I型干擾素在誘導(dǎo)atx蛋白表達(dá)中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種I型干擾素的新用途。該新用途為I型干擾素在如下任一中的應(yīng)用：a1)在免疫細(xì)胞中誘導(dǎo)ATX蛋白表達(dá)；a2)制備具有在免疫細(xì)胞中誘導(dǎo)ATX蛋白表達(dá)的功能的產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)證明，I型干擾素通過I型干擾素受體(IFNAR)激活JAK-STAT、PI3K-AKT和NF-κB等信號通路誘導(dǎo)免疫細(xì)胞中ATX的表達(dá)，這些通路的抑制劑及相關(guān)基因siRNA能抑制I型干擾素誘導(dǎo)的ATX表達(dá)；TLR激活可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞中ATX的表達(dá)，而且這種感染相關(guān)的ATX誘導(dǎo)表達(dá)是由I型干擾素介導(dǎo)的；與炎癥反應(yīng)和自身免疫相關(guān)的細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ能協(xié)同促進(jìn)免疫細(xì)胞中ATX的表達(dá)，這一過程同樣依賴于I型干擾素的產(chǎn)生和I型干擾素下游通路。本發(fā)明揭示了I型干擾素誘導(dǎo)免疫細(xì)胞中ATX表達(dá)的新功能，對I型干擾素的臨床應(yīng)用和ATX-LPA通路相關(guān)疾病的干預(yù)治療具有重要意義。
【專利說明】I型干擾素在誘導(dǎo)ATX蛋白表達(dá)中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種I型干擾素的新用途，特別涉及I型干擾素在 誘導(dǎo)ATX蛋白表達(dá)中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 早在1957年，Isaacs和Lindenmann發(fā)現(xiàn)了 I型干擾素。正是由于它能夠"干擾" 病毒的復(fù)制，由此命名為干擾素（interferon，IFN)。干擾素是一類廣泛表達(dá)的信號因子，具 有很強(qiáng)的抗病毒和生長抑制作用。這些因子是抵御病毒侵染的第一道防線，在對惡性細(xì)胞 的免疫監(jiān)視過程中發(fā)揮重要作用。干擾素可以分為兩種類型：1型干擾素和II型干擾素 。I 型干擾素包括13種干擾素-α和干擾素 -β ;11型干擾素即干擾素-Y。I型干擾素與位 于細(xì)胞膜上的I型干擾素受體（IFNAR)結(jié)合，從而激活相應(yīng)的信號通路，調(diào)控相關(guān)基因的表 達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)功能。這些信號通路包括JAK-STAT、p38MAPK、ERK、PI3K-AKT和NF- κ B等。
[0003] I型干擾素的表達(dá)主要受到模式識別受體的控制，這些受體可以識別外源微生 物保守的獨(dú)特的模式分子?？梢哉T導(dǎo)I型干擾素表達(dá)的模式識別受體可以分為兩類： Toll-Iike受體（TLR)和RIG-I-Iike解旋酶（RLHs)。RLHs廣泛表達(dá)在各類細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì) 中，可以識別侵染病毒產(chǎn)生的dsRNA。TLRs主要定位于細(xì)胞表面或者內(nèi)體中，可以識別細(xì) 菌、病毒等微生物的特定組分。當(dāng)細(xì)菌或病毒侵染機(jī)體時(shí)，被相應(yīng)的模式識別受體識別，從 而誘導(dǎo)I型干擾素的表達(dá)。I型干擾素參與許多TLR相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控，并可以直接作用 于免疫細(xì)胞，在抗感染免疫中發(fā)揮重要的作用。
[0004] Autotaxin (ATX)是核苷酸焦憐酸酶/憐酸二酯酶（nucleotide pyrophosphatase, NPP)家族中的一員即NPP2,最早從人黑素瘤細(xì)胞A2058的條件培養(yǎng)基中 分離獲得，是一個(gè)分泌型糖蛋白。它具有IysoPLD活性，其主要生理功能是催化溶血磷脂膽 堿（LPC)水解生成溶血磷脂酸（LPA)。LPA通過細(xì)胞表面的受體發(fā)揮生物學(xué)功能，可以促進(jìn) 細(xì)胞的存活、增殖和遷移。人們發(fā)現(xiàn)在生理狀況下，ATX是在血管發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育所 必須的。在疾病狀態(tài)下，ATX是惡性腫瘤中表達(dá)發(fā)生最顯著上調(diào)的40個(gè)基因之一；ATX/LPA 可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移，被認(rèn)為是腫瘤治療的重要靶點(diǎn)之一。ATX-LPA通路與多種炎癥相 關(guān)疾病有關(guān)。在微生物重復(fù)侵染的狀態(tài)下，急性炎癥轉(zhuǎn)變成慢性炎癥，ATX-LPA通路促使更 多細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并聚集到組織微環(huán)境中，從而加劇病情，抑制ATX的活性則可以使癥狀 減輕。這種現(xiàn)象在多種慢性炎癥相關(guān)疾病小鼠模型的研究中得到證實(shí)，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、哮 喘、多發(fā)性硬化癥等免疫相關(guān)疾病。但是免疫反應(yīng)過程中ATX表達(dá)調(diào)控的機(jī)制目前還不清 楚。因此，認(rèn)識ATX在炎癥中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制顯得極為迫切，具有較高臨床應(yīng)用價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種I型干擾素的新用途。
[0006] 本發(fā)明所提供的I型干擾素的新用途具體為I型干擾素在如下任一中的應(yīng)用：
[0007] (al)在免疫細(xì)胞中誘導(dǎo)ATX蛋白（或ATX基因）表達(dá)；
[0008] (a2)制備具有在免疫細(xì)胞中誘導(dǎo)ATX蛋白（或ATX基因）表達(dá)的功能的產(chǎn)品。
[0009] 能夠促進(jìn)I型干擾素表達(dá)和/或增強(qiáng)I型干擾素作用的物質(zhì)在如下任一中的應(yīng)用 也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0010] (bl)在免疫細(xì)胞中誘導(dǎo)ATX蛋白（或ATX基因）表達(dá)；
[0011] (b2)制備具有在免疫細(xì)胞中誘導(dǎo)ATX蛋白（或ATX基因）表達(dá)的功能的產(chǎn)品。
[0012] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種具有在免疫細(xì)胞中誘導(dǎo)ATX蛋白（或ATX基因） 表達(dá)的功能的廣品。
[0013] 本發(fā)明所提供的具有在免疫細(xì)胞中誘導(dǎo)ATX蛋白（或ATX基因）表達(dá)的功能的產(chǎn) 品，其活性成分為I型干擾素或能夠促進(jìn)I型干擾素表達(dá)和/或增強(qiáng)I型干擾素作用的物 質(zhì)。
[0014] 在本發(fā)明中，所述能夠促進(jìn)I型干擾素表達(dá)和/或增強(qiáng)I型干擾素作用的物質(zhì)具 體為如下中任一種：
[0015] (I)Toll-Iike 受體的配體；
[0016] (2)腫瘤壞死因子α和干擾素 γ混合物。
[0017] 在（1)中，所述Toll-Iike受體的配體具體可為TLR4配體、TLR3配體或TLR9配 體；所述TLR4配體具體可為細(xì)菌脂多糖（LPS)(如Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號 為L2880);所述TLR3配體具體可為poly (I: C)(如Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄 號為P9582);所述TLR9配體具體可為CpG寡核苷酸（如InvivoGen公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄 號為 tlrl-2216)。
[0018] 在⑵中，所述腫瘤壞死因子α (如peprotech公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為 300-01A)和干擾素 γ (如p印rotech公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為300-02)混合物中，所述腫 瘤壞死因子α和所述干擾素 Y的質(zhì)量配比為1:1。相應(yīng)的，在所述腫瘤壞死因子α和干 擾素 Y混合物的工作液中，所述腫瘤壞死因子α和所述干擾素 Υ的質(zhì)量濃度配比為1:1， 兩者的工作濃度均為50ng/ml。
[0019] I型干擾素信號通路抑制劑或抑制I型干擾素產(chǎn)生的物質(zhì)在如下任一中的應(yīng)用也 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0020] (Cl)在免疫細(xì)胞中抑制ATX蛋白（或ATX基因）表達(dá)；
[0021] (c2)制備具有在免疫細(xì)胞中抑制ATX蛋白（或ATX基因）表達(dá)的功能的產(chǎn)品。
[0022] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種具有在免疫細(xì)胞中抑制ATX蛋白（或ATX基因） 表達(dá)的功能的廣品。
[0023] 本發(fā)明所提供的具有在免疫細(xì)胞中抑制ATX蛋白（或ATX基因）表達(dá)的功能的產(chǎn) 品，其活性成分為I型干擾素信號通路抑制劑或能夠抑制I型干擾素產(chǎn)生的物質(zhì)。
[0024] 在本發(fā)明中，所述I型干擾素信號通路抑制劑具體為如下（a)-(c)中的任一種：所 述抑制I型干擾素產(chǎn)生的物質(zhì)具體為如下（d):
[0025] (a) JAK-STAT信號通路抑制劑、PI3K-AKT信號通路抑制劑或NF- κ B信號通路抑制 劑；
[0026] (b) siSTATl、siSTAT3、siAKT、siJAKl、siTYK2 或 siIFNARl ;
[0027] 所述siSTATl為序列表中序列I所示的雙鏈RNA分子；所述siSTAT3為序列表中 序列2所示的雙鏈RNA分子（核酸分子）；所述SiAKT為序列表中序列3所示的雙鏈RNA分 子（核酸分子）；所述siJAKl為序列表中序列4所不的雙鏈RNA分子（核酸分子）；所述 siTYK2為序列表中序列5所示的雙鏈RNA分子（核酸分子）；所述SiIFNARl為序列表中序 列6所不的雙鏈RNA分子（核酸分子）；
[0028] (c) IFN- α中和性抗體（如P印r〇tech公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為500-P32AG)或 IFN-β的中和性抗體（如P印rotech公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為500-P32B);
[0029] (d)siIRF3 或 siIRF7 ;
[0030] 所述siIRF3為序列表中序列7所示的雙鏈RNA分子（核酸分子）；所述siIRF7為 序列表中序列8所不的雙鏈RNA分子（核酸分子）。
[0031] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，上述（a)中，所述JAK-STAT信號通路抑制劑具體為 Pyridone6(如Calbiochem公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為420099);所述PI3K-AKT信號通 路抑制劑具體為LY294002(如Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為L9908);所述 NF-κ B信號通路抑制劑具體為BAY-11-7082(如Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為 B5556)〇
[0032] 在本發(fā)明中，所述I型干擾素具體可為IFN-α (如P印rotech公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目 錄號為300-02AA)或IFN-β (如P印rotech公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為300-02BC)。
[0033] 在本發(fā)明中，所述ATX蛋白的氨基酸序列為序列表中序列9所示，所述ATX蛋白的 編碼基因具體為序列表中序列10。
[0034] 在本發(fā)明中，所述免疫細(xì)胞具體可為如下中的任一種：THP-1細(xì)胞、外周血單個(gè)核 細(xì)胞（PBMC)、單核細(xì)胞（monocyte)、非單核細(xì)胞（Non-monocyte)或單核細(xì)胞來源的樹突狀 細(xì)胞（monocyte derived dendritic cell,moDC)〇
[0035] 實(shí)驗(yàn)證明，1型干擾素（正^〇和正^3)可以通過從1(-5了41\?131(-41(1'和嚦-1^ 通路誘導(dǎo)免疫細(xì)胞中ATX的表達(dá)。這些通路的抑制劑以及相關(guān)基因 siRNA能夠抑制I型干 擾素誘導(dǎo)的ATX表達(dá)。同時(shí)，本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)感染免疫中TLR的激活可以誘導(dǎo)ATX 的表達(dá),而且這種感染相關(guān)的ATX誘導(dǎo)表達(dá)是由I型干擾素介導(dǎo)的。IFN-β的中和性抗體、 IFNARl的siRNA以及IFN-β信號通路的抑制劑均能夠抑制TLR4配體細(xì)菌脂多糖（LPS)、 TLR9配體CpG寡核苷酸以及TLR3配體poly (I:C)誘導(dǎo)的ATX表達(dá)。此外，與炎癥反應(yīng)和自 身免疫相關(guān)的細(xì)胞因子TNF-α和IFN-Y能夠協(xié)同促進(jìn)ATX的表達(dá)，這一過程同樣依賴于 I型干擾素的產(chǎn)生和I型干擾素下游通路。這些發(fā)現(xiàn)不僅揭示了 I型干擾素誘導(dǎo)免疫細(xì)胞 中ATX表達(dá)的新功能，而且闡釋了免疫反應(yīng)過程中ATX表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，對I型干擾素的臨 床應(yīng)用和ATX-LPA通路相關(guān)疾病的干預(yù)治療具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036] 圖1為I型干擾素誘導(dǎo)免疫細(xì)胞中ATX表達(dá)。A :THP-1人單核細(xì)胞；B :PBMC、 monocyte以及Non-monocyte ;C :人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)、T細(xì)胞系Jurkat、以及幾種腫 瘤細(xì)胞系（冊1(293、51480、4549和]\〇 7-7)。圖中，#表示在？〈0.01水平上差異顯著。
[0037] 圖2為PI3K抑制劑LY、JAK抑制劑P6、NF- κ B抑制劑BAY能夠抑制I型干擾素誘 導(dǎo)的ATX的表達(dá)。A :THP-1細(xì)胞；B :PBMC ;C :單核細(xì)胞。圖中，林表示在P〈0. 01水平上差 異顯著。
[0038] 圖3為siAKT、siJAK、siTYK2、siSTATl和siSTAT3都可以抑制I型干擾素誘導(dǎo)的 ATX 的表達(dá)。A :siAKT ;B :siJAK 和 siTYK2 ;C :siSTATl 和 siSTAT3。圖中，** 表示在 Ρ〈0· Ol 水平上差異顯著。
[0039] 圖4為TLR的激活導(dǎo)致ATX的表達(dá)上調(diào)。A :ΤΗΡ-1細(xì)胞；B :moDC細(xì)胞。圖中，** 表不在P〈〇. 01水平上差異顯者。
[0040] 圖 5 為 siIRF3 或者 siIRF7 抑制 TLR 介導(dǎo) ATX 的表達(dá)。A :siIRF3/poly(I:C) ;B : siIRF3/LPS ;C :siIRF7/CpG。圖中，#表示在P〈0. 01水平上差異顯著。
[0041] 圖6為LPS、CpG和poly (I:C)誘導(dǎo)I型干擾素的表達(dá)。
[0042] 圖7為IFN- α和IFN- β特異性中和性抗體對TLR介導(dǎo)的THP-I細(xì)胞中ATX表達(dá) 的影響。A:poly(I:C) ;B:LPS;C:CpG。圖中，#表示在P〈0. 01水平上差異顯著。
[0043] 圖8為IFN- α和IFN- β特異性中和性抗體對TLR介導(dǎo)的moDC細(xì)胞中ATX表達(dá) 的影響。A:poly(I:C) ;B:LPS。圖中，*表示在P〈0. 05水平上差異顯著，#表示在P〈0. 01 水平上差異顯著。
[0044] 圖9為SiIFNARl抑制TLR介導(dǎo)ATX的表達(dá)。
[0045] 圖10為腫瘤壞死因子-a (TNF-α )和干擾素 -Y (IFN-Y )協(xié)同促進(jìn)ATX表達(dá)。圖 中，表示在Ρ〈〇· 01水平上差異顯著。
[0046] 圖11為TNF- α和IFN- Y上調(diào)ATX的表達(dá)依賴于I型干擾素 。A :TNF_ α對THP-I 細(xì)胞中IFN-β的表達(dá)具有促進(jìn)作用；B :當(dāng)IFN-β特異的中和性抗體存在時(shí)，TNF-α和 IFN-γ協(xié)同上調(diào)ATX表達(dá)的作用被顯著抑制；C :通過轉(zhuǎn)入SiIFNARl敲低細(xì)胞中IFNARl的 表達(dá)，阻斷I型干擾素的信號通路，能夠抑制TNF- a和IFN- γ上調(diào)ATX表達(dá)的作用。圖中， **表示在Ρ〈〇· 01水平上差異顯著。

【具體實(shí)施方式】
[0047] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0048] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0049] THP-I人單核細(xì)胞：購自ATCC公司，目錄號：TIB-202。用含有10% (體積分?jǐn)?shù)） 的胎牛血清（Hyclone)的RPMI-1640 (Gibco)培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入2mM L-谷氨酰胺 (Gibco)，100 μ g/ml 鏈霉素（Gibco)和 100U/ml 青霉素（Gibco)。
[0050] 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC):購自sciencell公司，目錄號：8000。T細(xì)胞系 Jurkat :購自ATCC公司，目錄號：TIB-152。腫瘤細(xì)胞系HEK293、SW480、A549和MCF-7,均購 自 ATCC 公司，目錄號分別為：〇^-1573、0(^-228、0(^-185和!^8-22。
[0051] Trizol :Invitrogen 公司；M-MLV :Promega 公司；RNAse 抑制劑：Promega 公司； BCA蛋白定量試劑盒：Thermo公司；iQ SYBR :Green supermix Bio-Rad公司；轉(zhuǎn)染試 劑 lipofectamine2000 :Invitrogen 公司；BSA :Amresco 公司；LPS :Sigma_Aldrich 公司 (產(chǎn)品目錄號為 L2880) ;CpG =InvivoGen 公司（產(chǎn)品目錄號為 tlrl-2216) ;poly(I:C): Sigma-Aldrich 公司（產(chǎn)品目錄號為 P9582) ; JAKs 抑制劑 Pyridone6 (P6) :Calbiochem 公司（產(chǎn)品目錄號為420099) ;PI3K抑制劑LY294002:Sigma-Aldrich公司（產(chǎn)品目錄 號為 L9908) ;NF-kB 抑制劑 BAY-ll-7082:Sigma-Aldrich 公司（產(chǎn)品目錄號為 B5556); 干擾素 -β (IFN- β )中和性抗體：P印rotech公司（產(chǎn)品目錄號為500-P32B);干擾 素 -α (IFN-α)中和性抗體：Peprotech公司（產(chǎn)品目錄號為500-P32AG) ;ECL發(fā)光顯色試 劑盒：Millipore 公司；Human IFN-α :Peprotech 公司（產(chǎn)品目錄號為 300-02AA) ;Human IFN-β :P印rotech 公司（產(chǎn)品目錄號為 300-02BC) ;Human IL4 :P印rotech 公司 200-04 ; Human GM-CSF :P 印 rotech 公司 300-03 ;TNF-a :p 印 rotech 公司（產(chǎn)品目錄號為 300-01A); IFN-Y :p印rotech公司（產(chǎn)品目錄號為300-02)。
[0052] 實(shí)施例1、I型干擾素可以誘導(dǎo)免疫細(xì)胞中ATX的表達(dá)
[0053] -、I型干擾素在THP-I人單核細(xì)胞中對ATX表達(dá)的誘導(dǎo)作用
[0054] 用I型干擾素 IFN-a和IFN-β分別處理THP-I人單核細(xì)胞，通過實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn) 錄PCR (qRT-PCR)和western blot分別檢測ATX mRNA和蛋白的表達(dá)水平。具體如下：
[0055] 1、用I型干擾素 IFN- a和IFN- β分別處理THP-I人單核細(xì)胞
[0056] 分別將IFN-a (或IFN-β)加入培養(yǎng)有THP-I人單核細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中，使 IFN-a的終濃度為50ng/ml (使IFN-β的終濃度為10ng/ml)。處理時(shí)間設(shè)置三個(gè)時(shí)間梯 度：0h、2h 和 4h。
[0057] 2、實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)檢測
[0058] A. RNA 提取
[0059] (1)收集細(xì)胞樣品，用PBS溶液洗滌2遍，然后離心去上清。
[0060] (2)在沉淀中加入Iml的Trizol溶液，吹打混勻，室溫靜置5分鐘。
[0061] (3)加入氯仿（每Iml trizol加0· 2ml的氯仿），蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩15 秒。
[0062] (4)室溫靜置5分鐘，12000g4°C離心15分鐘。
[0063] (5)將上層水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入0. 5ml異丙醇，混勻后放置10分鐘。
[0064] (6) 12000g，4°C離心 10 分鐘，棄上清。
[0065] (7)加入Iml的75% (體積分?jǐn)?shù)）乙醇洗滌一次，7500g4°C離心5分鐘，棄上清， 沉淀烘干10分鐘。
[0066] (8)加入20 μ I DEPC水溶解沉淀，放置于60°C水浴鍋溶解10分鐘。
[0067] (9)通過分光光度計(jì)測量RNA濃度，將制備好的樣品凍于-80°C冰箱儲(chǔ)存。
[0068] B. qRT-PCR
[0069] (1)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA
[0070] 取2μ g RNA，加入2μ I cKT)引物，70°C 10分鐘，立即放在冰上冷卻。按照 以下體系進(jìn)行混合：加入 M-MLV5X 緩沖液 5μ 1，dNTPslOmMl μ 1，RNasinRibonuclease inhibitorO. 5 μ 1，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μ 1，補(bǔ)入DEPC水至終體積25 μ 1，將混合溶液放于 42°C水浴中反應(yīng)1小時(shí)，72°C滅活10分鐘，凍存于_20°C冰箱儲(chǔ)存。
[0071] (2)熒光定量PCR檢測
[0072] 根據(jù) IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad)的操作手冊，利用 Bio-Rad 的 iCycleiQ real-time PCR儀器對目的基因 ATX進(jìn)行檢測，結(jié)果通過Bio-Rad iQ5分析軟件進(jìn)行檢測。 以GAPDH基因作為內(nèi)參。
[0073] 擴(kuò)增ATX基因的引物對如下：
[0074] ATX-F :5' -GACTATGACTATGATGGCTTAC-3' ；
[0075] ATX-R : 5，-GATGATGCTGTAGTAGTGAGT-3，。
[0076] 擴(kuò)增GAPDH基因的引物對如下：
[0077] GAPDH-F :5，-TTAGCACCCCTGTCCAAGG-3,；
[0078] GAPDH-R : 5，-CCTACTCCTTGGAGGCCATG-3，。
[0079] 反應(yīng)體系：2XRealqPCR MasterMix(Modified DNA polymerase、SYBR Green I、 Optimized PCR buffer、5mM MgCI2、dNTP mix including dUTP) 25 μ I ;上游引物Fly 1，下 游引物虹41郵嫩模板2111。
[0080] 定量？〇?儀擴(kuò)增反應(yīng)條件設(shè)置：501：2111丨11;951：10111丨11;951：158--601：608(40個(gè) 循環(huán)）；溶解曲線生成的反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C 15s，60°C 15s，95°C 15s。
[0081] 數(shù)據(jù)處理：用IQ5軟件獲得數(shù)據(jù)，用EXCEL軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。通過T-Test 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析。
[0082] 3、western blot 檢測
[0083] Α·蛋白提取
[0084] (1)收集細(xì)胞，1500rpm離心5分鐘，棄除上清，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞沉淀兩次；
[0085] (2)吸干殘余的PBS，加入適量的細(xì)胞裂解液RIPA，吹打混勻，冰浴裂解30分鐘；
[0086] (3) 12000rpm4°C離心20分鐘，取上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中；
[0087] B. BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度
[0088] (1)將溶液A和溶液B根據(jù)體積比50 :1配置成BCA工作液，充分混勻；
[0089] (2)將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品等比稀釋至不同的濃度梯度
[0090] (3)在200 μ I BCA工作液中加入20 μ 1測量樣品，充分混勻，37°C反應(yīng)30分鐘；
[0091] (4)用分光光度計(jì)選用BCA測量模式進(jìn)行測量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0092] C. Western 蛋白印跡
[0093] 1)電泳
[0094] 配置SDS-PAGE蛋白膠，取40 μ g樣品蛋白加入上樣緩沖液中，沸水浴5分鐘， 12000rpm離心2分鐘，冷卻后離心取上清上樣。先用80V恒壓電泳，等溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后 換成120V電壓進(jìn)行電泳。
[0095] 2)全濕法轉(zhuǎn)膜
[0096] 將PVDF膜用甲醇活化15秒，然后放入蒸餾水中浸泡5分鐘，再放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中 浸泡15分鐘。按照Bio-Rad濕轉(zhuǎn)儀方法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，100V60分鐘。
[0097] 3)孵育抗體及顯色
[0098] (1)取出PVDF膜，用TBST洗滌一次，放入封閉液（5% (5g/100ml)BSA)中室溫孵 育1小時(shí)；
[0099] (2)用TBST洗漆3次，每次5分鐘，放入一抗（anti-human ATX，采用序列9所示 的ATX蛋白作為免疫原免疫兔子獲得的多克隆抗體）稀釋液中室溫孵育1小時(shí)；
[0100] (3)用TBST洗滌3次，每次5分鐘，放入二抗（羊抗兔IgG抗體，購自自北京中杉 金橋生物技術(shù)有限公司，目錄號：ZDR-5306)稀釋液中室溫孵育30分鐘；
[0101] ⑷取出膜，用TBST洗滌3次，ECL發(fā)光顯色。
[0102] 4、結(jié)果
[0103] 結(jié)果顯示，IFN-α和IFN-β均可以誘導(dǎo)THP-I人單核細(xì)胞中ATX的表達(dá)（圖1中 Α)。
[0104] 二、I型干擾素在人外周血免疫細(xì)胞中對ATX表達(dá)的誘導(dǎo)作用
[0105] 從人外周血中分離獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)，然后從PBMC中分離單核細(xì)胞 (monocyte)和非單核細(xì)胞（Non-monocyte)。分別用IFN-α和IFN-β處理上述三種細(xì)胞， 通過qRT-PCR檢測ATX mRNA的表達(dá)。具體如下：
[0106] 1、三種細(xì)胞的分離
[0107] 采新鮮抗凝健康人外周血，肝素抗凝后，用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單 個(gè)核細(xì)胞（PBMC)。
[0108] 將單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)培養(yǎng)于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中，貼壁3小時(shí)后，把上清移出 到另一塑料培養(yǎng)瓶中，以37°C預(yù)溫的RPMI1640培養(yǎng)基輕洗去除非貼壁的細(xì)胞并倒入培養(yǎng) 瓶中，貼壁細(xì)胞即為單核細(xì)胞（monocyte)，非貼壁細(xì)胞即為非單核細(xì)胞（Non-monocyte)。
[0109] 2、用IFN-α和IFN-β分別處理上述三種細(xì)胞
[0110] 待處理細(xì)胞：步驟1分離得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)、單核細(xì)胞（monocyte) 和非單核細(xì)胞（Non-monocyte)。
[0111] 將IFN-α (或IFN-β )加入培養(yǎng)有待處理細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中，使IFN-α的終濃 度為50ng/ml (使IFN-β的終濃度為10ng/ml)。IFN-a的處理時(shí)間為2小時(shí)，IFN-β的 處理時(shí)間為4小時(shí)。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置了未經(jīng)I型干擾素處理的陰性對照。
[0112] 3、qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達(dá)
[0113] 參見步驟一 2進(jìn)行。
[0114] 4、結(jié)果
[0115] 結(jié)果顯不，IFN-a 和 IFN-β 均可以誘導(dǎo) PBMC、monocyte 以及 Non-monocyte 中 ATX的表達(dá)（圖1中B)。
[0116] 三、I型干擾素在其他細(xì)胞中對ATX表達(dá)的誘導(dǎo)作用
[0117] 本發(fā)明的發(fā)明人還用I型干擾素處理了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)、T細(xì)胞系 Jurka，以及幾種腫瘤細(xì)胞系（HEK293、SW480、A549 和 MCF-7)，通過 qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達(dá)。具體的處理方法參見步驟二2進(jìn)行。qRT-PCR檢測ATX mRNA的表達(dá)參見步驟二3 進(jìn)行。
[0118] 結(jié)果顯示，I型干擾素并不能夠誘導(dǎo)這些細(xì)胞中ATX的表達(dá)（圖1中C)。
[0119] 上述結(jié)果表明，I型干擾素可以誘導(dǎo)免疫細(xì)胞中ATX的表達(dá)，而這種作用具有較強(qiáng) 的細(xì)胞特異性。
[0120] 實(shí)施例2、阻斷JAK-STAT、PI3K-AKT、NF- κ B通路可以抑制I型干擾素誘導(dǎo)ATX的 表達(dá)
[0121] 一、三個(gè)信號通路抑制劑P6、LY和BAY的作用
[0122] I型干擾素通過與細(xì)胞表面的I型干擾素受體（IFNAR)相結(jié)合，進(jìn)而激活 JAK-STAT、PI3K-AKT、NF- κ B等通路。本發(fā)明的發(fā)明人通過qRT-PCR檢測了相關(guān)通路的抑 制劑對IFN-α和IFN-β誘導(dǎo)ATX的表達(dá)影響。具體操作如下：
[0123] 待處理細(xì)胞：THP-I人單核細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)和單核細(xì)胞 (monocyte)〇
[0124] 供試信號通路抑制劑JAK-STAT信號通路的抑制劑Pyridone6 (P6)、PI3K-AKT信 號通路的抑制劑LY294002 (LY)以及NF- κ B信號通路的抑制劑BAY-11-7082 (BAY)。
[0125] 向培養(yǎng)有待處理細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入供試信號通路抑制劑，使供試信號通路 抑制劑的終濃度均為10μM;半小時(shí)后，再向其中加入IFN-α(或IFN-β)，使IFN-α的終 濃度為50ng/ml (使IFN- β的終濃度為lOng/ml)。IFN- a的處理時(shí)間為2小時(shí)，IFN- β的 處理時(shí)間為4小時(shí)。
[0126] 通過qRT-PCR檢測ATX mRNA表達(dá)水平（參見實(shí)施例1步驟二3進(jìn)行）。
[0127] 結(jié)果表明，JAK-STAT信號通路的抑制劑Pyridone6 (P6)、PI3K-AKT信號通路的抑 制劑LY294002 (LY)以及NF- κ B信號通路的抑制劑BAY-11-7082 (BAY)都能顯著抑制I型 干擾素誘導(dǎo)的ATX表達(dá)（圖2)。
[0128] 二、siAKT、siJAKl、siTYK2、siSTATl 和 siSTAT3 的作用
[0129] 本發(fā)明的發(fā)明人還通過RNAi技術(shù)敲低相關(guān)信號通路中重要組分，進(jìn)一步驗(yàn)證這 些通路在IFN-a和IFN-β誘導(dǎo)ATX表達(dá)中的作用。具體如下：
[0130] UsiRNA 的合成
[0131] SiRNA(雙鏈）由上海吉馬公司按照表格中序列進(jìn)行合成。
[0132] siSTATl :5, -GCUUCUUGGUCCUAACGCC-3'（序列 1);
[0133] siSTAT3 :5, -CCACUUUGGUGUUUCAUAA-3'（序列 2);
[0134] siAKT :5' -GCUGGAGAACCUCAUGCUG-3,（序列 3);
[0135] siJAKl :5' -GACAUGAUAUUGAGAACGA-3,（序列 4);
[0136] siTYK2 :5, -GCAUCCACAUUGCACAUAA-3'（序列 5);
[0137] 陰性對照（NC) :5' -UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'。
[0138] 2、siRNA 轉(zhuǎn)染及 IFN- a 或 IFN- β 的處理
[0139] A. siRNA 轉(zhuǎn)染
[0140] 待轉(zhuǎn)染細(xì)胞為THP-I細(xì)胞。
[0141] (1)根據(jù)吉瑪公司說明書，將合成的siRNA加入150μ 1無 RNase水溶解至濃度 (20 μ Μ)，分裝凍存于-80°c。
[0142] (2)根據(jù)Lipofectamine2000說明書進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，具體步驟如下：轉(zhuǎn)染前 用2ml新鮮培養(yǎng)基重懸I. 5-2X IO5個(gè)細(xì)胞，加入到35mm培養(yǎng)皿中；用250 μ I Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋siRNA至終濃度為25ηΜ或50ηΜ ;同時(shí)用250 μ I Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋5 μ 1 Lipofectamine2000,輕輕混合，室溫放置5分鐘；將siRNA和Lipofectamine2000輕輕混 合，室溫放置20分鐘，然后加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，混勻。
[0143] B. IFN-α 或 IFN-β 的處理
[0144] 轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，向其中加入IFN-α (或IFN-β)，使IFN-α的終濃度為50ng/ ml (使IFN-β的終濃度為10ng/ml)。IFN-a的處理時(shí)間為2小時(shí)，IFN-β的處理時(shí)間為 4小時(shí)。
[0145] 3、qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達(dá)
[0146] 參照實(shí)施例1步驟一 2進(jìn)行。
[0147] 4、Western blot 檢測
[0148] 以β-actin作為內(nèi)參，檢測該內(nèi)參的一抗為anti-human β-actin (購自Santa Cruz Biotechnology公司，目錄號：sc-47778)，二抗為羊抗小鼠 IgG抗體（購自北京中杉 金橋生物技術(shù)有限公司，目錄號：ZDR-5307)。
[0149] 檢測 AKT 蛋白的一抗為 anti-human AKT (購自 Cell Signaling Technology 公司，目錄號：9272);檢測JAKl蛋白的一抗為anti-human JAKl (購自Santa Cruz Biotechnology 公司，目錄號：sc-7228);檢測 TYK2 蛋白的一抗為 anti-human TYK2 (購自 Santa Cruz Biotechnology 公司，目錄號：sc-169);檢測 STATl 蛋白的一抗為 anti-human STATl (購自 Cell Signaling Technology 公司，目錄號：9172s);檢測 STAT3 蛋白的一抗為 anti-human STAT3(購自 Santa Cruz Biotechnology 公司，目錄號：SC-482X);檢測各蛋白 所用的二抗根據(jù)一抗進(jìn)行選擇，為羊抗小鼠 IgG抗體（購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公 司，目錄號：ZDR-5307)或羊抗兔IgG抗體（購自自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，目錄 號：ZDR-5306)。
[0150] 具體操作參照實(shí)施例1步驟一 3進(jìn)行。
[0151] 結(jié)果顯示，siAKT、siJAKl、siTYK2、siSTATl 和 siSTAT3 都能夠抑制 IFN-α 和 IFN- β誘導(dǎo)的ATX表達(dá)（圖3)。
[0152] 上述結(jié)果表明，阻斷JAK-STAT、ΡΙ3Κ-ΑΚΤ、NF- κ B通路可以抑制I型干擾素誘導(dǎo) ATX的表達(dá)。
[0153] 實(shí)施例3、TLR的激活可以導(dǎo)致ATX的表達(dá)上調(diào)
[0154] 一、THP-I細(xì)胞中TLR配體對ATX表達(dá)的影響
[0155] Toll-like rec印tor (TLR)作為一類模式識別受體，是機(jī)體識別異物侵染的重要 感受器。本發(fā)明的發(fā)明人檢測了 TLR配體對ATX表達(dá)的影響。具體操作如下：
[0156] I、TLR配體處理THP-I細(xì)胞
[0157] 供試TLR配體有TLR4配體細(xì)菌脂多糖（LPS)、TLR3配體poly(I:C)和TLR9配體 CpG寡核苷酸。
[0158] (I)LPS 處理
[0159] 將LPS加入到培養(yǎng)有THP-I細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中，使其終濃度為0. 1 μ g/ml。處理 16小時(shí)。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置未經(jīng)處理的THP-I細(xì)胞作為對照。
[0160] (2) poly (I:C)和CpG寡核苷酸處理
[0161] A. poly (I: C)處理
[0162] 用250 μ I Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋poly (I:C)至終濃度為10 μ g/ml ;同時(shí)用250 μ 1 Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋5 μ I Lipofectamine2000,輕輕混合，室溫放置5分鐘；將poly (I: C) 和Lipofectamine2000輕輕混合，室溫放置20分鐘，然后加入到培養(yǎng)有THP-I細(xì)胞的細(xì)胞 培養(yǎng)基中，混勻。
[0163] B. CpG寡核苷酸處理
[0164] 用250 μ I Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋CpG至終濃度為1 μ M ;同時(shí)用250 μ I Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋5μ I Lipofectamine2000,輕輕混合，室溫放置5分鐘；將CpG寡核苷酸和 Lipofectamine2000輕輕混合，室溫放置20分鐘，然后加入到培養(yǎng)有THP-I細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng) 基中，混勾。
[0165] p〇ly(I:C)和CpG寡核苷酸的處理時(shí)間均為6小時(shí)。
[0166] 實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置未經(jīng)處理的THP-I細(xì)胞作為對照。
[0167] 2、qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達(dá)
[0168] 參照實(shí)施例1步驟一 2進(jìn)行。
[0169] 結(jié)果顯示，TLR4配體細(xì)菌脂多糖（LPS)、TLR3配體poly(I:C)和TLR9配體CpG寡 核苷酸都可以誘導(dǎo)THP-I細(xì)胞中ATX的表達(dá)（圖4中A)。
[0170] 二、單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞中TLR配體對ATX表達(dá)的影響
[0171] 1、單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞的獲得
[0172] 從人外周血中分離到單核細(xì)胞（具體分離方法參見前文），調(diào)整細(xì)胞濃度為 I X IO6 個(gè) /L，接種于 6 孔培養(yǎng)板，0· 002L/ 孔，加入 rhGM-CSF (50 μ g/L)、rhIL-4 (50 μ g/ L)，然后置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，第3天采取半量換液并補(bǔ)加細(xì)胞因子，繼續(xù)培養(yǎng) 至第6天，獲得成熟的樹突狀細(xì)胞，即為單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞（monocyte derived dendritic cell，moDC)。該 moDCs 中只表達(dá) TLR3 和 TLR4,不表達(dá) TLR9。
[0173] 2、1'1^配體處理111〇0(：細(xì)胞
[0174] 供試TLR配體有TLR4配體細(xì)菌脂多糖（LPS)和TLR3配體poly (I: C)。
[0175] (I)LPS 處理
[0176] 將LPS加入到培養(yǎng)有moDC細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中，使其終濃度為0. 1 μ g/ml。處理 16小時(shí)。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置未經(jīng)處理的moDC細(xì)胞作為對照。
[0177] (2) poly (I:C)處理
[0178] 用250 μ I Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋poly (I:C)至終濃度為10 μ g/ml ;同時(shí)用250 μ 1 Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋5 μ I Lipofectamine2000,輕輕混合，室溫放置5分鐘；將poly (I: C) 和Lipofectamine2000輕輕混合，室溫放置20分鐘，然后加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，混勻，處理 時(shí)間為6h。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置未經(jīng)處理的moDC細(xì)胞作為對照。
[0179] 3、qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達(dá)
[0180] 參照實(shí)施例1步驟一 2進(jìn)行。
[0181] 結(jié)果顯示，當(dāng)用LPS和poly (I :C)分別處理moDCs時(shí)，均可以顯著上調(diào)moDCs細(xì)胞 中ATX的表達(dá)（圖4中B)。
[0182] 上述結(jié)果表明，TLR3、TLR4和TLR9等TLR的激活可以誘導(dǎo)免疫細(xì)胞中ATX的表達(dá)。
[0183] 實(shí)施例4、TLR激活導(dǎo)致ATX表達(dá)上調(diào)依賴I型干擾素自分泌途徑
[0184] TLR的激活可以誘導(dǎo)I型干擾素的表達(dá)，其中TLR3和TLR4是通過IRF3介導(dǎo)的I 型干擾素的表達(dá)，而TLR9是通過IRF7介導(dǎo)I型干擾素的表達(dá)。
[0185] 一、siIRF3和siIRF7對TLR激活誘導(dǎo)ATX的表達(dá)影響
[0186] 本發(fā)明的發(fā)明人通過轉(zhuǎn)入siIRF3或siIRF7,分別敲低IRF3和IRF7的表達(dá)，研究 其對TLR激活誘導(dǎo)ATX的表達(dá)影響。具體操作如下：
[0187] UsiRNA 的合成
[0188] SiRNA(雙鏈）由上海吉馬公司按照表格中序列進(jìn)行合成。
[0189] siIRF3 :5，-ccacuuugguguuucauaa-3'（序列 7);
[0190] siIRF7 :5，-gccucuaugacgacaucga-3，（序列 8);
[0191] 陰性對照（NC) : 5 ' -UUCUCCGAACGUGUCACGU-3 '。
[0192] 2、siRNA 轉(zhuǎn)染
[0193] 待轉(zhuǎn)染細(xì)胞為THP-I細(xì)胞。參照實(shí)施例2步驟二2進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，再 參照實(shí)施例3步驟一 1用TLR4配體細(xì)菌脂多糖（LPS)、TLR3配體poly (I: C)或TLR9配體 CpG寡核苷酸處理THP-I細(xì)胞。
[0194] 3、qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達(dá)
[0195] 參照實(shí)施例2步驟二3進(jìn)行。
[0196] 4、Western blot 檢測
[0197] 以β-actin作為內(nèi)參，檢測該內(nèi)參的一抗為anti-human β-actin (購自Santa Cruz Biotechnology公司，目錄號：sc-47778)，二抗為羊抗小鼠 IgG抗體（購自北京中杉 金橋生物技術(shù)有限公司，目錄號：ZDR-5307)。
[0198] 檢測 IRF3 蛋白的一抗為 anti-human IRF3 (購自 Cell Signaling Technology 公司，目錄號：11904P);檢測 IRF7 蛋白的一抗為 anti-human IRF7 (購自 Cell Signaling Technology公司，目錄號：13014S);檢測各蛋白所用的二抗根據(jù)一抗進(jìn)行選擇，為羊抗小 鼠 IgG抗體（購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，目錄號：ZDR-5307)或羊抗兔IgG抗體 (購自自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，目錄號：ZDR-5306)。
[0199] 具體操作參照實(shí)施例1步驟一 3進(jìn)行。
[0200] 5、結(jié)果
[0201] 結(jié)果顯示，siIRF3可以抑制TLR4配體LPS和TLR3配體poly(I:C)處理THP-I細(xì) 胞時(shí)ATX的表達(dá)上調(diào)（圖5中A和B) ;siIRF7可以抑制TLR9配體CpG寡核苷酸處理THP-I 細(xì)胞時(shí)ATX的表達(dá)上調(diào)（圖5中C)。
[0202] 二、TLR配體誘導(dǎo)I型干擾素的表達(dá)
[0203] I、TLR配體處理THP-I細(xì)胞
[0204] 參照實(shí)施例3步驟一 1進(jìn)行。LPS的處理時(shí)間為2h，poly (I:C)和CpG寡核苷酸 的處理時(shí)間均為6h。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置未經(jīng)處理的THP-I細(xì)胞作為對照。
[0205] 2、qRT-PCR 檢測 IFN- α 和 IFN- β mRNA 的表達(dá)
[0206] 參照實(shí)施例1步驟一 2進(jìn)行。
[0207] 其中擴(kuò)增IFN-α基因的引物對如下：
[0208] IFN-α -F :5, -GATGGCCGTGCTGGTGCTCA-3,；
[0209] IFN- a -R : 5 ' -TGATTTCTGCTCTGACAACCTCCC-3 '。
[0210] 其中擴(kuò)增IFN-β基因的引物對如下：
[0211] IFN-β -F : 5 ' -AAACTCATGAGCAGTCTGCA-3 ' ；
[0212] IFN-β -R : 5，-AGGAGATCTTCAGTTTCGGAGG-3，。
[0213] 結(jié)果顯示：TLR4只可以介導(dǎo)IFN-β的表達(dá)，而不能介導(dǎo)IFN-a的表達(dá)；而TLR3 和TLR9既可以介導(dǎo)IFN-a的表達(dá)也可以介導(dǎo)IFN-β的表達(dá)（圖6)。
[0214] 三、IFN- a和IFN- β的中和性抗體對TLR介導(dǎo)的THP-I細(xì)胞中ATX表達(dá)的影響
[0215] 1、IFN-a或IFN-β的中和性抗體處理細(xì)胞
[0216] (DLPS/IFN-β中和性抗體處理
[0217] 向培養(yǎng)有THP-I細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入IFN-β中和性抗體，使其終濃度為 1 μ g/ml，30min后，再向其中加入LPS，使其終濃度為0. 1 μ g/ml，LPS處理16小時(shí)。實(shí)驗(yàn)同 時(shí)設(shè)置未經(jīng)處理的細(xì)胞以及經(jīng)IgG處理的細(xì)胞作為對照。
[0218] (2) poly (I:C)或CpG寡核苷酸/IFN-a或IFN-β中和性抗體處理
[0219] A. poly (I:C)/IFN-a 或 IFN-β 中和性抗體處理
[0220] 向培養(yǎng)有THP-I細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入IFN-a中和性抗體（或IFN-β中和 性抗體），使其終濃度為1以8/1111，3〇1^11后，用25(^1(^1-1^培養(yǎng)基稀釋？ 〇17(1:〇至 終濃度為1〇μ g/ml ;同時(shí)用250μ I Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋5μ I Lipofectamine2000,輕輕 混合，室溫放置5分鐘；將poly (I: C)和Lipofectamine2000輕輕混合，室溫放置20分鐘， 然后加入到培養(yǎng)有THP-I細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中，混勻。poly (I: C) /IFN- α中和性抗體（或 IFN-β中和性抗體）處理時(shí)間為6h。
[0221] B. CpG寡核苷酸/IFN- α或IFN- β中和性抗體處理
[0222] 向培養(yǎng)有THP-I細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入IFN- α中和性抗體（或IFN- β中和性 抗體），使其終濃度為1 μ g/ml，30min后，用250 μ I Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋CpG寡核苷酸至 終濃度為ΙμΜ;同時(shí)用250μ1 Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋5μ1 Lipofectamine2000,輕輕混合， 室溫放置5分鐘；將CpG寡核苷酸和Lipofectamine2000輕輕混合，室溫放置20分鐘，然后 加入到培養(yǎng)有THP-I細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中，混勻。CpG寡核苷酸/IFN-α中和性抗體（或 IFN-β中和性抗體）處理時(shí)間為6h。
[0223] 實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置未經(jīng)處理的細(xì)胞作為對照。
[0224] 2、qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達(dá)
[0225] 參照實(shí)施例1步驟一 2進(jìn)行。
[0226] 結(jié)果顯示，通過加入IFN-a或IFN-β的中和性抗體阻斷相應(yīng)I型干擾素的作用， 發(fā)現(xiàn)IFN-β的中和性抗體在THP-I細(xì)胞中能夠抑制TLR3、4、9活化導(dǎo)致的ATX表達(dá)上調(diào)， 而IFN-a的中和性抗體則沒有顯著的效果（圖7)。
[0227] 四、IFN- a和IFN- β中和性抗體對TLR介導(dǎo)的moDC細(xì)胞中ATX表達(dá)的影響
[0228] 1、IFN-a或IFN-β的中和性抗體處理細(xì)胞
[0229] (DLPS/IFN-β中和性抗體處理
[0230] 向培養(yǎng)有moDC細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入IFN-β中和性抗體，使其終濃度為Iyg/ ml，30min后，再向其中加入LPS，使其終濃度為0. lyg/ml，LPS處理16小時(shí)。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè) 置未經(jīng)處理的細(xì)胞以及經(jīng)IgG處理的細(xì)胞作為對照。
[0231] (2) poly (I:C)/IFN-a 或 IFN-β 中和性抗體處理
[0232] 向培養(yǎng)有moDC細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入IFN-a中和性抗體（或IFN-β中和性抗 體），使其終濃度為1 μ g/ml，30min后，用250 μ I Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋poly (I:C)至終濃 度為 1〇μ g/ml ;同時(shí)用 250μ I Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋 5μ I Lipofectamine2000,輕輕混合， 室溫放置5分鐘；將poly (I: C)和Lipofectamine2000輕輕混合，室溫放置20分鐘，然后加 入到培養(yǎng)有THP-I細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中，混勻。poly (I: C) /IFN- α中和性抗體（或IFN- β 中和性抗體）處理時(shí)間為6小時(shí)。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置未經(jīng)處理的moDC細(xì)胞作為對照。
[0233] 2、qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達(dá)
[0234] 參照實(shí)施例1步驟一 2進(jìn)行。
[0235] 結(jié)果顯示，通過加入IFN-α或IFN-β的中和性抗體阻斷相應(yīng)I型干擾素的作 用，發(fā)現(xiàn)在moDC細(xì)胞中IFN-β中和性抗體和IFN-a中和性抗體均能夠抑制TLR3配體 p〇ly(I:C)誘導(dǎo)ATX的表達(dá)，其中IFN-β中和性抗體的抑制作用更為顯著（圖8中A); IFN- β中和性抗體能夠抑制moDC細(xì)胞中TLR4配體LPS誘導(dǎo)ATX的表達(dá)（圖8中B)。
[0236] 五、SiIFNARl抑制TLR介導(dǎo)ATX的表達(dá)
[0237] I型干擾素通過結(jié)合位于細(xì)胞表面的I型干擾素受體（IFNAR)來發(fā)揮作用。IFNAR 由兩個(gè)亞基組成，即IFNARl和IFNAR2。本發(fā)明的發(fā)明人通過RNAi敲低細(xì)胞中IFNARl的表 達(dá)，研究其對TLR激活誘導(dǎo)ATX的表達(dá)影響。具體操作如下：
[0238] UsiRNA 的合成
[0239] SiRNA(雙鏈）由上海吉馬公司按照表格中序列進(jìn)行合成。
[0240] siIFNARl :5' -CUGGGAUGGAUAAUUGGAU-3'（序列 6)
[0241] 陰性對照（NC) :5' -UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'。
[0242] 2、siRNA 轉(zhuǎn)染
[0243] 待轉(zhuǎn)染細(xì)胞為THP-I細(xì)胞。參照實(shí)施例2步驟二2進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，再 參照實(shí)施例3步驟一 1用TLR4配體細(xì)菌脂多糖（LPS)、TLR3配體poly (I: C)或TLR9配體 CpG寡核苷酸處理THP-I細(xì)胞。
[0244] 參照實(shí)施例2步驟二2進(jìn)行。
[0245] 3、qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達(dá)
[0246] 參照實(shí)施例2步驟二3進(jìn)行。
[0247] 4、Western blot 檢測
[0248] 以β-actin作為內(nèi)參，檢測該內(nèi)參的一抗為anti-human β-actin (購自Santa Cruz Biotechnology公司，目錄號：sc-47778)，二抗為羊抗小鼠 IgG抗體（購自北京中杉 金橋生物技術(shù)有限公司，目錄號：ZDR-5307)。
[0249] 檢測 IFNARl 蛋白的一抗為 anti-human IFNARl (購自 Santa Cruz Biotechnology 公司，目錄號：sc-7391);二抗為羊抗小鼠 IgG抗體（購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公 司，目錄號：ZDR-5307)。
[0250] 具體操作參照實(shí)施例1步驟一 3進(jìn)行。
[0251] 5、結(jié)果
[0252] 結(jié)果顯示，siIFNARl能夠抑制LPS、poly (I:C)和CpG寡核苷酸處理時(shí)THP-I細(xì)胞 中ATX的表達(dá)上調(diào)（圖9)。
[0253] 上述結(jié)果表明，TLR配體誘導(dǎo)ATX表達(dá)上調(diào)依賴I型干擾素的產(chǎn)生，阻斷I型干擾 素產(chǎn)生的途徑或者阻斷I型干擾素發(fā)揮功能的信號通路都能夠抑制TLR激活導(dǎo)致的ATX表 達(dá)上調(diào)。
[0254] 實(shí)施例5、腫瘤壞死因子-a (TNF- α )和干擾素 -γ (IFN- Y )能夠協(xié)同上調(diào)ATX的 表達(dá)
[0255] 腫瘤壞死因子-a (TNF-α )和干擾素 -Y (IFN-Y )兩種細(xì)胞因子，參與多種生命 活動(dòng)，與自身免疫疾病密切相關(guān)。有多篇文章報(bào)道，ATX與自身免疫疾病相關(guān)。因此，本發(fā) 明的發(fā)明人分別用TNF-α和IFN-γ單獨(dú)或者組合處理THP-I細(xì)胞，檢測對ATX表達(dá)影響。 具體操作如下：
[0256] I、TNF- α 和 / 或 IFN- Y 處理 THP-I 細(xì)胞
[0257] 將TNF-α和/或IFN-Y分別單獨(dú)或者組合加入到THP-I細(xì)胞的培養(yǎng)基中，使 TNF-a的終濃度為50ng/ml，IFN-Y的終濃度也為50ng/ml。處理時(shí)間為16h。實(shí)驗(yàn)同時(shí) 設(shè)置未經(jīng)處理的細(xì)胞作為對照。
[0258] 2、qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達(dá)
[0259] 參照實(shí)施例1步驟一 2進(jìn)行。
[0260] 結(jié)果顯示，TNF-a和IFN-Y單獨(dú)處理對ATX表達(dá)的上調(diào)作用較小。而TNF-a和 IFN-γ共同處理是則能使ATX的表達(dá)顯著地升高（圖10)。
[0261] 上述結(jié)果說明，TNF- α和IFN- Y能夠協(xié)同誘導(dǎo)ATX的表達(dá)。
[0262] 實(shí)施例6、TNF- α和IFN- Y協(xié)同上調(diào)ATX表達(dá)依賴于I型干擾素的作用
[0263] 有報(bào)道表明，TNF- α能夠促進(jìn)I型干擾素的表達(dá)（主要是IFN- β )，而I型干擾素 和II型干擾素（IFN-Y)具有協(xié)同作用。
[0264] 一、TNF- α對I型干擾素的誘導(dǎo)作用
[0265] I、TNF- α 處理 THP-I 細(xì)胞
[0266] 將TNF- α加入到培養(yǎng)有THP-I細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中，使其終濃度為50ng/ml。處 理時(shí)間為2h。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置未經(jīng)處理的THP-I細(xì)胞作為對照。
[0267] 2、qRT-PCR 檢測 IFN- α 和 IFN- β mRNA 的表達(dá)
[0268] 參照實(shí)施例4步驟二2進(jìn)行。
[0269] 結(jié)果顯示，TNF-α對THP-I細(xì)胞中IFN-β的表達(dá)具有促進(jìn)作用（圖11中A)。
[0270] 二、IFN- β中和性抗體抑制TNF- α和IFNi協(xié)同上調(diào)ATX表達(dá)
[0271] 1、TNF-α和IFN-Y/IFN-β中和性抗體處理細(xì)胞
[0272] 向培養(yǎng)有THP-I細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入IFN-β中和性抗體，使其終濃度為 14 8/!111，3〇1^11后，將了嚦-〇和正^￥組合加入其中，使了嚦-〇的終濃度為5〇1^/1111， IFN-Y的終濃度也為50ng/ml。TNF-α和IFN-Y的處理時(shí)間為16h。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置未經(jīng) IFN-β中和性抗體處理的對照組，以及采用IgG替代IFN-β中和性抗體處理的對照組。
[0273] 2、qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達(dá)
[0274] 參照實(shí)施例1步驟一 2進(jìn)行。
[0275] 結(jié)果顯示，當(dāng)IFN-β特異的中和性抗體存在時(shí)，TNF-α和IFN-Y協(xié)同上調(diào)ATX表 達(dá)的作用被顯著抑制（圖11中Β)。
[0276] 三、siIFNARl抑制TNF- α和IFN- Y協(xié)同上調(diào)ATX表達(dá)
[0277] UsiRNA 的合成
[0278] 同實(shí)施例4步驟五1。
[0279] 2、siRNA 轉(zhuǎn)染
[0280] 待轉(zhuǎn)染細(xì)胞為THP-I細(xì)胞。參照實(shí)施例2步驟二2進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，再 將TNF-α和IFN-γ組合加入到其中，使TNF-α的終濃度為50ng/ml，IFN-Y的終濃度也 為50ng/ml。TNF-α和IFN-Y的處理時(shí)間為16h。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染的對照組。
[0281] 3、qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達(dá)
[0282] 參照實(shí)施例2步驟二3進(jìn)行。
[0283] 4、Western blot 檢測
[0284] 參照實(shí)施例4步驟五4進(jìn)行。
[0285] 5、結(jié)果
[0286] 結(jié)果顯示，通過轉(zhuǎn)入SiIFNARl敲低細(xì)胞中IFNARl的表達(dá)，阻斷I型干擾素的信號 通路，能夠抑制TNF- α和IFN- γ上調(diào)ATX表達(dá)的作用（圖11中C)。
[0287] 上述結(jié)果表明，阻斷I型干擾素的通路能夠抑制TNF- α和IFN- Y誘導(dǎo)的ATX表 達(dá)。
【權(quán)利要求】
1.1型干擾素在如下任一中的應(yīng)用： (al)在免疫細(xì)胞中誘導(dǎo)ATX蛋白表達(dá)； (a2)制備具有在免疫細(xì)胞中誘導(dǎo)ATX蛋白表達(dá)的功能的產(chǎn)品。
2. 能夠促進(jìn)I型干擾素表達(dá)和/或增強(qiáng)I型干擾素作用的物質(zhì)在如下任一中的應(yīng)用： (bl)在免疫細(xì)胞中誘導(dǎo)ATX蛋白表達(dá)； (b2)制備具有在免疫細(xì)胞中誘導(dǎo)ATX蛋白表達(dá)的功能的產(chǎn)品。
3. -種具有在免疫細(xì)胞中誘導(dǎo)ATX蛋白表達(dá)的功能的產(chǎn)品，其活性成分為I型干擾素 或能夠促進(jìn)I型干擾素表達(dá)和/或增強(qiáng)I型干擾素作用的物質(zhì)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用或權(quán)利要求3所述的產(chǎn)品，其特征在于：所述能夠促進(jìn)I 型干擾素表達(dá)和/或增強(qiáng)I型干擾素作用的物質(zhì)為如下中任一種： (1) Toll-Iike受體的配體； (2) 腫瘤壞死因子a和干擾素Y混合物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用或產(chǎn)品，其特征在于：所述Toll-Iike受體的配體為 TLR4配體、TLR3配體或TLR9配體； 所述TLR4配體具體為細(xì)菌脂多糖；所述TLR3配體具體為poly (I: C);所述TLR9配體 具體為CpG寡核苷酸。 6. I型干擾素信號通路抑制劑或抑制I型干擾素產(chǎn)生的物質(zhì)在如下任一中的應(yīng)用： (cl)在免疫細(xì)胞中抑制ATX蛋白表達(dá)； (c2)制備具有在免疫細(xì)胞中抑制ATX蛋白表達(dá)的功能的產(chǎn)品。
7. -種具有在免疫細(xì)胞中抑制ATX蛋白表達(dá)的功能的產(chǎn)品，其活性成分為I型干擾素 信號通路抑制劑或能夠抑制I型干擾素產(chǎn)生的物質(zhì)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用或權(quán)利要求7所述的產(chǎn)品，其特征在于：所述I型干擾素 信號通路抑制劑為如下（a)-(c)中的任一種：所述抑制I型干擾素產(chǎn)生的物質(zhì)為如下（d): (a) JAK-STAT信號通路抑制劑、PI3K-AKT信號通路抑制劑或NF- K B信號通路抑制劑； 所述JAK-STAT信號通路抑制劑具體為Pyridone6 ;所述PI3K-AKT信號通路抑制劑具 體為LY294002 ;所述NF- K B信號通路抑制劑具體為BAY-11-7082 ; (b) siSTATl、siSTAT3、siAKT、siJAKl、siTYK2 或 siIFNARl ; 所述siSTATl為序列表中序列I所示的雙鏈RNA分子；所述siSTAT3為序列表中序列 2所示的雙鏈RNA分子；所述siAKT為序列表中序列3所示的雙鏈RNA分子；所述SiJAKl 為序列表中序列4所示的雙鏈RNA分子；所述siTYK2為序列表中序列5所示的雙鏈RNA分 子；所述siIFNARl為序列表中序列6所示的雙鏈RNA分子； (c) IFN-a中和性抗體或IFN-P的中和性抗體； (d) siIRF3 或 siIRF7 ; 所述siIRF3為序列表中序列7所示的雙鏈RNA分子；所述siIRF7為序列表中序列8 所示的雙鏈RNA分子。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用或產(chǎn)品，其特征在于：所述I型干擾素為IFN-a或 IFN- 3 〇
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于：所述ATX蛋白的氨基酸 序列如序列表中序列9所示。
【文檔編號】C12N15/85GK104312973SQ201410528355
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月9日
【發(fā)明者】張俊杰, 宋建穩(wěn), 李頌 申請人:北京師范大學(xué)