìn)行封閉。將膜與兔多克隆抗體4°C培養(yǎng)過夜。在用TBST緩沖液洗滌數(shù)次并與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗-兔 IgG(Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ)培養(yǎng)后，根據(jù)生產(chǎn)商的說明加入化學(xué)發(fā)光過氧化物酶底物(ECL ；GE Healthcare Bio-Sciences,Piscataway,NJ)并將膜露置于X-射線膠片。對(duì)蛋白質(zhì)印跡結(jié)果進(jìn)行掃描，使用GS800 Calibrated Densitometer, Bio-Rad Image Analysis Systems (Hercules，CA)對(duì)相對(duì)譜帶強(qiáng)度進(jìn)行定量。使用抗-β-肌動(dòng)蛋白抗體(用于胞漿蛋白，Santa Cruz Biotechnology)確保等量上樣。使用兔HMGBl多克隆抗體檢測大鼠血清HMGBl水平，如前所述(Wang H, Bloom 0, Zhang Μ, Vishnubhakat JM, Ombrellino Μ, Che J, Frazier A, Yang H, Ivanova S, Borovikova L, Manogue KR, Faist Ε, Abraham Ε, Andersson J, Andersson U, Molina ΡΕ, Abumrad NN, Sama A, Tracey KJ HMG-Ias a late mediator of endotoxin lethality in mice. Science 285 :248_251, 1999)。細(xì)胞培養(yǎng)鼠巨噬細(xì)胞樣RAW 264. 7細(xì)胞來自ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA)，其培養(yǎng)于含有 10% (v/v)的 FBS(56°C熱失活 30min)、IOOU/ ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素和2mM谷氨酸的Dulbecco' s Modified Eagle' s培養(yǎng)基 (DMEM, Life Technologies, Grand Island, NY)中。在培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞并在潮濕培養(yǎng)箱中的6或48孔板上培養(yǎng)過夜(37°C，5%C02)。在本實(shí)驗(yàn)中，單層細(xì)胞在不同指定濃度和指定時(shí)間使用或不使用重組CIRP進(jìn)行刺激。無細(xì)胞上清液用ELISA分析TNF-α或用蛋白質(zhì)印跡分析HMGBl。炎性細(xì)胞因子分析作為炎性細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)和急性炎性響應(yīng)的指標(biāo)，對(duì)于用重組 CIRP培養(yǎng)的細(xì)胞上清液使用商業(yè)可獲得的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(BioSource International, Camari 1 io, CA)根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行了 TNF-α和IL-6水平的測定。為了定量血清和組織中的TNF-α和IL-6蛋白質(zhì)水平，我們通過心臟穿刺在大鼠死亡時(shí)收集
16了出血后4h、或重組CIRP治療4h后的動(dòng)物血清樣品，并收集了組織樣品，然后通過與上述相同的方法繼續(xù)進(jìn)行。轉(zhuǎn)氨酶和乳酸鹽的血清水平測定天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、 和乳酸鹽的血清濃度使用分析試劑盒按照生產(chǎn)商的說明(Pointe Scientific, Lincoln Park, MI)進(jìn)行測定。粒細(xì)胞髓過氧物酶的評(píng)價(jià)使用髓過氧物酶(MPO)活性分析對(duì)肺部和肝臟組織中積累的嗜中性粒細(xì)胞進(jìn)行了評(píng)價(jià)，如之前所報(bào)道(Dwivedi AJ, Wu R, Nguyen Ε, Higuchi S,Wang H,Krishnasastry K,Marini CP,Ravikumar TS,Wang P :Adrenomedullin and adrenomedullin binding protein-1 prevent acute lung injury after gut ischemia-reperfusion. J Am Coll Surg 205 =284-293,2007) 統(tǒng)計(jì)分析全部數(shù)據(jù)以平均倌士SE的形式表示，并通過單向方差分析(ANOVA)和 Student-Newman-Keuls方法進(jìn)行比較。存活率使用Kaplan-Meier方法進(jìn)行估測并比較了對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)(log-rank test)。如果P < 0. 05則認(rèn)為數(shù)值差異顯著。結(jié)果出血后循環(huán)和組織CIRP水平的變化經(jīng)過實(shí)驗(yàn)血液損失(出血)的大鼠表現(xiàn)出在不同組織中顯著升高的CIRP表達(dá)。與假手術(shù)的對(duì)照相比在肝臟中CIRP表達(dá)增加了 5倍 (圖2A)，在心臟 3倍(圖2B)。蛋白質(zhì)印跡分析檢測發(fā)現(xiàn)了出血大鼠的CIRP蛋白的高循環(huán)水平。出血組表現(xiàn)出明顯的免疫活性CIRP條帶，其在假手術(shù)組中沒有發(fā)現(xiàn)(圖2C)。與假手術(shù)的大鼠相比，出血?jiǎng)游镄呐K中的CIRP蛋白的表達(dá)也有所增加(FIG. 2D)，(β-肌動(dòng)蛋白用于保證相等的上載)。重組CIRP(rCIRP)導(dǎo)致健康大鼠的組織損傷為了考察rCIRP在ιΗ常動(dòng)物中的作用，我們對(duì)正常健康大鼠施用rCIRP(lmg/kgBW)，一種從細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中純化的重組蛋白， 并檢測了 AST和ALT(肝損傷指示劑)的血清水平。用rCIRP處理的大鼠表現(xiàn)出AST(圖 3A)和ALT(圖3B)水平的顯著提升。這些結(jié)果顯示rCIRP直接導(dǎo)致炎性組織損傷。重組CIRP(rCIRP)增加健康大鼠的促炎性細(xì)胞因子水平在注射rCIRP(ImWkg Bff)或作為對(duì)照的緩沖溶液(等體積)后，TNF-α的血清水平在rCIRP組顯著增加，比緩沖液(空白對(duì)照)組高 5倍(圖4A)。rCIRP給藥后在肝(圖4C和D)和腸(圖4E和F) 中的TNF-α基因和蛋白的表達(dá)都有增加。圖4B顯示了在施用rCIRP(lmg/kg BW)后促炎性細(xì)胞因子HMGBl的循環(huán)水平增加。與空白對(duì)照組的弱條帶(兩次平行)相比，rCIRP處理的大鼠表現(xiàn)出明顯強(qiáng)的免疫反應(yīng)的HMGBl條帶(三次平行)。rCIRP刺激巨噬細(xì)胞后炎性細(xì)胞因子的增加釋放在平行實(shí)驗(yàn)中，我們檢測了與 rCIRP 一起培養(yǎng)的RAW細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的細(xì)胞因子。與重組CIRP —起培養(yǎng)的RAW細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中TNF-a和IL-6水平的增加是劑量和時(shí)間依賴性的。如圖5A所示，劑量為100ng/ml的rCIRP(培養(yǎng)4h)顯著增加TNF-α釋放。對(duì)于時(shí)間進(jìn)程，劑量為100ng/ml 的rCIRP分別早在培養(yǎng)后4h和2h即顯著增加TNF- α和IL-6的生產(chǎn)(圖5C-D)。上清液 HMGBl水平隨著rCIRP的刺激以劑量依賴型的方式增加。蛋白質(zhì)印跡定量顯示RAW細(xì)胞培養(yǎng)釋放的HMGBl在與劑量為500ng/ml的rCIRP培養(yǎng)20h后增加了 _6倍(圖5B)?？?CIRP抗體提供了出血后的顯著存活優(yōu)勢(shì)為了講一步確認(rèn)CIRP是針對(duì)各種挑戰(zhàn)例如出血等的炎性響應(yīng)的新型介導(dǎo)物，我們對(duì)出血大鼠施用了 CIRP的特異性抗體(3mg/kg BW)。結(jié)果顯示CIRP阻斷作用提供了急性血液損失中的顯著存活優(yōu)勢(shì)。如圖6所示， 抗-CIRP抗體處理增加了實(shí)驗(yàn)性出血?jiǎng)游锏拇婊盥?，?3%到85% (P < 0. 05)。抗-CIRP抗體減弱了出血后的組織損傷為了繼續(xù)考察rCIRP在出血響應(yīng)中的病理生理學(xué)結(jié)果，我們對(duì)出血大鼠施用了 CIRP的特異性抗體(3mg/kg BW)。我們的結(jié)果顯示出血后AST、ALT和乳酸鹽水平的增加被抗-CIRP抗體顯著減輕(降低了 30-40%，P < 0. 05) (圖 7A-C)。抗-CIRP抗體減弱了出血導(dǎo)致的促炎件細(xì)朐,因子增加用CIRP特異性抗體(3mg/ kg BW)的處理顯著降低了出血導(dǎo)致的TNF-α (圖8Α)和IL_6(圖8D)在血清中的上調(diào)。在實(shí)驗(yàn)性血液缺失(出血)的動(dòng)物的肺和肝中分別觀察到了非常相似的TNF-α (圖8Β和C) 和IL-6 (圖8Ε和F)組織水平的結(jié)果?？?CIRP抗體降低了出血后MPO的活件增加ΜΡ0 (髓過氧物酶)被認(rèn)為是炎癥的一般指示物，增加的組織MPO活性反映了嗜中性粒細(xì)胞的溢出。實(shí)驗(yàn)性出血導(dǎo)致了肝部MPO 的活性增加。我們已經(jīng)觀察到施用抗-CIRP抗體后增加的MPO被顯著降低(圖8G)。本說明書中引用的全部參考文獻(xiàn)在此弓丨入作為參考。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，包含i)藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑；和ii)CIRP抑制劑。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述CIRP抑制劑是特異性結(jié)合CIRP或其抗原性片段的抗體，其中所述抗體或抗原性片段抑制CIRP的一種或多種生物活性。
3.權(quán)利要求2的藥物組合物，其中所述CIRP抗體是多克隆抗體，或其抗原性片段。
4.權(quán)利要求2的藥物組合物，其中所述CIRP抗體是單克隆抗體，或其抗原性片段。
5.權(quán)利要求2的藥物組合物，其中所述CIRP抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體，或其抗原性片段。
6.權(quán)利要求2的藥物組合物，其中所述CIRP抗體是單鏈抗體，或其抗原性片段。
7.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述CIRP抑制劑是降低CIRP的表達(dá)的CIRP反義分子。
8.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述CIRP抑制劑具有低于1000道爾頓的分子量。
9.一種治療患有炎性癥狀的受試者的方法，該方法包括對(duì)受試者施用有效量的CIRP 抑制劑。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述CIRP抑制劑是特異性結(jié)合CIRP或其抗原性片段的抗體，其中所述抗體或抗原性片段抑制CIRP的一種或多種生物活性。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述CIRP抗體是多克隆抗體，或其抗原性片段。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述CIRP抗體是單克隆抗體，或其抗原性片段。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述CIRP抗體是嵌合抗體、人抗體、或人源化抗體，或其抗原性片段。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述CIRP抗體是單鏈抗體。
15.權(quán)利要求9的方法，其中所述CIRP抑制劑是阻止CIRP的表達(dá)的CIRP反義分子。
16.權(quán)利要求9的方法，其中所述CIRP抑制劑具有低于1000道爾頓的分子量。
17.權(quán)利要求9的方法，其中所述炎性癥狀是急性炎癥發(fā)作。
18.權(quán)利要求9的方法，其中所述炎性癥狀選自闌尾炎、消化性潰瘍、胃潰瘍和十二指腸潰瘍、腹膜炎、胰腺炎、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、腸梗阻、會(huì)厭炎、弛緩不能、膽管炎、膽囊炎、肝炎、惠普耳氏病、哮喘、變態(tài)反應(yīng)、過敏性休克、免疫復(fù)合疾病、器官缺血-再灌注損傷、器官壞死、花粉熱、膿毒癥、敗血病_感染性休克、敗血病、內(nèi)毒素性休克、惡病質(zhì)、高熱、 嗜曙紅細(xì)胞肉芽腫、肉芽腫病、結(jié)節(jié)病、膿毒性流產(chǎn)、附睪炎、陰道炎、前列腺炎、尿道炎、支氣管炎、氣腫、鼻炎、肺炎、矽肺病、肺泡炎、細(xì)支氣管炎、咽炎、胸膜炎、竇炎、流行性感冒、呼吸道合胞體病毒感染、皰疹感染、HIV感染、乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、彌漫性菌血癥、登革熱、念珠茵病、瘧疾、絲蟲病、阿米巴病、包蟲囊腫、血管炎、脈管炎、心內(nèi)膜炎、 動(dòng)脈炎、動(dòng)脈硬化癥、血栓性靜脈炎、心包炎、心肌炎、局部缺血、結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周圍炎、風(fēng)濕熱、乳糜泄、成人呼吸窘迫綜合征、慢性阻塞性肺病、腦膜炎、腦炎、神經(jīng)炎、神經(jīng)痛、脊髓損傷、癱瘓、葡萄膜炎、關(guān)節(jié)炎疹、關(guān)節(jié)痛、骨髓炎、筋膜炎、佩吉特氏病、痛風(fēng)、牙周病、關(guān)節(jié)炎、 滑膜炎、重癥肌無力、甲狀腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、同種異體移植物排異反應(yīng)、移植物抗宿主疾病、古德帕斯徹氏綜合征、白塞氏綜合征、強(qiáng)直性脊柱炎、貝格爾氏病、Retier氏綜合征、 何杰金氏病、牛皮癬、心肌梗塞、中風(fēng)、炎性腸病、壞死性腸炎和外傷出血。
19.權(quán)利要求10的方法，其中所述炎性癥狀選自闌尾炎、消化性潰瘍、胃潰瘍或十二指腸潰瘍、腹膜炎、胰腺炎、肝炎、哮喘、變態(tài)反應(yīng)、過敏性休克、器官壞死、花粉熱、膿毒癥、敗血病-感染性休克、敗血病、內(nèi)毒素性休克、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、腸梗阻、惡病質(zhì)、 膿毒性流產(chǎn)、彌漫性菌血癥、乳糜泄、成人呼吸窘迫綜合征、慢性阻塞性肺病、關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、同種異體移植物排異反應(yīng)、移植物抗宿主疾病、脊髓損傷、癱瘓、牛皮癬、腸缺血_再灌注、肝缺血_再灌注、腎缺血_再灌注、心臟缺血_再灌注、腦缺血_再灌注和四肢缺血_再灌注、心肌梗塞、中風(fēng)、炎性腸病、壞死性腸炎和外傷出血。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述炎性癥狀選自腹膜炎、胰腺炎、膿毒癥、敗血病-感染性休克、內(nèi)毒素性休克、克羅恩氏病，潰瘍性結(jié)腸炎、腸梗阻、成人呼吸窘迫綜合征、慢性阻塞性肺病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡，腸缺血_再灌注、肝缺血_再灌注、腎缺血_再灌注、心臟缺血_再灌注、腦缺血_再灌注和四肢缺血_再灌注、心肌梗塞、中風(fēng)、炎性腸病、 壞死性腸炎、哮喘和外傷出血。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述炎性癥狀選自外傷出血、敗血病-感染性休克、腸缺血_再灌注、肝缺血_再灌注、腎缺血_再灌注、心臟缺血_再灌注、腦缺血_再灌注和四肢缺血_再灌注、心肌梗塞、中風(fēng)、炎性腸病和壞死性腸炎。
22.權(quán)利要求9的方法，其中所述受試者是人。
23.一種分離的抗體，其特異性結(jié)合CIRP或其抗原性片段，其中所述抗體或抗原性片段抑制CIRP的一種或多種生物活性。
24.權(quán)利要求23的抗體，其中所述CIRP抗體是多克隆抗體，或其抗原性片段。
25.權(quán)利要求23的抗體，其中所述CIRP抗體是單克隆抗體，或其抗原性片段。
26.權(quán)利要求23的抗體，其中所述CIRP抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體，或其抗原性片段。
27.權(quán)利要求23的抗體，其中所述CIRP抗體是單鏈抗體，或其抗原性片段。
28.—種抑制CIRP活性的方法，該方法包括對(duì)其有需要的受試者施用有效量的CIRP抑制劑。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述CIRP抑制劑抑制CIRP受體的結(jié)合。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述CIRP抑制劑抑制CIRP信號(hào)的傳導(dǎo)。
31.權(quán)利要求28的方法，其中所述CIRP抑制劑抑制CIRP介導(dǎo)的炎癥。
32.權(quán)利要求28的方法，其中所述CIRP抑制劑抑制CIRP介導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子的釋放。
全文摘要
公開了含有CIRP抑制劑的藥物組合物。還描述了治療患有炎性癥狀的受試者的方法，該方法包括對(duì)所述受試者施用CIRP抑制劑。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102458465SQ201080026421
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月13日
發(fā)明者王平 申請(qǐng)人:范因斯坦醫(yī)學(xué)研究院