一種蛋白質(zhì)快速熒光標記的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)，具體是一種蛋白質(zhì)快速熒光標記的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 活細胞水平上對目的蛋白質(zhì)的熒光標記是研宄目的蛋白質(zhì)活動和特性的重要手 段，GFP(GreenFluorescentProtein，綠色焚光蛋白）及其衍生物被廣泛的應(yīng)用于活細胞 熒光顯微成像。通常采取的策略是將全長的GFP融合到目的蛋白質(zhì)的N-末端或者C-末端， 以達到引入熒光標記的目的。但是對于很多特定的蛋白質(zhì)而言，GFP融合于其中往往會導 致其結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞或者GFP本身難以正確折疊，從而影響了對目的蛋白的研宄。另 一方面，通過將全長的GFP融合于目的蛋白引入熒光標記，GFP往往需要一個成熟的過程， 這影響了對目的蛋白的實時監(jiān)測。
[0003] Split-GFP是將GFP切開后分別融合于目的蛋白，利用GFP分開部分能自發(fā)結(jié)合的 性質(zhì)從而引入熒光標記。目前對于split-GFP的應(yīng)用主要是將超折疊GFP上的末端的一條 0-strand切下，或者借助circularpermutation的手段將另外10條0-strand中的一條 切下，然后融合表達在所要研宄的目標蛋白的C-末端，通過加入體外制備的GFP1-10而引 入熒光，以此來盡量的減小熒光標記對所研宄系統(tǒng)的干擾。這限制了熒光標記的位置只能 是目的蛋白的N-末端或者C-末端。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種可在蛋白質(zhì)任何一個loop區(qū)中引入熒光標記的蛋白 質(zhì)快速熒光標記的方法，以解決上述【背景技術(shù)】中提出的問題。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0006] -種對蛋白質(zhì)進行快速熒光標記的方法，將一段能與GFP帽子探針特異性結(jié)合的 小肽GFP10-11融合于目的蛋白的loop區(qū)中，融合表達后加入體外制備的可溶的GFP帽子 探針，GFP帽子探針即為GFP1-9探針，通過GFP1-9探針與小肽GFP10-11非共價作用特異 性結(jié)合；結(jié)合后產(chǎn)生熒光，從而引入熒光標記，小肽GFP10-11的氨基酸序列如序列表中的 序列2所示。
[0007] 作為本發(fā)明進一步的方案：所述GFP1-9探針的制備方法：GFP1-9探針是由氨基酸 序列如序列表中的序列1所示的綠色熒光蛋白經(jīng)過分子生物學酶酶切而制備得到，酶切后 得到的GFP1-9探針的氨基酸序列如序列表中的序列3所示。
[0008] 作為本發(fā)明進一步的方案：還能用于在細胞表面對蛋白質(zhì)進行快速熒光標記。
[0009] 作為本發(fā)明進一步的方案：用于細胞表面蛋白的表達水平的定量，用于示蹤細胞 表面蛋白的內(nèi)化和多聚化，用于篩選細胞表面蛋白內(nèi)化和多聚化相關(guān)的藥物。
[0010] 作為本發(fā)明進一步的方案：所述序列還包括其衍生和/或突變序列。
[0011] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明公開了該熒光標記的方法，GFP1-9 探針的制備方法，以及在溶液和細胞中的一般蛋白質(zhì)熒光標記的方法。該熒光標記方法的 特點有：（1)特異性高，且基本無背景熒光。GFP1-9探針本身基本不能被激發(fā)出熒光，只有GFP1-9探針與GFP10-11特異性結(jié)合后才能產(chǎn)生熒光；（2)使用方便，標記前后不需要反復(fù) 洗掉多余探針，只需直接加入即可，而且可在一般的鹽溶液中反應(yīng)，無需特殊條件；（3)結(jié) 合速度快，lOmin內(nèi)可完成結(jié)合并可激發(fā)出熒光，能夠?qū)崿F(xiàn)快速的標記；(4)其激發(fā)波長峰 值為482nm左右，發(fā)生波長峰值為507nm左右，與綠色熒光蛋白（GFP)基本一致，可采用常 規(guī)的熒光顯微鏡、熒光光譜儀檢測?？梢詫崿F(xiàn)熒光標記時間的控制，標記濃度的控制，而且， 該熒光標記方法可以盡可能的減小對目的蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響。該方法另一大優(yōu)勢是可 特異性的標記細胞表面蛋白，實現(xiàn)對細胞表面蛋白的定量以及示蹤。
【附圖說明】
[0012] 圖1是本發(fā)明的探針用于在泛素中引入熒光標記的熒光光譜圖；
[0013] 圖2是本發(fā)明的標記方法應(yīng)用于一種G蛋白偶聯(lián)受體GPR17的細胞外區(qū)域引入熒 光標記圖。
【具體實施方式】
[0014] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的 實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0015] 實施例1
[0016] 該標記方法在溶液中可溶性蛋白質(zhì)上的應(yīng)用
[0017] a、在大腸桿囷中表達的綠色灰光蛋白如序列表中的序列1所不；表達囷種： BL21*(DE3)，載體：pET-15b。在 37°C搖至 0D= 0.8,加入ImMIPTG，37°C誘導 4h。高速離 心收菌；
[0018]b、用NiA緩沖液重懸菌體后高壓裂菌，，其中NiA緩沖液包括20mM三羥甲基氨 基甲燒（簡稱為Tris)與200mMNaCl，pH為8. 0。高速離心收集上清，過Ni柱，以60mL到 200mM咪唑梯度洗脫。收集組分用超濾管濃縮換NiA緩沖液至QA緩沖液，其中QA緩沖 液包括20mM三羥甲基氨基甲烷，pH為8. 0。過GE公司的SourceQ柱，梯度80mL-30%Q B緩沖液，其中QB緩沖液包括20mM三羥甲基氨基甲烷與1MNaCl，且其pH為8. 0 ;收集對 應(yīng)組分；
[0019]c、過完SourceQ柱后的樣品脫鹽至GE公司的苯甲脒親和層析柱中的上樣緩沖 液，其中上樣緩沖液包括20mM三羥甲基氨基甲烷與500mMNaCl，其pH為7. 4 ;即胰酶酶切 緩沖液。50yM的sfGFP樣品加入10U/mL的胰酶酶切緩沖液，在37°C下酶切0. 5h。過苯 甲脒親和層析柱，收集流出液，用超濾管換成QA緩沖液，其中QA緩沖液包括20mM三羥甲 基氨基甲烷，且其pH為8.0。過SourceQ柱，梯度60mL-20%QB緩沖液，其中QB緩沖 液包括20mM三羥甲基氨基甲烷與1MNaCl，且pH為8. 0 ;收集洗脫組分，加入鹽酸胍固體至 鹽酸胍在溶液中的終濃度為4M，在4°C下放置2h，過分子篩S100色譜柱，其中分子篩S100 色譜柱的緩沖液包括50mM三羥甲基氨基甲烷、300mMNaCl與3MGdHCl，且pH為8. 0 ;收 集組分，濃縮至約5mL，過夜透析，過夜透析時的緩沖液包括50mM三羥甲基氨基甲烷、lOOmM NaCl與體積分數(shù)為10%的甘油，且pH為8. 0 ;過分子篩S100色譜柱，其中分子篩S100色譜 柱的緩沖液包括50mM三羥甲基氨基甲烷、100mMNaCl與質(zhì)量分數(shù)為10%的甘油，且pH為 8. 0 ;得到GFP1-9,收集后濃縮，分裝保存；
[0020] d、GFP10-11在泛素中的插入：通過聚合酶鏈式反應(yīng)在泛素的Leu8和Lys9兩 個氨基酸之間插入小肽GFP10-11對應(yīng)的DN