包括簡化的基因工程生物指示劑的滅菌指示器的制造方法
【專利說明】包括簡化的基因工程生物指示劑的滅菌指示器
【背景技術(shù)】
[0001] 本申請發(fā)明人以前公開一種基因工程生物指示劑，所述基因工程生物指示劑包含 用于產(chǎn)生指示酶的至少一種測試生物體和至少一種報告基因，所述報告基因被測試生物體 攝?。╰akenup)，所述測試生物體包含細(xì)菌芽孢；至少一種阻遏基因，其抑制報告基因的表 達(dá)，直至報告基因暴露于至少一種誘導(dǎo)物；其中基因工程生物指示劑是自含式生物指示器 的一個組分，所述自含式生物指示器例如兩隔室系統(tǒng)如瓶（vial)和封蓋的組合，該兩隔室 系統(tǒng)還包含基因工程生物指示劑的生長培養(yǎng)基。參見例如U.S.專利號8, 372, 624。
[0002] 在US 8372624公開的基因工程生物指示劑系統(tǒng)和方法中，阻遏基因抑制報告基 因的表達(dá)，直至該系統(tǒng)暴露于誘導(dǎo)物。在應(yīng)用這種系統(tǒng)和方法時，遇到了各種問題，包括指 示劑的變色，這是由于誘導(dǎo)物和/或與如報告基因一樣必須被測試生物體攝取的阻遏基因 有關(guān)的組織的降解造成的。例如，當(dāng)系統(tǒng)在滅菌處理期間或者在生產(chǎn)基因工程生物指示劑 系統(tǒng)的加工過程中被加熱時，已觀測到變色反應(yīng)。認(rèn)為通過加熱或其他滅菌處理（例如，通 過氧化滅菌處理，如氣態(tài)過氧化氫、環(huán)氧乙烷等），使誘導(dǎo)物例如木糖降解并變成褐色或者 其他變色。這種變褐或變色對檢測與顯示滅菌失敗的結(jié)果相關(guān)的任何變化造成干擾?？梢?理解，這是不期望的，因為這導(dǎo)致試驗靈敏度降低。以前需要誘導(dǎo)物來克服阻遏基因的影 響。通過省略阻遏基因，就不再需要使用誘導(dǎo)物，并因此可以避免由誘導(dǎo)物引起的變褐或變 色問題。另外，將認(rèn)識到在用于誘導(dǎo)測試生物體攝取報告基因的載體中必須包括阻遏基因 只會增加用于生產(chǎn)基因工程生物指示劑系統(tǒng)的總體過程的復(fù)雜性。這些問題仍需要解決。
[0003] 發(fā)明概述
[0004] 因此，在利用這種系統(tǒng)時出現(xiàn)了問題，本申請發(fā)明人通過開發(fā)本發(fā)明解決了這個 問題。本申請發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一種新的基因工程生物指示劑，如同先前的系統(tǒng)，其包括： 用于產(chǎn)生指示酶的至少一種測試生物體和至少一種報告基因，報告基因被測試生物體攝 取，測試生物體包含細(xì)菌芽孢；其中基因工程生物指示劑是自含式生物指示器的一個組分。 然而，本發(fā)明不需要阻遏基因和誘導(dǎo)物，并且在事實上不包括阻遏基因和誘導(dǎo)物，而阻遏基 因和誘導(dǎo)物是在US 8372624中公開的基因工程生物指示劑系統(tǒng)和方法所需的。
[0005] 因此，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，提供了一種滅菌指示器，其包括：
[0006] 第一隔室，其含有基因工程生物指示劑，該第一隔室被調(diào)整適于允許生物指示劑 在滅菌過程中與滅菌介質(zhì)接觸；和
[0007] 第二隔室，其含有至少一種酶底物，該第二隔室被調(diào)整適于使酶底物在滅菌過程 中保持與生物指示劑分開，并且該第二隔室被調(diào)整適于在生物指示劑已暴露于滅菌介質(zhì)后 允許酶底物接觸生物指示劑；
[0008] 其中，基因工程生物指示劑包含適合產(chǎn)生指示酶的至少一種測試生物體和至少一 種報告基因，所述報告基因被測試生物體攝??；
[0009] 其中，滅菌指示器中的測試生物體不含任何活性的或者可激活的阻遏基因，該阻 遏基因如果存在于測試生物體或滅菌指示器中將抑制報告基因的表達(dá)，并且
[0010] 其中，選擇指示酶和酶底物以使指示酶對酶底物的酶促作用產(chǎn)生可檢測的信號。
[0011] 在一個實施方案中，使用至少一種質(zhì)粒和/或至少一種病毒，使報告基因被測試 生物體攝取。
[0012] 在一個實施方案中，測試生物體包括嗜熱脂肪地芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus)和 / 或萎縮芽抱桿菌（Bacillusatrophaeus)的芽抱。
[0013]在一個實施方案中，報告基因包括lacZ、bgaB、xylE、cat或者其中的兩種或更多 種的混合物。
[0014]在一個實施方案中，指示酶包括P-D-半乳糖苷酶、P-D-葡糖苷酶、a-D-葡 糖苷酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、丁酸酯酶、辛酸酯酶脂肪酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、兒茶 酚-2, 3-二加氧酶、肉豆蔻酸酯脂肪酶、亮氨酸氨肽酶、纈氨酸氨肽酶、糜蛋白酶、磷酸水解 酶、a-D-半乳糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、N-乙?；?0-氨基葡糖苷酶、0-D-纖 維二糖糖苷酶、丙氨酸氨肽酶、脯氨酸氨肽酶、酪氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶、0 -D-葡糖 醛酸糖苷酶、脂肪酸酯酶，或者其中的兩種或更多種的混合物。
[0015]在一個實施方案中，報告基因包括lacZ或bgaB，且指示酶包括P-D-半乳糖苷酶。[0016]在一個實施方案中，質(zhì)粒包含報告基因且不含任何阻遏基因。
[0017]在一個實施方案中，病毒包含至少一種基因轉(zhuǎn)運蛋白（transporter)，所述基因轉(zhuǎn) 運蛋白包含被殼體包圍的核酸，基因轉(zhuǎn)運蛋白包含報告基因且不含任何阻遏基因。在一個 實施方案中，病毒包含至少一種菌體。在一個實施方案中，病毒包含X或M13B策菌體。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，提供一種滅菌指示器，其包括：
[0019]第一隔室，其含有基因工程生物指示劑，該第一隔室被調(diào)整適于允許生物指示劑 在滅菌過程中與滅菌介質(zhì)接觸；和
[0020] 第二隔室，其含有至少一種酶底物，該第二隔室被調(diào)整適于使酶底物在滅菌過程 中與生物指示劑分開，并且該第二隔室被調(diào)整適于在生物指示劑已暴露于滅菌介質(zhì)后允許 酶底物接觸生物指示劑；
[0021] 其中，基因工程生物指示劑包含產(chǎn)生指示酶的嗜熱脂肪地芽孢桿菌和/或萎縮芽 孢桿菌的芽孢和選自lacZ、bgaB、XylE和cat基因的至少一種報告基因，所述報告基因被嗜 熱脂肪地芽孢桿菌和/或萎縮芽孢桿菌的芽孢攝??；
[0022] 其中，滅菌指示器中的嗜熱脂肪地芽孢桿菌和/或萎縮芽孢桿菌的芽孢不含任何 活性的或可激活的阻遏基因，該阻遏基因如果存在于測試生物體或滅菌指示器中將會抑制 報告基因的表達(dá)，并且
[0023] 其中，選擇指示酶和酶底物以使指示酶對酶底物的酶促作用產(chǎn)生可檢測信號。
[0024]在一個實施方案中，指示酶包括0 -D-半乳糖苷酶、0 -D-葡糖苷酶、a -D-葡 糖苷酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、丁酸酯酶、辛酸酯酶脂肪酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、兒茶 酚-2, 3-二加氧酶、肉豆蔻酸酯脂肪酶、亮氨酸氨肽酶、纈氨酸氨肽酶、糜蛋白酶、磷酸水解 酶、a-D-半乳糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、N-乙?；?0-氨基葡糖苷酶、0-D-纖 維二糖糖苷酶、丙氨酸氨肽酶、脯氨酸氨肽酶、酪氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶、0 -D-葡糖 醛酸糖苷酶、脂肪酸酯酶，或者其中的兩種或更多種的混合物。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，提供一種滅菌方法，其包括：
[0026]使待要進行滅菌的物品和上述的滅菌指示器暴露于滅菌介質(zhì)；
[0027]合并第一隔室和第二隔室的內(nèi)容物；
[0028] 孵育第一隔室和第二隔室的合并內(nèi)容物；并且
[0029] 通過在孵育后檢測存在或不存在可檢測的信號來確定滅菌處理的效力。
[0030] 在一個實施方案中，在該滅菌方法中，滅菌介質(zhì)包括蒸汽、干熱、輻射、等離子體、 一種或多種氣體滅菌劑和/或一種或多種液體滅菌劑。
[0031] 在一個實施方案中，在該滅菌方法中，滅菌介質(zhì)包括電子束輻射、電磁輻射、Y輻 射、0輻射、環(huán)氧乙烷、氣體過氧化氫、液體過氧化氫、福爾馬林、戊二醛和/或過乙酸。
[0032] 本發(fā)明可以提供優(yōu)于US8372624系統(tǒng)的一些優(yōu)點中的一個或多個。通過移除阻 遏基因或者以其他方式敲除其活性，也就移除了對誘導(dǎo)物的需要。"敲除"基因的活性可以 通過插入突變、缺失突變或通過用不含該基因的病毒或質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化該野生型宿主生物體來 完成。由于在一些情況中誘導(dǎo)物（例如木糖）可非故意干擾US8372624系統(tǒng)的正常功能， 它的移除完全消除了這種可能性。通過移除阻遏基因，本發(fā)明還提供了如下益處：降低成本 和降低生產(chǎn)包括基因工程生物指示劑的滅菌指示器的復(fù)雜性，因為阻遏物和誘導(dǎo)物都不是 必需的組分。通過移除阻遏物，轉(zhuǎn)染載體能在組成上表達(dá)其報告酶；意味著在不存在阻遏的 情況下，報告基因的產(chǎn)物將會達(dá)到高得多的水平，因而增加指示劑的靈敏度。因此，消除了 在生產(chǎn)這種滅菌指示器的過程中所涉及的步驟的數(shù)量和復(fù)雜性，以及對這些現(xiàn)在不必要的 組分的成本和操作。最后，當(dāng)滅菌指示器已通過滅菌處理、已經(jīng)過孵育并測定結(jié)果時，不存 在因降解的誘導(dǎo)物引起的吸光度進一步增加讀數(shù)器的靈敏度和信號強度。
[0033] 附圖簡述
[0034] 本發(fā)明可與多種滅菌指示器設(shè)備一起使用。附圖旨在提供對適合的滅菌裝置的 示例性的、非限制性的描述，目的在于更好地理解本發(fā)明，而不是意圖以任何形式限制本發(fā) 明。在附圖中，類似的部件和特征具有類似的標(biāo)號。
[0035] 圖1是適合供本發(fā)明的實施方案使用的滅菌指示器的第一實施方案在激活前配 置下的示意性剖面圖。
[0036] 圖2是圖1的滅菌指示器在激活配置下的示意性剖面圖。
[0037]圖3是類似于圖1的適合供本發(fā)明實施方案使用的滅菌指示器的第二實施方案在 激活前配置下的示意性剖面圖。
[0038] 圖4顯示無、一個和兩個高壓滅菌循環(huán)對不含有木糖的恢復(fù)培養(yǎng)基的影響。
[0039] 圖5顯示無、一個和兩個高壓滅菌循環(huán)對含有1%木糖的恢復(fù)培養(yǎng)基的影響。
[0040] 應(yīng)該理解，為了簡單和清楚地說明，圖中所示的元件不一定是按比例繪制的。例 如，為了清楚，一些元件的尺寸相對于彼此可以被放大。而且，認(rèn)為適當(dāng)時，在各圖之間可以 重復(fù)參考數(shù)字以指示相應(yīng)的元件。
[0041] 此外，應(yīng)該理解，以下描述的方法步驟和結(jié)構(gòu)可以不形成完整的生產(chǎn)最終可用的 滅菌指示器的工藝流程。本發(fā)明可結(jié)合本領(lǐng)域中目前使用的裝置和處理技術(shù)一起實施，并 且僅包括那些對于理解本發(fā)明是必要的常規(guī)實踐的工藝步驟。
[0042] 發(fā)明詳述
[0043] 術(shù)語"滅菌"是指使物質(zhì)不能繁殖、代謝和/或生長。雖然該術(shù)語通常是指活生物 體完全不存在，但該術(shù)語在本文中是指物質(zhì)在以前同意為可接受的程度上不含活生物體。 除非另有說明，術(shù)語滅菌在本文中還指不如滅菌嚴(yán)格的方法和程序，例如，消毒、衛(wèi)生處理 等。本文中描述的基因工程生物指示劑以及方法和裝置可以用于衛(wèi)生保健領(lǐng)域、科學(xué)領(lǐng)域 等。這些可以用于需要滅菌、消毒、衛(wèi)生處理、排污和清潔等的商業(yè)和工業(yè)應(yīng)用中。所述商 業(yè)和工業(yè)應(yīng)用可以包括諸如食品加工、巴氏殺