專利名稱：一種重組蛋白聯(lián)合誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)變?yōu)楹瓜偌毎姆椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人汗腺再生研究領(lǐng)域。具體說來，本發(fā)明涉及一種重組蛋白聯(lián)合誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)分化獲得汗腺細胞的非轉(zhuǎn)基因方法。
背景技術(shù)：
皮膚被覆于身體表面，是人體最大的器官。排汗功能是其眾多功能之一，可排出機體25%的熱量以保持體溫的相對恒定。輕度燒傷時汗腺細胞可以其深部未受創(chuàng)的部分為模板而完全修復(fù)，但全層大面積燒傷患者因汗腺被毀或被瘢痕組織堵隔而喪失了分泌汗液的功能，這不僅給患者的生理與心理帶來嚴重障礙，而且對其后期的生活與工作質(zhì)量將產(chǎn)生嚴重影響。因此，研究皮膚損傷后汗腺組織的修復(fù)與再生，不僅是創(chuàng)(燒、戰(zhàn))傷治療本身的需要，而且也是重塑人體生理與心理的需要，值得人們關(guān)注。近年來，隨著干細胞生物學(xué)與再生醫(yī)學(xué)研究的深入，利用成體干細胞及其可塑性為皮膚附屬器的再生帶來了新的希望。就采用成體干細胞再生皮膚汗腺的策略而言，有以下幾個方面可以考慮一是利用自身皮膚表皮干細胞直接誘導(dǎo)分化為汗腺細胞來再生汗腺。但問題的關(guān)鍵是在大面積嚴重創(chuàng)傷燒傷時由于皮膚的損毀，自體表皮干細胞的來源缺乏，因而從誘導(dǎo)殘存的表皮干細胞來直接再生汗腺的技術(shù)和方法將來在臨床應(yīng)用會受到很大的限制。二是脂肪干細胞在一定條件下經(jīng)誘導(dǎo)也具有分化為表皮細胞，進而再經(jīng)誘導(dǎo)分化形成汗腺細胞的潛能。但由于這一條技術(shù)路線難度比較大，影響因素眾多，加之在大面積嚴重創(chuàng)傷燒傷時脂肪組織和皮膚組織一樣會受到嚴重的破壞，因而利用脂肪干細胞來重建汗腺也是一條艱難的途徑。為此，利用BM-MSCs來再生汗腺便成為一條重要的選擇。這條路線的主要優(yōu)點包括一是BM-MSCs本身具有低免疫源性和多向分化潛能；二是BM-MSCs 存在于骨髓基質(zhì)，在大面積創(chuàng)傷、燒傷時受到外界的直接破壞作用比較??；三是儲存量比較大，在嚴重創(chuàng)傷和燒傷條件下能夠發(fā)生動員，容易獲取?；谝陨显颍钊腴_展BM-MSCs 的分化調(diào)控研究對皮膚汗腺再生策略具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。我們和他人大量的前期研究已經(jīng)初步證明BM-MSCs直接參與了皮膚損傷修復(fù)與再生的全過程，其中包括皮膚組織損傷后，造血干細胞和間充質(zhì)干細胞從骨髓動員到循環(huán)細胞池，并遷移到損傷部位。在早期炎癥階段，這些細胞調(diào)節(jié)上皮細胞和真皮間充質(zhì)細胞的增殖和遷移，促進炎癥細胞趨化，參與創(chuàng)傷修復(fù)過程；炎癥消退后，骨髓來源的細胞可以分化為表皮細胞、皮脂腺細胞、毛囊上皮細胞、樹突狀細胞以及內(nèi)皮祖細胞等，并且可整合到愈合的皮膚，分化為CD45+的抗原呈遞纖維母細胞亞群；上皮化完成后，造血干細胞和BM-MSCs都能長期重構(gòu)愈合的真皮，產(chǎn)生I和III型膠原。在此基礎(chǔ)上，我們實驗室又進一步開展了 BM-MSCs向汗腺細胞誘導(dǎo)分化的研究，并在以下幾方面獲得了突破1)通過 BM-MSCs與熱休克汗腺直接共培養(yǎng)技術(shù)，已成功將BM-MSCs誘導(dǎo)成為汗腺細胞或汗腺細胞樣細胞，即經(jīng)直接共培養(yǎng)誘導(dǎo)來的汗腺細胞具有正常汗腺細胞的形態(tài)、表型和功能特性；2) 初步闡明在BM-MSCs轉(zhuǎn)分化為汗腺細胞的過程中涉及的信號通路主要有EDA/EDAR、NF- κ B和ERK的激活；幻將上述誘導(dǎo)來的汗腺細胞樣細胞移植于裸鼠創(chuàng)面后，能顯著促進受損汗腺的修復(fù)與再生，即創(chuàng)面愈合后能正常發(fā)汗，組織形態(tài)學(xué)觀察證實創(chuàng)傷處有汗腺組織的再生；4)進一步的人體種植試驗表明，在切除瘢痕的創(chuàng)面種植經(jīng)誘導(dǎo)后具有汗腺細胞表型的自體BM-MSCs，不僅可以使這些移植的細胞存活，而且這些細胞還能轉(zhuǎn)變?yōu)楹瓜俳M織并發(fā)揮排汗功能。形態(tài)學(xué)觀察顯示創(chuàng)部真皮淺層有大量CEA陽性細胞，結(jié)構(gòu)類似正常汗腺組織。同時功能學(xué)檢測也表明再生的汗腺組織所分泌的汗液具有與正常汗液類似的PH值、滲透壓和化學(xué)組分。上述初步的實驗結(jié)果證明1)非轉(zhuǎn)基因的方法是一種重要的獲得組織特異性干細胞的途徑；幻通過建立適當(dāng)?shù)腂M-MSCs體外誘導(dǎo)方法，可以成功實現(xiàn)干細胞的跨胚層轉(zhuǎn)化；幻從臨床應(yīng)用角度來講，非轉(zhuǎn)基因方法獲得的組織特異性干細胞應(yīng)該比轉(zhuǎn)基因方法獲得的干細胞更安全、更實用。目前，通過轉(zhuǎn)基因方法誘導(dǎo)干細胞或成體細胞轉(zhuǎn)分化或去分化形成某些組織特異性細胞已經(jīng)取得了可喜的結(jié)果，但是由于轉(zhuǎn)基因涉及的技術(shù)復(fù)雜、操作有一定難度、成功率較低以及外源性基因?qū)肟赡軒淼陌踩燥L(fēng)險等問題尚沒有解決，因此，從臨床應(yīng)用的角度來說，建立新一代的非轉(zhuǎn)基因或限制性(盡量少轉(zhuǎn)基因或不轉(zhuǎn)基因)轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)方法，將具有多向分化潛能的BM-MSCs轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床所需的組織特異性干細胞可能更具有重要和直接的臨床應(yīng)用價值和相對小的風(fēng)險代價。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明提供了一種重組蛋白聯(lián)合誘導(dǎo)BM-MSCs轉(zhuǎn)分化為汗腺細胞的非轉(zhuǎn)基因方法，包括以下步驟a)分離并培養(yǎng)BM-MSCs，用免疫細胞化學(xué)法鑒定其表面標(biāo)志性蛋白⑶44 ；b)分離并培養(yǎng)汗腺細胞，用免疫細胞化學(xué)法鑒定其表面標(biāo)志性蛋白CEA、CK7、CK8 知 CK19 ；c)使用重組蛋白EDA-Al和EGF配制的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)BM-MSCs向汗腺細胞的轉(zhuǎn)分化；優(yōu)選地，誘導(dǎo)時BM-MSCs的密度為0. 1-1 X 106/ml，更優(yōu)選0. 3X 106/ml。優(yōu)選地，誘導(dǎo)時EDA-Al蛋白的濃度0. 05-3. 00 μ g/ml，更優(yōu)選0. 25 μ g/ml。優(yōu)選地，誘導(dǎo)時EGF蛋白的濃度0. 10-1. 00 μ g/ml，更優(yōu)選0. 5 μ g/ml優(yōu)選地，上述重組蛋白的誘導(dǎo)時間為5-12天，更優(yōu)選7-9天。


圖1描述了免疫細胞化學(xué)法檢測BM-MSCs和汗腺細胞表面標(biāo)志性蛋白⑶44、CEA、 CK7、CK8 和 CK19 的表達。其中(A-E)為汗腺細胞(A :CD44 ；B =CEA ；C :CK7 ；D :CK8 ；E :CK19)； (F-J)為 BM-MSCs (F :CD44 ；G =CEA ；H :CK7 ；I :CK8 ;J :CK19) ；Bar = 100 μ m。圖2描述了 BM-MSCs轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)后細胞形態(tài)的改變。其中(A)為BM_MSCs誘導(dǎo)前的形態(tài)；(B)為MSCs誘導(dǎo)后8天的形態(tài)；Bar = 100 μ m。圖3描述了免疫熒光法檢測BM-MSCs轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)8天后細胞表型的改變。其中 (A-D)為誘導(dǎo)前(A =CEA ；B :CK7 ；C :CK8 ；D :CK19) ； (E-H)為誘導(dǎo)后(E =CEA ；F :CK7 ；G :CK8 ； H :CK19) ；Bar = 100 μ m。
圖4描述了 BM-MSCs轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)后對裸鼠腳掌受損傷汗腺再生的促進作用。其中 (A和B)為移植前BrdU檢測(A 誘導(dǎo)前；B 誘導(dǎo)后)；(C-H)為移植后細胞功能檢測(C 誘導(dǎo)前發(fā)汗實驗陰性；D 誘導(dǎo)后發(fā)汗實驗陽性；E 誘導(dǎo)前HE染色汗腺組織形態(tài)簡單；F 誘導(dǎo)后HE染色有發(fā)達的汗腺組織形態(tài)；G 誘導(dǎo)前BrdU陽性細胞散在存在；H 誘導(dǎo)后BrdU陽性細胞集中在汗腺組織內(nèi))；Bar = 100 μ m。
具體實施例方式以下本發(fā)明以具體實施例的方式具體闡述發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是， 以下的實施例是為了闡述發(fā)明，而非限定發(fā)明的范圍。實施例實施例1 BM-MSCs和汗腺細胞的分離培養(yǎng)及鑒定1. BM-MSCs的分離培養(yǎng)無菌條件下取正常志愿者的髂骨骨髓約^iil,采用直接貼壁法，以含10%胎牛血清、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(lOOyg/ml)的DMEM為培養(yǎng)液，在 37°C,5% C02孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后更換培養(yǎng)基，棄掉未貼壁細胞，以后每2 3d換液1次。 待細胞達80%融合時，用0. 125%的胰蛋白酶消化，給予傳代培養(yǎng)和組化檢測。2.汗腺細胞的分離培養(yǎng)取約0. 13cmX2. IOcm的全層正常皮膚，置于含有青霉素 (100U/ml)和鏈霉素(100yg/ml)的人平衡鹽溶液中反復(fù)漂洗，去除皮下脂肪，在60mm培養(yǎng)皿中將皮膚剪成Imm3左右的小塊，加入含有II型膠原酶Omg/ml)、胎牛血清(5% )、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(ΙΟΟμ g/ml)的 DMEM 液 3ml，置 37°C、5% C02,95% 02、飽和濕度孵箱中過夜。次日在清潔的、紫外線消毒的50X倒置相差顯微鏡下挑取汗腺組織，置37°C、 5% C02,95% 02、飽和濕度條件下培養(yǎng)。汗腺培養(yǎng)液以DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，補加胎牛血清(5% )、重組人表皮生長因子(lOng/ml)、三碘甲狀腺原氨酸Qng/ml)、半琥珀酰氫化可的松(0. 14 μ g/ml)、胰島素2轉(zhuǎn)鐵蛋白2亞硒酸鈉(lml/100ml)(以上試劑均購于Gibco) 及青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100 μ g/ml)。待人汗腺細胞貼壁后，補加約2ml汗腺培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以后每2 3d換液一次。3.免疫細胞化學(xué)檢測結(jié)果取細胞爬片，用預(yù)冷的甲醛丙酮混合液(體積比 1 1))固定30min，按二步法免疫組化檢測試劑盒說明進行⑶44、CEA、CK7、CK8和CK19 檢測。檢測結(jié)果表明汗腺細胞內(nèi)不表達CD44(圖1A)，而CEA(圖IB)、CK7(圖1C)、CK8(圖 1D)和CK19(圖1E)表達陽性；BM-MSCs內(nèi)CD44呈強陽性表達(圖1F)，不表達CEA (圖1G)、 CK7(圖1H)、CK8(圖II)和CK19(圖1J)。說明上述標(biāo)志可用于鑒定汗腺細胞和BM_MSCs。實施例2汗腺發(fā)育相關(guān)基因重組蛋白誘導(dǎo)BM-MSCs向汗腺細胞的轉(zhuǎn)分化將BM-MSCs于誘導(dǎo)前一天以3X 105/ml的密度接種于60mm2的培養(yǎng)皿中，次日進行轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)。對照組使用新鮮的汗腺細胞培養(yǎng)基，實驗組使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含 EDA-A10. 25 μ g/ml和EGF0. 5 μ g/ml)誘導(dǎo)時間為7-9天。所有實驗均重復(fù)至少3次。1. BM-MSCs轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)后細胞形態(tài)的改變BM_MSCs誘導(dǎo)前體積較大，呈纖維狀分散性分布(圖2A)；誘導(dǎo)8天后細胞體積變小，呈多邊形且比較扁平，部分細胞可相互連接成片，如“鋪路石”樣生長，形態(tài)類似汗腺上皮細胞(圖2B)。2. BM-MSCs轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)后細胞表型的改變BM_MSCs經(jīng)重組蛋白條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)8 天后，按前述的細胞固定方法及文獻報道的免疫熒光法行CEA、CK7、CK8和CK19檢測。結(jié)果顯示誘導(dǎo)前沒有檢測到CEA (圖3A)、CK7 (圖3B)、CK8 (圖3C)和CK19 (圖3D)染色陽性的細胞，而經(jīng)條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)后約有40-60%的細胞呈CEA (圖3E)、CK7(圖3F)、CK8(圖 3G)和CK19(圖3H)染色陽性。實施例3BM-MSCs轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)后裸鼠腳掌移植實驗1. BrdU的標(biāo)記和標(biāo)記物的檢測在誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的BM-MSCs細胞培養(yǎng)上清中，加入終濃度為5 μ mo 1 /L的BrdU，置37 °C、5 % C02、95 %空氣、飽和濕度條件下培養(yǎng)3d。按前述的細胞固定及免疫細胞化學(xué)法行BrdU檢測。檢測結(jié)果表明約有95%的細胞為BrdU染色陽性(圖3A和B)。2.裸鼠腳掌燙傷模型的制備常規(guī)消毒裸鼠(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物所)腳掌后， 抓持裸鼠腳掌與小型燙傷儀金屬探頭緊密接觸^，迅速浸入冷水帶走多余熱量，觀察致傷局部發(fā)白變性判定為致傷成功。3.標(biāo)記細胞裸鼠腳掌局部注射移植將經(jīng)過誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的BM-MSCs細胞 (1 X IO6)懸浮于150 μ 1培養(yǎng)液中并以局部注射的方式(燙傷部位皮內(nèi)、皮下多點注射)對燙傷裸鼠腳掌部位進行試驗性治療，采用同體對照。2周后在裸鼠傷部行碘-淀粉發(fā)汗試驗 (將碘酒均勻涂抹于小鼠腳掌面，充分干燥5min，用脫脂棉球?qū)⒌矸蹞溆谀_掌。肌內(nèi)注射鹽酸腎上腺素0. 2ml (10 μ g/ml)，使其發(fā)汗。觀察腳掌部淀粉顏色變化，局部出現(xiàn)藍黑色為發(fā)汗試驗陽性)檢測汗腺功能，之后處死裸鼠，取腳掌部固定后行組織學(xué)觀察。4.移植細胞促進裸鼠損傷汗腺修復(fù)的效果發(fā)汗實驗及組織學(xué)觀察結(jié)果表明未經(jīng)誘導(dǎo)的BM-MSCs細胞移植后發(fā)汗實驗陰性(圖4C)，腳掌內(nèi)有極不發(fā)達且結(jié)構(gòu)簡單的腺體組織存在(圖4E)，BrdU陽性細胞呈散在分布(圖4G)；而經(jīng)誘導(dǎo)的BM-MSCs細胞移植后發(fā)汗實驗陽性(圖4D)，腳掌內(nèi)有大片汗腺腺體組織，可見發(fā)達而盤曲的分泌部(圖4F)，且 BrdU陽性細胞集中分布在新生汗腺組織內(nèi)(圖4H)。以上結(jié)果說明經(jīng)過建立適當(dāng)?shù)捏w外汗腺誘導(dǎo)培養(yǎng)體系，中胚層來源的BM-MSCs 可以通過跨胚層轉(zhuǎn)分化途徑轉(zhuǎn)變?yōu)楹瓜贅蛹毎⑶覐男螒B(tài)、表型和功能等方面確證這些轉(zhuǎn)分化來源的細胞為汗腺細胞。
權(quán)利要求
1.一種體外誘導(dǎo)成體骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)分化為汗腺細胞的非轉(zhuǎn)基因方法，包括以下步驟a)分離并培養(yǎng)BM-MSCs，用免疫細胞化學(xué)法鑒定其表面標(biāo)志性蛋白CD44；b)分離并培養(yǎng)汗腺細胞，用免疫細胞化學(xué)法鑒定其表面標(biāo)志性蛋白CEA、CK7、CK8和 CK19 ；c)上清中加入汗腺發(fā)育相關(guān)基因重組蛋白-外胚層發(fā)育不良蛋白 Al (Ectodysplasin-Al，EDA-A1)和表皮生長因子(Epidermal growth factor, EGF)誘導(dǎo) BM-MSCs向汗腺細胞的轉(zhuǎn)分化；d)繼續(xù)孵育上述經(jīng)重組蛋白誘導(dǎo)的BM-MSCs并獲得汗腺或汗腺樣細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的誘導(dǎo)時BM-MSCs的密度為1-10X105/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的誘導(dǎo)時BM-MSCs的密度為3X105/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的誘導(dǎo)時EDA-Al重組蛋白的濃度 0. 05-3. 00 μ g/ml, EGF 重組蛋白的濃度 0. 10-1. 00 μ g/ml.
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的誘導(dǎo)時EDA-Al重組蛋白的濃度0.25 μ g/ ml，EGF重組蛋白的濃度0. 50 μ g/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中重組蛋白EDA-Al和EGF誘導(dǎo)MSCs向汗腺細胞轉(zhuǎn)分化的時間為5-12天。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中重組蛋白EDA-Al和EGF誘導(dǎo)MSCs向汗腺細胞轉(zhuǎn)分化的時間為為7-9天。
全文摘要
本發(fā)明涉及人汗腺再生研究領(lǐng)域。具體說來，本發(fā)明涉及一種在體外培養(yǎng)條件下，通過采用汗腺發(fā)育相關(guān)基因重組蛋白干預(yù)技術(shù)，在非轉(zhuǎn)基因條件下誘導(dǎo)成體骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)轉(zhuǎn)分化為汗腺細胞的方法。
文檔編號C12N5/071GK102161981SQ20101012797
公開日2011年8月24日 申請日期2010年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月23日
發(fā)明者付小兵, 孫同柱, 張翠萍 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院