包含ramp功能的通用蛋白質(zhì)過表達(dá)標(biāo)記及其應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及在細(xì)胞中能夠改善重組蛋白質(zhì)的難表達(dá)/不表達(dá)問題的合成標(biāo)記。更具體地說，通過使標(biāo)記（tag)在轉(zhuǎn)錄或翻譯階段中、在目標(biāo)基因的內(nèi)/外部一起行動(dòng)（通過tRNA的選擇誘導(dǎo)（刈砷音王）和再使用提供而調(diào)節(jié)翻譯速度），從而改善雜合基因中存在宿主的稀有密碼子（rarecodon)時(shí)成為問題的翻譯速度阻礙以及非均勻的蛋白質(zhì)表達(dá)問題，穩(wěn)定地誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的功能性過表達(dá)?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]有用蛋白質(zhì)通?？梢源笾路譃橹T如免疫調(diào)節(jié)劑、酶抑制劑和激素之類的醫(yī)藥及諸如研究用蛋白質(zhì)和診斷用蛋白質(zhì)或反應(yīng)添加酶之類的工業(yè)用蛋白質(zhì)。在大量生產(chǎn)這樣的蛋白質(zhì)的過程中，務(wù)必需要基因表達(dá)、培養(yǎng)、純化技術(shù)。特別是表達(dá)技術(shù)在生產(chǎn)工藝技術(shù)過程中占據(jù)最重要的部分，是判斷經(jīng)濟(jì)性的核心指標(biāo)，因此其是提高附加價(jià)值和效用性的主要工藝。以往為了獲得特定蛋白質(zhì)，使用了如下方法：篩選出生產(chǎn)性高的細(xì)菌或動(dòng)物細(xì)胞株，由此生產(chǎn)所需的蛋白質(zhì)，并進(jìn)行分離純化。但是，就這樣的方法而言，收率有限，且在應(yīng)用于其它蛋白質(zhì)的情況下，不僅無(wú)法確保相等的生產(chǎn)性，而且在獲得優(yōu)質(zhì)（形態(tài)/結(jié)構(gòu)/功能上相同的蛋白質(zhì)）的產(chǎn)品方面上存在很多問題。目前，隨著基因重組（遺傳工程學(xué)）技術(shù)的發(fā)達(dá)，普遍使用如下方法：將有用基因轉(zhuǎn)化到大腸菌或動(dòng)植物細(xì)胞株等中，容易獲得大量的所需蛋白質(zhì)。特別是生產(chǎn)性與費(fèi)用有關(guān)，因此利用具有能夠在價(jià)格比較低的培養(yǎng)基中快速且以高濃度培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)的微生物（大腸菌、酵母或放線菌等單細(xì)胞）的重組蛋白質(zhì)的大量生產(chǎn)在商業(yè)方面具有很大的優(yōu)點(diǎn)是已為人所知的。此外，就這些宿主而言，已經(jīng)查明了生理/遺傳學(xué)特性，且用于操作重組基因的有效方法和技術(shù)的發(fā)展良好。因此，由于具有能夠高效獲得目標(biāo)雜合有用蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，成功地生產(chǎn)了胰島素等醫(yī)/藥用蛋白質(zhì)和工業(yè)用酶等。已知，在具有相對(duì)復(fù)雜的生理/遺傳現(xiàn)象和調(diào)節(jié)機(jī)制的動(dòng)植物宿主的情況下，需要很難的基因操作/調(diào)節(jié)過程，因此實(shí)際情況是，對(duì)于適用于生物體的醫(yī)藥用蛋白質(zhì)以外的外源基因表達(dá)，利用頻率相對(duì)低。但是在利用通用的表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制的情況下，能夠克服這樣的缺點(diǎn)，因此對(duì)于能夠同樣應(yīng)用于包括原核細(xì)胞株的所有真核細(xì)胞株的表達(dá)調(diào)節(jié)法的開發(fā)或改良，正在進(jìn)行大量研究。[0003]用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)在載體、宿主、0RF(開放讀碼框(openreadingframe))水平上試圖接近工程方法，與此關(guān)聯(lián)開發(fā)的技術(shù)的原型(prototype)較為人所熟知的（Marino，M.H.，Biopharm.2(1989)18-33;Goeddel，D.V.etal.,MethodsEnzymol.185(1990)3-7；ffurm,F.andBernard,A.,Curr.Opin.Biotechnol.10(1999)156-159)。通過以這種原型技術(shù)為基礎(chǔ)的各種策略和技術(shù)變形，報(bào)道了很多外源基因的成功表達(dá)，但實(shí)際情況是，由于泛化邏輯的缺乏，通常要求根據(jù)特定基因重優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)成要素的一部分或者全部的過程。在這樣的過程中，利用通過強(qiáng)啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)因子的組合而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄物量增加的策略和以轉(zhuǎn)錄物的二級(jí)結(jié)構(gòu)、熱力學(xué)穩(wěn)定性增加為主的表達(dá)策略。但是已知，這樣的策略缺乏可應(yīng)用于所有蛋白質(zhì)的泛化邏輯，更重要的是，仍存在與轉(zhuǎn)錄物和翻譯的蛋白質(zhì)量沒有明顯的相關(guān)關(guān)系的情況頻繁發(fā)生的問題。最近，作為解決這樣的問題的對(duì)策，與蛋白質(zhì)翻譯效率增加或者速度調(diào)節(jié)有關(guān)的新的表達(dá)策略被已知為可泛化的潛在邏輯。[0004]在翻譯階段發(fā)生的低表達(dá)效率起因于外源基因的編碼序列（codon)，所述外源基因具有表現(xiàn)出與宿主細(xì)胞中表達(dá)良好的固有（innate)基因的蛋白質(zhì)編碼序列不同的模式的密碼子使用（codonusage)頻率。由于與基因組編碼位點(diǎn)的密碼子配對(duì)而進(jìn)化(coevolution)的宿主的tRNA池內(nèi)的密碼子偏愛性（codonpreference)很偏向，因此每個(gè)細(xì)胞由偏向的密碼子翻譯各氨基酸是公知的事實(shí)。此外熟知，密碼子利用過程中的偏向性可以使肽鏈伸長(zhǎng)率（peptideelongationrate)發(fā)生變化（S0fensenM.A.etal.，1993)。由此，對(duì)于最有效的重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)而言，隨著為了提高轉(zhuǎn)錄效率而考慮的載體序列（啟動(dòng)子和操縱基因）和考慮了與其相互作用的因子的在轉(zhuǎn)錄模塊水平上的改良，考慮到宿主的密碼子使用，需要變更或調(diào)節(jié)外源基因密碼子。作為用于解決這樣的蛋白質(zhì)翻譯抑制問題的多種方法的一環(huán)，開發(fā)了密碼子優(yōu)化技術(shù)（codonoptimizationtechnique)。作為用于提高翻譯時(shí)低效的蛋白質(zhì)編碼位點(diǎn)的翻譯速度的嘗試，通常利用將宿主細(xì)胞中幾乎不使用或者很少使用的密碼子（稀有密碼子）置換為偏愛密碼子(preferredcodon)的策略。[0005]密碼子優(yōu)化，是指通過減少野生型基因中的稀有密碼子比率而增加翻譯速度的方法來(lái)提高重組蛋白質(zhì)的表達(dá)量，其以宿主特異性的密碼子使用表為基礎(chǔ)在電腦上容易實(shí)現(xiàn)。如果輸入目標(biāo)基因的序列，并輸入利用于表達(dá)的宿主的密碼子表（codontable)，則會(huì)置換成顯示出最高頻率（frequency)的密碼子，按照評(píng)分（score)高的順序生成結(jié)果。但是，需要人工合成將野生型0RF堿基序列更換成編碼同種氨基酸的其它序列（同義密碼子（synonymouscodon))的DNA，因此在費(fèi)用方面負(fù)擔(dān)大。此外，根據(jù)密碼子分類基準(zhǔn)或方法，需要進(jìn)行合成多種基因的實(shí)驗(yàn)，與預(yù)料的相反，頻繁地發(fā)現(xiàn)不顯示與野生型基因相比提高了的表達(dá)量的情況。更極端地，還報(bào)道了在非密碼子優(yōu)化的密碼子去優(yōu)化（codonde-optimization)(應(yīng)用與優(yōu)化相反的邏輯，將偏愛密碼子更換成稀有密碼子的策略）過程中，表達(dá)率反而增加的結(jié)果。作為根據(jù)密碼子使用差異的重組蛋白質(zhì)表達(dá)效率的間接解決方案，還嘗試了補(bǔ)充針對(duì)相應(yīng)密碼子（稀有密碼子）的tRNA量的方法（Lee，SuJeong，其他3人，2006)。在該過程中，嘗試了將編碼宿主細(xì)胞中不足的特定tRNA的質(zhì)粒追加加入宿主細(xì)胞的方法。但上述方法也存在需要同時(shí)提供包含目標(biāo)基因的載體和編碼特定tRNA的質(zhì)粒的問題。此外，需要解決的難題是雙載體表達(dá)（dualvector-expression)的根本性問題、即細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性和伴隨此的難以導(dǎo)出具有再現(xiàn)性的結(jié)果的問題。[0006]在本發(fā)明中，作為能夠提高翻譯效率的新的方法，提出包含RAMP(ramp)功能的通用蛋白質(zhì)過表達(dá)標(biāo)記。如果利用RAMP標(biāo)記（ramptag)增加翻譯效率，則與密碼子優(yōu)化不同，可以不更換原來(lái)的0RF序列，因此蛋白質(zhì)固有活性沒有變化，不需要與密碼子置換相關(guān)的DNA人工合成，從而節(jié)省費(fèi)用。此外，就所謂標(biāo)記（tag)的概念而言，不僅能夠最大地確保序列的流動(dòng)性，而且能夠擔(dān)保可與其它功能性標(biāo)記嫁接使用的嫁接優(yōu)勢(shì)。由此，能夠以低費(fèi)用設(shè)計(jì)迅速增加翻譯效率的標(biāo)記（tag)的技術(shù)具有重要的經(jīng)濟(jì)工業(yè)意義。特別是，這樣的通用表達(dá)邏輯將會(huì)顯著提高被已知為具有相對(duì)復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制而使用有限制的動(dòng)植物細(xì)胞株中的外源蛋白質(zhì)生產(chǎn)可能性?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0007]本發(fā)明的目的在于提供新方式的重組蛋白質(zhì)的過表達(dá)方法，該方法與需要變更基因的堿基序列的以往的密碼子優(yōu)化不同，通過開發(fā)出包含能夠調(diào)節(jié)翻譯速度的RAMP標(biāo)記(ramptag)功能的1-20個(gè)密碼子構(gòu)成的標(biāo)記（tag)并融合于所希望的基因的內(nèi)/外部的方式，能夠減少基因合成所需的費(fèi)用、快速且能夠?qū)崿F(xiàn)多種應(yīng)用。[0008]此外，本發(fā)明的目的在于，提供構(gòu)建密碼子表（codontable)的生物體中構(gòu)成標(biāo)記的稀有密碼子的篩選基準(zhǔn)，并提供該密碼子的排列方式。[0009]此外，本發(fā)明的目的在于，制作并提供能夠應(yīng)用于各種重組蛋白質(zhì)的通用RAMP標(biāo)記（universalramptag)，進(jìn)而提供用作表達(dá)盒的方法。[0010]此外，本發(fā)明的目的在于，利用適合于上述宿主和重組蛋白質(zhì)的標(biāo)記的制作方法，提供能夠應(yīng)用的基因表達(dá)調(diào)節(jié)方法。[0011]本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)上述目的，提供在各宿主細(xì)胞中收集稀有密碼子（rarecodon)的方式和構(gòu)成包含針對(duì)目標(biāo)基因的RAMP功能的標(biāo)記（tag)的方法、以及在增加翻譯效率時(shí)標(biāo)記所貢獻(xiàn)的工作原理。[0012]由此，本發(fā)明涉及一種翻譯速度調(diào)節(jié)用RAMP標(biāo)記（ramptag)的制造方法，其包括：制作與宿主細(xì)胞相應(yīng)的稀有密碼子表（rarecodontable)的步驟；將目標(biāo)基因的DNA序列轉(zhuǎn)換為密碼子的步驟；分析上述制作的稀有密碼子表中的稀有密碼子在目標(biāo)基因0RF(開放讀碼框（openreadingframe))中出現(xiàn)的頻率和位置的步驟；以及收集出現(xiàn)頻率為3次以下的稀有密碼子并進(jìn)行配置的步驟。優(yōu)選在收集上述稀有密碼子時(shí)，分析密碼子的頻率為0.5~3%、同工受體（isoacc印tor)tRNA基因數(shù)為0~2個(gè)者，制造RAMP標(biāo)記。在配置上述稀有密碼子時(shí)，考慮0RF中出現(xiàn)的頻率和位置而進(jìn)行配置。優(yōu)選可以按照0RF中出現(xiàn)的頻率為0.5~2%、位置在前半部的順序進(jìn)行配置。宿主細(xì)胞選自原核（細(xì)菌、古菌）和真核（酵母、菌類、昆蟲、植物、動(dòng)物、人類）細(xì)胞。優(yōu)選選自大腸菌、酵母、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（ChineseHamstercellline)和人類細(xì)胞（Homosapienscellline)、植物細(xì)胞（擬南芥（Arabidopsisthaliana))等。更優(yōu)選選自大腸菌（E.coli)K_12、釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、CH0_Kl和HEK293t等。RAMP標(biāo)記（ramptag)可以由1-20個(gè)密碼子構(gòu)成。優(yōu)選可以由在稀有密碼子（rarecodon)之間包含偏愛密碼子(preferredcodon)的1_20個(gè)密碼子構(gòu)成。更優(yōu)選可以由在稀有密碼子（rarecodon)之間包含0RF中出現(xiàn)的頻率為0.5~2%的宿主偏愛密碼子（preferredcodon)的1-20個(gè)密碼子構(gòu)成。在制作更多目標(biāo)標(biāo)記時(shí)，使通常使用的His-標(biāo)記的稀有密碼子排列在標(biāo)記中，構(gòu)成在使蛋白質(zhì)過表達(dá)的同時(shí)可純分離的多目標(biāo)RAMP標(biāo)記。目標(biāo)基因是編碼難表達(dá)蛋白質(zhì)的基因，更優(yōu)選基因?qū)Ⅴッ福╡sterase)、0-葡萄糖苷酶（0-glucosidase)、溶細(xì)胞素(cytolysinA)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（chloramphenicolacetyltransferase)、新普魯蘭酶(neopullulanase)、白細(xì)胞介素_1(interleukin-l)、白細(xì)胞介素-32(interleukin-32)、重組抗體（單鏈Fv(singlechainFv)，scFv)、天冬酰胺酶B(asparaginaseB)、四-細(xì)胞粘附分子（T-CAM)、B3(Fv)PE38、抗-CD20(抗-B淋巴細(xì)胞抗體CD20(anti-B-lymphocyteantigenCD20))、抗-TNFa(抗腫瘤壞死因子a(anti-tumournecrosisfactora))進(jìn)行編碼。[0013]此外，本發(fā)明涉及通過根據(jù)本發(fā)明的制造方法制造的翻譯速度調(diào)節(jié)用RAMP標(biāo)記(ramptag)。優(yōu)選上述RAMP標(biāo)記可以選自序列號(hào)1至序列號(hào)42。[0014]此外，本發(fā)明涉及增加蛋白質(zhì)的表達(dá)/純化效率的方法，該方法在宿主細(xì)中增加難表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)效率，其特征在于，包括：在宿主細(xì)胞中收集稀有密碼子（rarecodon)的步驟；構(gòu)成針對(duì)目標(biāo)基因的RAMP標(biāo)記（ramptag)的步驟；制造包含RAMP標(biāo)記和目標(biāo)基因的表達(dá)載體的步驟；用表達(dá)載體對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化的步驟；將在適合使蛋白質(zhì)表達(dá)的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞培養(yǎng)的步驟；以及利用組氨酸稀有密碼子進(jìn)行過表達(dá)的同時(shí)純化的步驟。上述稀有密碼子的收集可以通過分析密碼子的頻率為0.5~2%、同工受體(isoacceptor)tRNA基因數(shù)為0~2個(gè)者來(lái)實(shí)現(xiàn)。上述RAMP標(biāo)記（ramptag)稀有密碼子可以考慮在目標(biāo)基因中出現(xiàn)的頻率和位置而進(jìn)行配置。優(yōu)選可以按照0RF中出現(xiàn)的頻率為0.5~2%、位置在前半部的順序構(gòu)成。此外可以組合RAMP標(biāo)記的密碼子順序而進(jìn)行配置。[0015]宿主細(xì)胞選自原核（細(xì)菌、古菌）和真核（酵母、菌類、昆蟲、植物、動(dòng)物、人類）細(xì)胞。優(yōu)選選自大腸菌、酵母、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（ChineseHamstercellline)和人類細(xì)胞（Homosapienscellline)、植物細(xì)胞（擬南芥（Arabidopsisthaliana))等。更優(yōu)選選自大腸菌（E.coli)K_12、釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、CH0_Kl和HEK293t等。RAMP標(biāo)記（ramptag)可以由1-20個(gè)密碼子構(gòu)成。優(yōu)選可以在稀有密碼子（rarecodon)之間包含偏愛密碼子（preferredcodon)。更優(yōu)選可以在稀有密碼子(rarecodon)之間包含0RF中出現(xiàn)的頻率為0.5~2%的宿主偏愛密碼子（preferredcodon)。此外，目標(biāo)基因是編碼難表達(dá)蛋白質(zhì)的基因，更優(yōu)選基因?qū)Ⅴッ福╡sterase)、葡萄糖苷酶（0-glucosidase)、溶細(xì)胞素（cytolysinA，ClyA)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(chloramphenicolacetyltransferase，CAT)、新普魯蘭酶（neopullulanase)、白細(xì)胞介素-1(interleukin-1)、白細(xì)胞介素-32(interleukin_32)、重組抗體（單鏈Fv，scFv)、天冬酰胺酶B(asparaginaseB)、四細(xì)胞粘附分子（T-CAM)、B3(Fv)PE38、抗-CD20(抗-B淋巴細(xì)胞抗體⑶20(anti-B_lymphocyteantigen0)20))、抗-TNFa(抗腫瘤壞死因子a(anti-tumourNecrosisFactorAlpha))進(jìn)行編碼。RAMP標(biāo)記可以融合于目標(biāo)基因的5'或3'，或者導(dǎo)入到目標(biāo)基因的內(nèi)部，或者配置成獨(dú)立地進(jìn)行翻譯。RAMP標(biāo)記可以進(jìn)一步與其它標(biāo)記或融合蛋白質(zhì)一起使用，其它標(biāo)記可以為選自His、T7、S、Flag、HA、V5表位、Strep、Nano、SBP、c-myc、PelB及Xpress表位標(biāo)記中的1種以上。融合蛋白質(zhì)可以選自GST、MBP、NusA、CBP、GFP、硫氧還蛋白、Mistic、Sumo及DSB等。此外，上述RAMP標(biāo)記可以具備信號(hào)序列或成熟蛋白質(zhì)或多肽的5'-末端的特異的切割位點(diǎn)。篩選出的雜合信號(hào)序列通常在宿主細(xì)胞中被識(shí)別并被處理（例如，借助于信號(hào)肽酶的切割）。這種信號(hào)序列可以選自IgA-蛋白酶、粒酶（granzyme)B、Tev蛋白酶、預(yù)切割（prescission)蛋白酶、凝血酶、Xa因子（factorXa)、喊性磷酸酶（alkalinephosphatase)、青霉素酶（penicillinase)、lpp、腸激酶或熱穩(wěn)定腸毒素II型前導(dǎo)（heat-stableenterotoxinIIleaders)等。[0016]上述RAMP標(biāo)記可以與提尚重組蛋白質(zhì)表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)一起使用。通常，蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒的要素是包含一個(gè)以上的用于表達(dá)原核生物復(fù)制起點(diǎn)和原核生物篩選標(biāo)記(marker)、真核生物篩選標(biāo)記（marker)、以及目標(biāo)基因表達(dá)模塊（各個(gè)基因包括啟動(dòng)子、核糖體識(shí)別位點(diǎn)、5'-UTR、結(jié)構(gòu)基因和包含3'-UTR信號(hào)的轉(zhuǎn)錄終止因子）的表達(dá)的表達(dá)盒的質(zhì)粒構(gòu)成單元。源自質(zhì)粒PBR3222的復(fù)制起點(diǎn)適合于大多數(shù)革蘭氏陰性桿菌，2y質(zhì)粒起點(diǎn)適合于酵母，各種病毒起點(diǎn)（SV40、多瘤病毒（polyoma)、腺病毒（adenovirus)、VSV或BPV)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有效作為表達(dá)載體。表達(dá)載體通常含有被宿主器官識(shí)別的啟動(dòng)子，適合用于原核宿主的啟動(dòng)子是araBAD啟動(dòng)子、phoA啟動(dòng)子、0-內(nèi)酰胺酶(beta-lactamase)及乳糖（lactose)啟動(dòng)子系統(tǒng)、喊性磷酸酶（alkalinephosphatase)、色氨酸（trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)及tac啟動(dòng)子等雜合（hybrid)啟動(dòng)子。但是其它已知的細(xì)菌啟動(dòng)子（革蘭陽(yáng)性或廣譜范圍（broadspectrumrang)啟動(dòng)子）也適合。此外，為了優(yōu)化的翻譯，還可以使在mRNA的起始密碼子之前出現(xiàn)的夏因-達(dá)爾加諾序列（ShineDalgarnoSequence、或RBS)或其變異體包含于5'非翻譯區(qū)。真核細(xì)胞的啟動(dòng)子序列是廣為人知的。適合用于酵母宿主的啟動(dòng)子序列包含3-磷酸甘油酸激酶（phosphoglyceratekinase)或稀醇化酶（enolase)、甘油酸_3_磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)、己糖激酶（hexok當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 4 5 6