專利名稱：一種無誘導高效蛋白表達體系及其構建方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種無誘導高效蛋白表達體系及其構建方法。
背景技術：
目前人們普遍使用PCR方法獲得外源基因，首先在克隆載體上進行測序，證實無誤后再 亞克隆至表達載體，這增加了分子生物學操作步驟，也增加了基因轉移過程中出錯的幾率， 同時，在亞克隆時對外源基因5'端酶切位點的種類要求嚴格，它要求克隆載體和表達載體 中外源基因上游存在共同的酶切位點。對酶切位點的限定大大影響了 ATG與SD保守序列之間 距離的選擇。而二者之間的距離對基因表達水平有極大的影響。研究結果表明，SD保守序列 與ATG之間以6—12個堿基為最佳，超出此范圍會降低蛋白質的表達水平。
目前要在特定宿主細胞表達外源蛋白必須使用與之相適應表達體系。對于原核表達系統(tǒng) 來說，原核表達體系中使用的啟動子類型主要有基于lac操縱子的啟動子、T7噬菌體啟動子、 入噬菌體PL啟動子、堿性磷酸酶phoA啟動子等。含這些啟動子的體系表達外源蛋白時都需 要滿足特定的誘導條件。誘導lac啟動子需要cAMP激活蛋白，即CAP，而在含葡萄糖的培養(yǎng) 環(huán)境中CAP含量很低，外源基因不能表達。也就是說含lac啟動子載體必須在無葡萄糖培養(yǎng) 時才能表達外源蛋白，而且還需要補加IPTG誘導。但是IPTG價格昂貴，不能用于大量誘導。 用T7噬菌體啟動子時，宿主菌細胞內必須能提供T7噬菌體基因1的產物，即T7噬菌體RNA 聚合酶，要么由感染性入噬菌體提供，要么由插入目的宿主菌染色體的基因產生， 一般采用 的溶源性細菌BL21 (DE3)，其中T7噬菌體基因1是受控于IPTG誘導的了 lac UV5啟動子。 用入噬菌體PL啟動子時，其受控于溫度敏感阻抑物clts857，宿主菌必須攜帶clts857基因， 阻抑物clts857在低溫下啟動表達，高溫時不能。phoA啟動子是堿性磷酸酶啟動子，在過量 磷酸鹽存在時被抑制，磷酸鹽饑餓時被逐漸誘導。
因此，目前沒有任何一種表達體系可在無需誘導條件下進行外源基因的表達，更不用說 能在不同宿主細菌中表達。 發(fā)明內容-
本發(fā)明提供了一種無需誘導，能在多種不同的宿主細菌中高效表達目的蛋白的表達體系 及其構建方法，該表達體系克服現(xiàn)有技術的不足，實現(xiàn)了無需誘導的條件下進行外源基因的 高效表達。
3本發(fā)明所述的無誘導高效蛋白表達體系，包括NAD(P)H脫氫酶基因啟動子和pMD 18-T simple克隆載體，在啟動子序列的3'端接有SD序列，SD序列后接有目的基因，由此構建 的片段插入pMD 18-T simple克隆載體的T克隆位點中，形成環(huán)狀的表達質粒，所述的NAD(P)H 脫氫酶基因啟動子的序列如SEQ1所示，所述的SD序列如SEQ2所示。
本發(fā)明還可以在目的基因后面接有強終止密碼子TGA。
本發(fā)明通過以下技術方案實施的
(a) 以希瓦氏菌S12基因組DNA為模板通過PCR方法擴增其NAD(P)H脫氫酶基因啟動 子；
(b) 設計引物PCR擴增目的基因，在其5'端加入高效SD序列；
(c) 設計引物橋，將步驟(a)得到的NAD(P)H脫氫酶基因啟動子與步驟(b)得到的 含有目的基因的片段連接，連接產物與pMD 18-T simple載體重組，使連接產物 插入pMD 18-T simple載體的T克隆位點，形成環(huán)狀的表達質粒，即為無誘導高 效蛋白表達體系；
將步驟(c)得到的重組質粒轉入受體菌中，表達目的蛋白。
本發(fā)明所述的目的基因可以是三苯基甲垸氧化酶基因&歷"，受體菌可以是￡c^j'DH5
a，還可以是脫色希瓦氏菌S12。
本發(fā)明所述的目的基因可以是熒光蛋白EYFP基因，受體菌可以是￡^乃'S17 — l。 本發(fā)明構建的無誘導高效表達體系，轉化進入受體菌后，能在無需誘導的情況下，高效
的表達目的蛋白。
利用本發(fā)明所構建的無誘導高效表達體系，是利用了在細菌中廣泛發(fā)揮作用的NAD (P) H脫氫酶基因的啟動子，所構建的體系表達目的蛋白無需昂貴的IPTG或者其他誘導物誘導， 不受細菌種類的限制，只要轉化進細菌細胞，即可發(fā)揮作用，高效表達目的蛋白，其表達量 甚至超過原始基因在原始宿主的表達量，因而大大擴展了應用領域，本發(fā)明構建的表達體系 是以pMD 18-T simple克隆載體為基礎，因此具有操作容易，拷貝數(shù)高的特點，這大大簡化 了操作步驟，減少了基因出錯的幾率。由于未影響LacZ基因片段的a互補功能，藍白篩選手 段仍然適于對重組子的篩選大大簡化了篩選目的轉化子的工作，同時可利用載體的通用引物 進行測序驗證。利用這一表達體系構建方法不僅節(jié)約時間、減輕工作量，而且成功率、可靠 性都比較高。


圖1是細菌對染料結晶紫的脫色能力比較圖，其中1是￡. coh'DH5a/pMD-18T， 2是￡ coh'
4DH5 a ， 3是￡ co力'DH5 a /pt卿D， ， 4是DN322， 5是￡ c。力.DH5 a /pSPrtpmD';
圖2是細菌對染料孔雀石綠的脫色能力比較圖，其中1是￡ co力'DH5 a /pMD_18T, 2是￡ co"'
DH5 a ， 3是￡ co乃'DH5 a /ptmpD， ， 4是DN322， 5是￡ co7i DH5 a /pSPrtpmD，；
圖3是細菌對染料燦爛綠脫色能力比較圖，其中1是￡ co力'DH5 a /PMD-18T， 2是￡ coh'DH5
a ， 3是￡ coh' DH5 a /ptmpD， ， 4是DN322， 5是￡ coh' DH5 a /pSPrtpmD，；
圖4是細菌對染料堿性品紅的脫色能力比較圖，其中1是￡ coh'DH5 a /pMD_18T， 2是￡
DH5 a ， 3是￡ co7i DH5 a /ptmpD， ， 4是DN322， 5是￡ co7i DH5 a /pSPrtpmD ，;
圖5是TpinD酶酶譜檢測圖(結晶紫染色)，其中1是￡ co7/ DH5 a , 2是￡DH5 a /
ptpmD， ， 3是DN322， 4是￡ ca// DH5 a / pSPrtpmD， ， 5是￡ coW DH5 a/pMD18-T;
圖6是各細菌提取的粗酶液的SDS-PAGE電泳圖，其中1是￡ co力'DH5 a ， 2是￡ coW DH5 a /
pSPrtpmD' ， 3是AcW DH5a/ptpmD，；
圖7 ^ffl菌對對染料結晶紫的脫色能力比較圖8是細菌對染料孔雀石綠的脫色能力比較圖9是細菌對染料燦爛石綠的脫色能力比較圖IO是細菌對染料堿性品紅的脫色能力比較圖ll是大腸桿菌中熒光蛋白基因在啟動子控制下的表達，其中l(wèi)是f co^S17-l， 2是￡ 1/
S17-l/pEYFP， 3是￡ c。2i S17-l/pEYFP-SP;
具體實施例方式
以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，不是對本發(fā)明的限制 實施例l
應用無誘導高效蛋白表達體系表達三苯基甲垸氧化酶&歷"
(1) 5MV^ro膨"r (S7^的獲得 根據(jù)幼e『朋e^ssp. ANA-3基因組序列數(shù)據(jù)，第0316閱讀框的Promoter序列，設計上
下游引物為
prometerEF: 5， TTTTTCTTTTTTATGGGCTA 3，； proraeterER: 5' TTTAGACATMTCTGCTCCG 3'。
以脫色希瓦氏菌S12基因組DNA為模板PCR擴增NAD(P〉H脫氫酶基因的Promoter序列， 命名為5"yV"尸ro膨ter f57^ 。 PCR反應條件為94 'C變性4min后進入30個循環(huán)94°C變性30s ， 43'C退火30s， 72'C延伸45s;最后延伸7min。擴增產物為98bp。擴增產物用1%瓊脂糖凝 膠進行電泳分析并回收純化。
5(2) t/M /T的獲取
tpmD基因的序列如SEQ3所示，根據(jù)tpmD基因序列，設計上下引物為 TpmDEF: "aTA46^^(S46^Z47/46M7arATGATGTCAATTGCGGTG TpmDC4ERl: TCACm^L^贏dg^/Orgd6CATTTTCAGGGCTTG
在上游引物5'端含有高效SD序列；下游引物5'端含有強終止密碼子PCR擴增反應為 30個循環(huán)，94。C預變性5min后進入30個循環(huán)94。C變性45s， 52。C退火45s， 72。C延伸lmin30s， 最后72。C延伸10min。 919bp的擴增產物命名為^wZ^ 。
(3) 5Pr和&歷壙兩片段的融合
設計引物橋bridge: 5' GCCCATAAAAAAGAAAAAGGGGGAGGTATTGAGAAG 3，進行三引物 (p匿terEF， bridge, TpmDC4ERl) PCR擴增，1017bp的PCR產物命名為SPrtpmD， 。
PCR反 應條件為94。C預變性5min后進入30個循環(huán)94。C變性lmin, 52。C退火1. 0min， 72。C延伸 2. 0min，最后72'C延伸lOmin，將按此方法構建的5Fr和^M Z^的融合片段命名為SPrtpmD'。
(4) 目的片段的回收 按照上海生工生物工程技術有限公司凝膠回收試劑盒說明書回收目的片段。
(5) 載體pMD18 T simple vector與融合基因SPrtpmD，的連接
目的DNA:5ml，載體DNA: 1 u L， T4連接酶1 u L, 10Xbuffer: 1 u L，無菌水2uL， 16。C恒溫過夜，使得載體pMD18 T simple vector與融合基因SPrtpmD，的連接，由此構建 重組質粒pSPrtpmD'。
(6) 轉化篩選與驗證
重組質粒pSPrtpmD，轉化￡. coh' DH5ci感受態(tài)細胞。10 u L連接產物分別加入到200 wl感受態(tài)細胞中，輕輕搖勻，冰浴30分鐘；42"C水浴中熱擊90秒，然后迅速置于冰上冷 卻3-5分鐘，加入0. 8mlLB液體培養(yǎng)基(不含Amp)于37。C振蕩搖床上90rpm低速振蕩培養(yǎng)1 小時，使細菌恢復正常生長狀態(tài)。4°C, 10000rpm離心10min，棄去部分上清，4'C保存?zhèn)溆谩?用X-gal和IPTG篩選陽性重組子菌落一藍白斑篩選；分別挑取AmpK表型菌株(白色菌落)， 通過PCR與測序鑒定，符合預期構建好的序列為陽性克隆子，命名為Aco力'DH5a/ pSPrtpmD，。
將tpmD'與pMD18-T克隆載體連接，轉化進入A cWi DH5 a ，篩選陽性克隆，得到的 陽性克隆子命名為A c。W DH5 a / ptpmD，。
將空載體pMD18-T克隆載體轉化進入￡ DH5a ，篩選陽性克隆，得到的陽性克隆 子命名為E coh' DH5 a /pMD18-T。(7) 菌懸液的制備
將經單菌落純化的f.co7/ DH5a/ pSPrtpmD'菌株和co 2' DH5 a / ptpmD，菌株與 ￡ coh' DH5 a 、嗜水氣單胞菌DN322及￡ coh' DH5 a /pMD18-T分別在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜， 取相同0D值的菌液于6000 r mirT'下離心10min收集菌體，用PBS(pH=8. 0)洗菌體2次， 重懸于PBS(pH-8. O)中。
(8) 脫色實驗
將各菌懸液分別接種于30mL染料濃度為100mg/L的染料培養(yǎng)基中，3(TC下靜置培養(yǎng)。 染料培養(yǎng)基
酵母抽提物 0.2g KH2P04 2.66g
NaCl 2.5g (NH4)2S04 0.5g
Na2HP04-7H20 4.32g H20 200mL
12rC蒸汽滅菌20min ，按上述濃度加入滅過菌染料貯備液。 每隔lh時間取培養(yǎng)液用8000Xg離心去除菌體，用紫外一可見分光光度計分別在各染料 的最大吸收峰處測定各上清液的吸光值，并以不加菌的染料培養(yǎng)基為對照，按以下公式計算 脫色率"。
;7= (J-5) /JX100% 式1
式中，j為不加菌的染料培養(yǎng)上清液的吸光值，5為加菌的染料培養(yǎng)上清液的吸光值。本次脫
色實驗是對染料結晶紫，孔雀石綠，燦爛綠，堿性品紅。脫色率測定結果見圖l、 2、 3、 4。 由圖1、 2、 3、 4可以看出，含有希瓦氏菌啟動子SPr的融合基因重組菌株E.coli DH5 a / pSPrtpmD'的脫色速率比只含有嗜水氣單胞菌DN322氧化酶基因tpmD的重組菌株E. coli DH5 a / ptpmD'快；脫色效率要高，其脫色效率甚至比嗜水氣單胞菌DN322還高。而受體菌株 E. coli DH5 a以及只含有空載體的受體菌株E. coli DH5 a /pMD18-T在脫色速率和效率很低且 隨時間的變化很小，由此可以說明本方法構建的表達體系能在無誘導的條件下高效表達目的 蛋白。
(9) 各菌粗酶液酶活測定，PAGE電泳酶譜染色，SDS-PAGE電泳 A.粗酶液的制備
經過純化的菌株E. coli Z /^a7 pSPrtpmD，和E.coli ZW5a7 ptpraD，與E.coli ZW5a 及E. coli ZW5c/pMD18-T在37。C培養(yǎng)16個小時后各取lml，離心收集菌體使用0. 5mlPBS緩 沖液重懸菌體。于超聲波破碎儀上間隔3秒破碎3秒，總破碎時間為15分鐘。細胞裂解液經
716000r/min離心15分鐘，上清液即為粗酶液。
B. 蛋白質濃度的測定
參照Bradford的方法(Bradford, 1976)。將的待測蛋白樣品分別吸入到微孔板， 每個樣品中加入4(￥1試劑(Bio-Rad)后完全混勻。室溫放置5-10min后在分光光度計上于 595nm測定吸收值。用牛血清蛋白作標準曲線。
C. 酶活力的測定
酶活測定在25'C條件下進行，反應總體積為100uL。 77化的50mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 7. 5)與的粗酶抽提物混合后，加入5叱5mmol/L的染料(終濃度為0. 25raraol/L)。加入3叱 25mmol/L的NADH(終濃度0. 75mmol/L)后，立即于分光光度計上連續(xù)測定染料在最大吸收波 長處0D值隨時間的變化。結晶紫的最大吸收波長為590nm。以IO(TC， 30min滅活酶液的反應 混合液為對照，酶活單位定義為以25。C條件下每分種催化lmg染料所需要的酶量為1個酶活 單位(U)。測定結果見表l。
表1各菌株粗酶液酶活力比較
染料￡ c。力.ffl5 a pSPrtpmD，/ JerazKms DN322/7/ahp&7a ￡ca/y ffl5 a ptpmD，/ ￡c。A.鵬 a￡ c。A'ffl5 a /{M18-T
結晶紫48.00U35.29U3. 77U0U0U
孔雀石 綠41. 38U33. 33U2, 85U0U0U
燦爛綠39. 23U32.44U2. 73U0U0U
堿性品 紅30.18U25.35U2. 56U0U0U
由表1可見，￡ co乃'DH5 a以及只含有空載體的受體菌株￡ cWi DH5 a /pMD18-T檢測 不到酶活，而基因工程菌的三苯基甲烷染料氧化酶活性可測到，工程菌株￡a^'DH5a/ pSPrtpmD'的三苯基甲垸染料氧化酶活性超過了基因供體菌株DN322;這是由于重組菌株轉化 進了三苯基甲烷染料氧化酶基因tpmD，并得到了高效表達，提高了工程菌的三苯基甲烷染料 氧化能力。
D. 聚丙烯酰胺凝膠電泳
按Davis方法進行(何忠效，1999 )，分別配制分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液和電泳緩沖 液，不連續(xù)緩沖體系凝膠濃度為10%，電極緩沖液pH值為8.3。電泳在室溫條件下進行。
E. 脫色酶酶譜染色
8按上述方法進行電泳，將PAGE電泳完畢的膠立即浸泡于50mL濃度為200mg/L的結晶紫 染料溶液中10rain，隨后轉入含2mmol/L NADH的磷酸緩沖液(pH 7. 0)中，室溫放置10min，觀 察脫色帶的顯現(xiàn)。凝膠背景中深紫色的染料被脫色的透明帶區(qū)即為脫色酶的位置。酶譜實驗 結果見圖5，由圖5可見，在第2泳道的￡ co7i DH5a / ptpmD，、第3泳道的Zero/z o朋s AK^ro; /^7a DN322和第4泳道的￡ c^i DH5 a / pSPrtpmD，上都具有明顯的酶譜條帶且酶 譜在膠中的位置相同；而在第1泳道的￡ DH5 a及第5泳道的￡ DH5 a /pMD18-T 膠上同一位置沒有呈現(xiàn)出酶譜條帶。這一結果說明重組菌株￡ co"' DH5a / pSPrtpmD'和 ￡ co7i DH5a / ptpmD，與親本^ero歷o/ a / ydrop/u7a DN322菌株在脫色功能和酶蛋白表觀 分子量上完全一致；同時也證實了脫色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脫氫酶基因啟動子序列能夠 被大腸桿菌DH5 a識別，以及不需誘導物的條件下高效啟動下游基因的轉錄表達。
F. SDS-PAGE電泳
按Laemmli方法進行(Laemmli， 1970),不連續(xù)緩沖體系凝膠濃度為12%，電極緩沖液pH 值為8.3。
G. 考瑪斯亮藍R-250染色方法
參照《蛋白質電泳技術》(郭堯君，1999)中的考瑪斯亮藍R-250染色方法， 將電泳膠浸泡于固定液中至少30min，轉移至染色液中，加熱至6(TC染色lOmin，倒出 染色液，加入脫色液，多次更換并加熱脫色液，直至背景脫凈為止。結果見圖6，由圖6可 以看出，第l， 2， 3泳道都有多條蛋白質帶出現(xiàn)，其中2,3泳道在膠上相同位置比第1泳道 多出一條帶，且第2泳道的這一條帶比第3泳道的要顏色深很多。表明在菌株E.coli /F5" / pSPrtpmD，和￡ cW/DH5 a/ptpmD，粗酶液中存在同一種蛋白質，這一蛋白帶是不存在與 菌株E.coli ZW5"的粗酶液中的；且這一蛋白質在相同總量蛋白質的粗酶液中菌株E.coli ZW5ff/ pSPrtpmD，中的含量明顯比￡ co7j' ZM a7 ptpmD，多許多。這一結果從蛋白質量的 角度為表1的結論提供了互證，從本實施例可以看出構建的表達體系是能夠無誘導的情況下 高效的表達目的蛋白。
實施例2
一種無誘導高效三苯基甲垸氧化酶表達體系(在脫色希瓦氏菌中)的應用
本實施例的重組質粒pSPrtpmD'的構建方法同于實施例l，將重組質粒pSPrtpmD'轉化 進入脫色希瓦氏菌中，篩選轉入了重組質粒pSPrtpmD'的陽性克隆子，命名為S12/ pSPrtpmD'。
9(1) 菌懸液的制備將經單菌落純化的S12/ pSPrtpmD'菌株與親本菌株嗜水氣單胞菌 DN322和脫色希瓦氏菌S12分別在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，取相同0D值的菌液于6000 r min—'下離心10min收集菌體，用PBS(pH=8. O)洗菌體2次，重懸于PBS(PH=8. 0) 中。
(2) 脫色實驗將各菌懸液分別接種于30mL染料培養(yǎng)基中，3(TC下靜置培養(yǎng)。 染料培養(yǎng)基
酵母抽提物 0.2g KH2P04 2.66g
NaCl 2.5g (NH4)2S04 0,5g
Na2HP047H20 4.32g H20 200mL
12rC蒸汽滅菌20min ，按需加入滅過菌染料貯備液。
每隔lh時間取培養(yǎng)液用8000Xg離心去除菌體，用紫外一可見分光光度計分別在各染料的最 大吸收峰處測定各上清液的吸光值，并以不加菌的染料培養(yǎng)基為對照，按以下公式計算脫色 率 7。
/7= (J-萬)〃X100% (1) 式中，力為不加菌的染料培養(yǎng)上清液的吸光值，^為加菌的染料培養(yǎng)上清液的吸光值。本次脫 色實驗是對染料結晶紫，孔雀石綠，燦爛綠，堿性品紅，脫色率測定結果見圖7、 8、 9、 10。 由圖7、 8、 9、 IO可以看出，S12菌通過質粒pSPrtpmD'獲得了高效的三苯基甲垸染料降解 脫色能力，其脫色能力甚至比嗜水氣單胞菌DN322還高。
實施例3
應用無誘導高效蛋白表達體系表達熒光蛋白EYFP 本實施例的啟動子序列5MFr，"er^尸rj的獲得同于實施例1 (1) EYFP的PCR擴增
根據(jù)質粒pEYFP的序列信息設計引物
ey御F: g/L4g&4fi4 7>17M6M7UTATGAGTAAAGGAGAAGAAC;
e/娜TTATTTGTATAGTTCATCCATGCC
上游引物5，端含有SD序列；PCR擴增EYFP條件為94。C預變性4min后進入30個循 環(huán)94。C變性45s， 55。C退火45s， 72。C延伸lmin，最后72。C延伸10min。 717bp的擴增產物 命即為eyfp基因。質粒pEYFP可以從商業(yè)公司購買到。
10(2) SPr和EYFP兩片段的融合
設計引物橋bridge: 5， CCTTTACTCATGGGATGTATATCTCCTTCTTTAGACATMTCTGCTC 3，，并將引 t/^及實施例1中的弓嫩prometerEF和ej^bER加入反應體系進行三弓嫩PCR擴增。PCR反應條件 為94'C預變性4min后進入30個循環(huán)94'C變性lmin， 52。C退火1. 0min， 72。C延伸1. 5min， 最后72X:延伸10min。
(3) 目的片段的回收 按照上海生工生物工程技術有限公司凝膠回收試劑盒說明書回收目的片段。
(4) 載體pMD18 T vector與融合基因SPrEYFP的連接
按照目的DNA:5uL,載體DNA: 1 u L， T4連接酶1 u L， 10Xbuffer: 1 u L，無菌水 2ixL配制連接反應體系，16"C恒溫過夜連接，獲得的pEYFP-SP重組質粒。
(5) 轉化篩選與驗證
重組質粒pEYFP—SP轉化￡ co乃'S17 — l感受態(tài)細胞。10uL連接產物分別加入到200 ul感受態(tài)細胞中，輕輕搖勻，冰浴30分鐘；42'C水浴中熱擊90秒，然后迅速置于冰上冷 卻3-5分鐘，加入0. 8mlLB液體培養(yǎng)基(不含Amp)于37。C振蕩搖床上90rpm低速振蕩培養(yǎng)1 小時，使細菌恢復正常生長狀態(tài)。4°C， 10000rpm離心10min，棄去部分上清。然后將菌懸液 涂布在含X-gal和IPTG的A卿平板上，37。C過夜培養(yǎng)；挑取An^表型菌株，通過PCR與測序 鑒定符合預期的即為陽性克隆子，命名為^co力'S17 — l/ pEYFP—SP。
將pEYFP基因與克隆載體pMD 18-T simple連接，轉化進入￡ co/i S17 — l，篩選陽性 克隆子，命名為co7i S17 — l/pEYFP。
(6) 陽性克隆子熒光蛋白表達分析
將經單菌落純化的￡ S17—l/ pEYFP—SP菌株與親本菌株￡ co乃'S17 — l/ pEYFP和 ￡ c。h'S17 — l分別在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，取相同0D的菌液于6000 r min—下離心10min 收集菌體，用PBS (pH=8. 0)洗菌體2次，重懸于10 u L PBS (pH=8. 0)中。取該菌懸液5 n L在 LB (Amp"平板上劃線培養(yǎng)，37'C過夜。取長好的平板放在紫外燈下通過觀察熒光強度比較 熒光蛋白表達。由圖ll可以看出，實驗中的熒光蛋白基因載體pEYFP即使在原始大腸桿菌宿 主中表達效果也不甚理想，而在該熒光蛋白基因前設計加入S12啟動子SPr序列后通過初步 在大腸桿菌中表達情況來看，在該啟動子作用下大腸桿菌E. colisl7-1/pEYFP-SP菌體熒光明 顯增強，因此可以證明本表達體系可以在無誘導的條件下高效的表達熒光蛋白。
由上述實施例可以看出本發(fā)明構建的無誘導高效蛋白表達體系無需誘導，且不受細菌種類 的限制，只要轉入受體菌就可以高效表達目的蛋白。序列表
<110>廣東省微生物研究所
<120>—種無誘導高效蛋白表達體系及其構建方法
<160> 3
<210〉 1
<211>98
<212> DNA
〈213〉脫色希瓦氏菌(幼e麗"e〃a cfeco/ora"'ow!X) S12 <400> 1
TTTTTCTTTT TTATGGGCTA ATAAACTAAG CCCATAGAGT CGAGAGCAAG TTGAAAGACT 60 CTCAAGAATT TCAATTTTCG GAGCAGATTA TGTCTAAA 98
<210>2
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列 <400〉 2
GAAGGAGATA TACATCCC 18
<210>3
<211>864
<212>DNA
<213>嗜水氣單胞菌DN322 /^dropW/fl subsp. DN322)
<220>
<221>CDS
<400> 3
ATGTCAATTG CGGTGACGGG TGGTACTGGT CCACTCGGTG GGCTTGTGAT TCAACATTTG 60 CTCAAAAAAG TTCCCGCCAG TCAAATCATT GCCATCGTGC GTAATGTTGA AAAAGCCTCT 120 ACTCTTGCCG ATCAAGGCGT GGAAGTTCGC CATGGCGACT ATAATCAACC GGAATCTCTT 180 CAAAAGGCTT TTGCAGGTGT CTCCAAGCTG CTCTTTATCT CAGGTCCGCA TTATGATAAT 240 ACGCTTCTTA TCGTTCAACA TGCAAATGTC GTAAAAGCTG CCAGAGATGC GGGAGTCAAA 300 CATATTGCTT ACACAGGATA TGCCTTTGCT GAGGAATCAA TAATTCCCCT TGCACACGTA 360 CATTTAGCAA CGGAATATGC CATCCGTACG ACCAATATCC CGTATACTTT CCTGCGTAAT 420GCCTTATATA CGGACTTTTT TGTAAATGAG ATTGTTACGA ATGCGGGAAG CGGGATCGTT GCTGCCGCAA CGGTTCTTAC AGAGGAAGGG AATCAACCGT GGACCTTTGA TGAACTTGCC GTCGTGCATC AGCCTGTCTC ATTCGAAGAA CCTGAGCCGT TTGCTGAAAT TACGGCAGCG TCCAAAACAT CAGATGGTCT GCAAAAACTG GTAAAACAAG CCCTGAAAAT GTGA
GGGCTGCGCG CATCCATAGA GTCTGGAGCA 480 AATTCAGTAA CACGCAATGA ACTTGCTTTG 540 CATGAAAACA AAACGTATAA CCTTGTTTCC 600 CAAATTCTCT CCGAGGTTTC CGGCAAAAAA 660 GAGAAAAATT TCCTCGTAAA CGCTGGTGTC 720 ATCTATGACG CGATTTCCAA AGGAGAAGCG 780 ATCGGATCCT TGACCCCTCT GAAGGAAACC 840
86權利要求
1.一種無誘導高效蛋白表達體系，其特征在于所述的表達體系包括NAD(P)H脫氫酶基因啟動子和pMD 18-T simple克隆載體，在啟動子序列的3’端接有SD序列，SD序列后接有目的基因，由此構建的片段插入pMD 18-T simple克隆載體的T克隆位點中，構成環(huán)狀的表達質粒，所述的NAD(P)H脫氫酶基因啟動子的序列如SEQ1所示，所述的SD序列如SEQ2所示。
2. 根據(jù)權利要求l所述的表達體系，其特征在于在所述的目的基因后面接有強終止TGA。
3. 根據(jù)權利要求2所述的表達體系，其特征在于所述的目的基因為三苯基甲垸氧化酶基因 &威
4. 根據(jù)權利要求l所述的表達體系，其特征在于所述的目的基因為熒光蛋白EYFP基因。
5. —種如權利要求l所述表達體系的構建方法，其特征在于包括下列步驟a) 以希瓦氏菌S12基因組DNA為模板通過PCR方法擴增其NAD(P)H脫氫酶基因啟動子；b) 設計引物PCR擴增目的基因，在其5'端加入高效SD序列；c) 設計引物橋，將步驟a)得到的NAD(P)H脫氫酶基因啟動子與步驟b)得到的含有目的 基因的片段連接，連接產物與pMD 18-T simple載體重組，使連接產物插入pMD 18-T simple載體的T克隆位點，形成環(huán)狀質粒，即為無誘導高效蛋白表達體系。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種無誘導高效蛋白表達體系及其構建方法，旨在提供一種無需誘導，能在多種不同的宿主細菌中高效表達目的蛋白的表達體系。本發(fā)明所述的無誘導高效蛋白表達體系包括NAD(P)H脫氫酶基因啟動子和pMD 18-T simple克隆載體，在啟動子序列的3’端接有SD序列，SD序列后接有目的基因，由此構建的片段插入pMD 18-T simple克隆載體的T克隆位點中，形成環(huán)狀的表達質粒。本發(fā)明主要用于高效的表達目的蛋白。
文檔編號C12N15/74GK101538580SQ20091003743
公開日2009年9月23日 申請日期2009年2月26日 優(yōu)先權日2009年2月26日
發(fā)明者任隨周, 衛(wèi)晉波, 孫國萍 申請人:廣東省微生物研究所