定的空間60流動(dòng)到容器30 中。滅菌劑蒸汽流動(dòng)到容器30中并作用于基因工程生物指示劑的微生物。
[0070] 滅菌處理完成后，可以通過將封蓋20朝容器30向下移動(dòng)到第二（或閉合或激活） 位置來激活滅菌指示器，如圖2所示。通過在封蓋20上施加足夠的向下作用力或壓力使封 蓋20向下移動(dòng)。隨著封蓋20向下移動(dòng)，可破裂阻擋層40接觸穿刺部件36的邊緣38,并最 終移動(dòng)到使穿刺部件36的邊緣38刺破或穿透可破裂阻擋層40的位置上。當(dāng)可破裂阻擋 層40被刺破時(shí)，露出腔室26的開口 25,液體恢復(fù)培養(yǎng)基50流入到容器30的內(nèi)部區(qū)域34 中，并如圖2中所示與微生物相接觸?？梢云谕捎门まD(zhuǎn)動(dòng)作向下移動(dòng)封蓋20以實(shí)現(xiàn)可破 裂阻擋層40的更大的或最大的開口，以確保生長(zhǎng)培養(yǎng)基完全流入到容器中。
[0071] 如圖1和圖2中所示，在這一實(shí)施方案中，封蓋20的內(nèi)表面包括第二環(huán)狀突起物 27,而且封蓋可以向下移動(dòng)到某個(gè)位置，使得突起物27的上部與容器30上的凸起32的底 部嚙合，且封蓋20保持在第二閉合/激活位置。第二閉合/激活位置可以用于使封蓋20 與容器30處于密封關(guān)系，這可以防止額外的微生物進(jìn)入系統(tǒng)中。接著孵育滅菌指示器10 持續(xù)足夠的時(shí)間段，以允許測(cè)定微生物的活力。在孵育過程中，任何活的微生物將代謝和生 長(zhǎng)，而且這種代謝和生長(zhǎng)將副產(chǎn)物釋放到培養(yǎng)基中?？梢愿鶕?jù)任何選擇的特征包括例如pH 變化、顏色變化、不透明度、熒光等來檢測(cè)所述副產(chǎn)物。
[0072] 可以理解，在另一實(shí)施方案中，封蓋20不包括將容器維持在密閉位置的第二突起 物27。在一個(gè)替代的實(shí)施方案中，容器30可以包括在容器30的外部上且位于凸起32的 下方的另一環(huán)狀突起物或者一組止動(dòng)裝置（未顯示），該突起物或止動(dòng)裝置可被調(diào)整適于 與封蓋上的凸起29嚙合，以保持容器30處于密閉位置。美國(guó)專利號(hào)5, 770, 393舉例說明 了這樣的配置，并且該專利關(guān)于封蓋和容器的配置的教導(dǎo)通過引用并入本文。在另一替代 的實(shí)施方案中，封蓋20的內(nèi)表面與容器30的外表面可以通過螺紋方式連接，并且可以通過 將封蓋20螺絲接合到容器30上，使封蓋20向閉合位置移動(dòng)并保持在閉合位置上，其中封 蓋20可以如例如在美國(guó)專利號(hào)8, 173, 388B2中所示那樣進(jìn)行螺紋連接，關(guān)于瓶的這一實(shí) 施方案的其它詳情可以查閱上述美國(guó)專利，并且該專利關(guān)于這一實(shí)施方案以及前述實(shí)施方 案的容器和封蓋配置的教導(dǎo)通過引用并入本文。所有這些替代配置全部落入本發(fā)明的范圍 內(nèi)。
[0073] 如上所述，圖1和圖2示出的實(shí)施方案中的封蓋20被顯示為具有孔隙28,以便允 許蒸汽滅菌劑進(jìn)入到指示器中。但是，可以理解，封蓋不需要具有此類特征?？紤]到與滅菌 指示器一起使用的具體滅菌劑，可以按需選擇孔隙的數(shù)量、尺寸、形狀和/或位置。例如，可 以選擇封蓋和/或容器中孔隙的位置、形狀和尺寸，以便在微生物和周圍環(huán)境之間提供滅 菌蒸汽進(jìn)入和排出的曲折路徑。該曲折路徑也可以用于抑制或防止外部物質(zhì)的污染，并確 ?？色@得足夠量的滅菌劑。通過包括曲折路徑，更可能使得整個(gè)載荷暴露于滅菌劑，從而在 殺死滅菌指示器中的測(cè)試微生物之前殺死任何現(xiàn)存的微生物。
[0074] 除了在封蓋中提供孔隙之外或者作為在封蓋中提供孔隙的替代方法，可以在容器 中提供孔隙。此外，如果在容器中提供孔隙，應(yīng)設(shè)定其位置，使得當(dāng)指示器被激活以及阻擋 層破裂時(shí)生長(zhǎng)培養(yǎng)基不會(huì)經(jīng)這些孔隙泄漏或溢出。
[0075] 圖3描述了除了封蓋20中的孔隙28之外，還在容器30的側(cè)壁35中在適當(dāng)位置 形成孔隙80的指示器10。圖3中顯示的孔隙是在容器30的側(cè)壁35中接近容器30的頂 部，在穿刺部件36的邊緣38的附近，以避免激活后的泄漏或溢出。從圖3中可以看出，激活 后，位于這一位置的孔隙80將被處于激活位置的封蓋20覆蓋。注意到，圖3中所示的指示 器10包括封蓋20中的孔隙28,但這不是必需的。在一個(gè)實(shí)施方案（未顯示）中，容器30 包括孔隙80并且與類似于封蓋20的封蓋一起使用，但該封蓋不包括諸如孔隙28的孔隙。 因此，可以在封蓋中或者在容器中，或者在封蓋和容器二者中都提供孔隙。
[0076] 在已完成滅菌處理后，向下按壓封蓋20或者向下扭動(dòng)封蓋20，使得穿刺部件36的 邊緣38穿透并破壞可破裂阻擋層40,釋放空間26中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，以與滅菌處理后可能存 活的任何基因工程生物指示劑微生物混合并一起孵育?；謴?fù)培養(yǎng)基50可以包含提供微生 物的萌發(fā)、代謝和后續(xù)生長(zhǎng)所需的含水培養(yǎng)基或含水溶液。該含水培養(yǎng)基或含水溶液可以 是緩沖的。指示酶，如果是作為已由任何存活的基因工程生物指示劑微生物中的報(bào)告基因 產(chǎn)生的結(jié)果而存在，接觸酶底物，導(dǎo)致形成酶修飾產(chǎn)物，其具有可檢測(cè)的顏色或熒光或其他 特征，如pH變化。
[0077] 酶底物可以包括一種物質(zhì)或多種物質(zhì)的混合物，其在被指示酶作用時(shí)轉(zhuǎn)化成酶修 飾產(chǎn)物。通常，酶修飾產(chǎn)物可以包括發(fā)光、熒光或有色物質(zhì)?；蛘?，酶底物可以包括一種或 多種化合物，該化合物在被酶作用時(shí)，可以得到產(chǎn)物（例如，活性中間體或能夠改變培養(yǎng)基 的pH的物質(zhì)），該產(chǎn)物與另外的化合物或組成反應(yīng)以生成發(fā)光、熒光或有色物質(zhì)。
[0078] 有兩種基礎(chǔ)類型的酶底物可以用于檢測(cè)特異性指示酶。第一種類型的酶底物可 以是熒光的或生色的，并且可以給予化學(xué)通式，如AB。當(dāng)被指示酶作用時(shí)，AB可以分解 為A+B。B例如可以是熒光的或有色的。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)B化合物可以一起反 應(yīng)以生成熒光或有色信號(hào)。這種類型的熒光底物的具體實(shí)例可以是4-甲基傘形酮基磷 酸酯（4-methylumbelliferylphosphate)。在指示酶磷酸酶的存在下，底物可以被分解 為4-甲基傘形酮和磷酸酯。這種類型的其他熒光底物可以包括4-甲基傘形酮基、7-酰 氨基-4-甲基香豆素、吲哚酚和熒光素的衍生物。這種類型的生色底物的實(shí)例可以是 5_溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯。在磷酸酶的存在下，底物可以分解成靛藍(lán)和磷酸酯。這種 類型的其他生色底物可以包括5-溴-4-氯-3-吲哚基、硝基酚和酚酞的衍生物。
[0079] 第二種類型的酶底物可以給予化學(xué)通式⑶，例如，其可以被特異酶轉(zhuǎn)化為C+D。然 而，C和D可以都不是熒光的或有色的，但是D可以能夠與化合物Z進(jìn)一步反應(yīng)以生成熒光 化合物或有色化合物，因此顯示酶活性。這種類型的具體熒光實(shí)例可以為氨基酸賴氨酸。在 酶賴氨酸脫羧酶的存在下，賴氨酸可以損失一分子的二氧化碳。賴氨酸的剩余部分則可以 被稱為尸胺，其是強(qiáng)堿性的?；A(chǔ)指示劑如4-甲基傘形酮可以被并入，并且在強(qiáng)堿的存在 下可以發(fā)熒光。這種類型的生色底物可以是2-萘基磷酸酯。指示酶磷酸酶可以與酶底物 反應(yīng)生成萘酚。釋出的萘酚可以與含有1-重氮基-4-苯甲?；被?2, 5-二乙 氧基苯的生色試劑反應(yīng)以產(chǎn)生紫色。
[0080] 酶底物可以包括熒光化合物，在本文中定義為能夠被酶修飾（例如通過水解）以 提供明顯改變的或增強(qiáng)的熒光的衍生熒光體的化合物。
[0081] 焚光化合物本身可以是非焚光或變焚光（meta-fluorescent)(即，以與相應(yīng)的酶 修飾產(chǎn)物明顯不同的方式發(fā)熒光，例如，通過顏色或者強(qiáng)度），并且適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)和檢測(cè) 波長(zhǎng)可以用于將通過酶修飾顯示的熒光信號(hào)與可以存在的任何其他信號(hào)分開。
[0082] 對(duì)于多種來源的指示酶可以使用許多酶底物。這些可以包括熒光4-甲基傘形酮 基衍生物（可水解成4-甲基傘形酮）；7_氨基-4-甲基香豆素的衍生物；二乙?；鶡晒馑?衍生物；和熒光胺。
[0083] 可以用作酶底物的4-甲基傘形酮基衍生物可以包括：4_甲基傘形酮基-2-乙 酰氨基-4,6-0-苯亞甲基-2-脫氧-0-D-吡喃葡萄糖苷；4-甲基傘形酮基乙酸酯；4-甲 基傘形酮基-N-乙?；?0-D-氨基半乳糖苷；4-甲基傘形酮基-N-乙?；?a-D-氨 基葡萄糖苷；4-甲基傘形酮基-N-乙?；?0-D-氨基葡萄糖苷；2'-(4-甲基傘形酮 基）-a-D-N-乙?；窠?jīng)氨酸；4-甲基傘形酮基-a-L-阿拉伯呋喃糖苷；4-甲基傘形酮 基-a-L-阿拉伯糖苷；4-甲基傘形酮基丁酸酯；4-甲基傘形酮基-0 -D-纖維二糖糖苷； 甲基傘形酮基-0 -D-N，N' -二乙?；鶜ざ擒眨?-甲基傘形酮基反油酸酯；4-甲基傘形酮 基-0-D-巖藻糖苷；4-甲基傘形酮基-a-L-巖藻糖苷；4-甲基傘形酮基-0-L-巖藻糖 苷；4-甲基傘形酮基-a-D-半乳糖苷；4-甲基傘形酮基-D-半乳糖苷；4-三氟甲基傘 形酮基-D-半乳糖苷；6, 8-二氟-4-甲基傘形酮基-D-半乳糖苷；4-甲基傘形酮 基-a-D-葡萄糖苷；4-甲基傘形酮基-D-葡萄糖苷；4-甲基傘形酮基-7, 6-硫代-2-乙 酰氨基-2-脫氧-P-D-葡萄糖苷；4-甲基傘形酮基-0 -D-葡糖苷酸；6, 8-二氟-4-甲基 傘形酮基-0-D-葡糖苷酸；4-甲基傘形酮基對(duì)胍基苯甲酸酯；4-甲基傘形酮基庚酸酯； 4-甲基傘形酮基-a-D-吡喃甘露糖苷；4-甲基傘形酮基-D-吡喃甘露糖苷；4-甲基 傘形酮基油酸酯；4-三氟甲基傘形酮基油酸酯；4-甲基傘形酮基棕櫚酸酯；4-甲基傘形酮 基磷酸酯；4-甲基傘形酮基丙酸酯；4-甲基傘形酮基硬脂酸酯；4-甲基傘形酮基硫酸酯； 4-甲基傘形酮基-f3 -D-N，N'，N〃-三乙?；鶜と?；4' -甲基傘形酮基-2, 3, 5-三-f3 -苯 甲酰基-a-L-阿拉伯呋喃糖苷；4-甲基傘形酮基-三甲基銨肉桂酸氯化物；4-甲基傘 形酮基-4-胍基苯甲酸酯；和4-甲基傘形酮基-D-木糖苷。
[0084] 可以用作酶底物的7-酰氨基-4-甲基香豆素衍生物可以包括：L_丙氨酸-7-酰 氨基-4-甲基香豆素；L-脯氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素；L-酪氨酸-7-酰氨基-4-甲 基香豆素；L-精氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素；L-瓜氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素； L-亮氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素；L-甲硫氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素；L-焦谷 氨酸7-酰氨基-4-甲基香豆素；L-天冬氨酸0 -(7-酰氨基-4-甲基香豆素）；L-谷氨酸 1- (7-酰氨基-4-甲基香豆素）；L-苯丙氨酸-7-酰氨基-甲基香豆素；和7-戊二?；?苯 丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素。
[0085] 可以用作酶底物的7-酰氨基-4-甲基香豆素的肽衍生物可以包括： N-t-BOC-IIe-Glu-Gly-Arg7-酰氨基-4-甲基香豆素；N-t-BOC-Leu-Ser-Thr-Arg 7_酰氨基-4-甲基香豆素；N-CBZ-Phe-Arg7-酰氨基-4-甲基香豆素；N-琥珀酰 基-Leu-Tyr-7-酰氨基-4-甲基香豆素；Gly-Pro7-酰氨基-4-甲基香豆素；