一種定向自標記免疫納米微球的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種定向自標記免疫納米微球的制備方法，所述方法包括以下步驟：對納米顆粒進行改性和定向自標記免疫納米微球的制備。本發(fā)明制備的定向自標記免疫納米微球能夠與抗體Fc區(qū)高特異性結(jié)合，使與納米微球結(jié)合的抗體暴露出可結(jié)合抗原的Fab區(qū)域，從而提高免疫微球的生物活性，提高檢測的靈敏度。
【專利說明】一種定向自標記免疫納米微球的制備方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種定向自標記免疫納米微球的制備方法及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]膠乳增強免疫比池法(particle-enhancedturbidimetric immol/Lune-assay,PETIA)是近年來出現(xiàn)的一種較為穩(wěn)定、準確的體液蛋白均相免疫比濁檢測方法，目前已廣泛應(yīng)用于臨床診斷領(lǐng)域。PETIA法是在高分子膠乳微球的表面交聯(lián)特異性抗體，當交聯(lián)有抗體的微球與抗原結(jié)合后，在短時間內(nèi)會迅速聚集在一起，改變了反應(yīng)液的散光性能或透光性能。而且，反應(yīng)液散光性能或透光性能(即吸光度)的改變與被測抗原的濃度有較強的相關(guān)性，在一定范圍內(nèi)可以反映被測抗原的濃度。
[0003]PETIA檢測方法是在均相反應(yīng)體系中進行抗原、抗體反應(yīng)及結(jié)果的測定。抗原、抗體反應(yīng)后，直接測定反應(yīng)液的散光信號值或吸光度，省卻了 ELISA法反復(fù)孵育和洗板等煩瑣操作步驟，幾分鐘就能獲得結(jié)果，省時省力。此外，納米免疫比濁法操作步驟的簡化也相應(yīng)地避免了許多人為操作因素和試劑、環(huán)境等外界因素的干擾，穩(wěn)定性和重復(fù)性都較好，能較真實地反映被測物質(zhì)的含量。免疫比濁法的靈敏度雖然略低于ELISA方法，但足以檢測到健康人樣本中許多標志蛋白的下限值，可完全滿足臨床檢測要求。
[0004]目前，PETIA檢測試劑所采用的膠乳顆粒多為惰性微球、羧基化微球，氨基化微球也有見報道。國外已有多家公司提供納米級表面羧基化、氨基化修飾的微球粒子原料，并廣泛應(yīng)用于PETIA。這些廠家提供的粒子直徑從20nm-4000nm，檢測的靈敏度得到了較大的改善，檢測靈敏度達到1.0 ng/ml。但由于膠乳顆?？赏瑫r與抗體的結(jié)合區(qū)(Fab區(qū))以及可結(jié)晶區(qū)域(Fe區(qū))結(jié)合，使部分抗原結(jié)合區(qū)(Fab區(qū))失活，這對抗體的特異性及濃度要求較高，通常需要結(jié)合高純度的特異性抗體。同時，還存在臨床檢測線性范圍窄，干擾因素多，實驗穩(wěn)定性差等缺點，大大地限制了免疫比濁法在臨床上的廣泛應(yīng)用。
[0005]Protein A是從A型金黃色葡萄球菌分離而得的一種細胞壁蛋白，與多數(shù)哺乳動物的IgG Fe段結(jié)合(包括:人、山羊、綿羊、兔、豚鼠、馬、豬、猴、小鼠等)，不與狗IgG結(jié)合，不結(jié)合人IgM、IgDjP IgA，重組表達的蛋白A，親和力、穩(wěn)定性等方面更好。
[0006]Protein G是從G型鏈球菌分離而得的細胞壁蛋白，能與多種動物(兔、大鼠、豚鼠、牛、貓、小鼠、鳥、羊)的IgG的Fe區(qū)結(jié)合，以及與小鼠血清白蛋白發(fā)生結(jié)合，但不能與IgA和IgM結(jié)合。最為常用的是改造后重組表達的Protein G，具有2_5個結(jié)合結(jié)構(gòu)域，親和力、特異性及穩(wěn)定性顯著。
[0007]金黃色葡萄球菌蛋白A( SPA)中的Z結(jié)構(gòu)域，又叫免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其生物穩(wěn)定性高，可耐受羥銨和溴化氫處理。首尾相連的兩個Z結(jié)構(gòu)域，被命名為ZZ結(jié)構(gòu)域，其具有獨特的反3 α螺旋結(jié)構(gòu)，可特異性地與抗體Fe區(qū)域結(jié)合。同時ZZ結(jié)構(gòu)區(qū)具有與SPA相類似的抗體結(jié)合容量以及更高的穩(wěn)定性，可以耐受工業(yè)純化中苛刻的環(huán)境，已廣泛應(yīng)用于外源蛋白的可溶表達及免疫檢測、抗體純化等領(lǐng)域。
[0008]因此,應(yīng)用ZZ-多肽、protein A、protein G、protein A/G對高分子膠乳納米微球表面進行改性，利用這些能特異性結(jié)合抗體Fe區(qū)的特性，使與生物納米微球結(jié)合的抗體充分暴露出可結(jié)合抗原的Fab區(qū)域，從而提高免疫微球的生物活性，提高檢測的靈敏度。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種納米微球的制備方法，其制備出的定向自標記納米微球能夠與抗體Fe區(qū)高特異性地結(jié)合，使與納米微球結(jié)合的抗體暴露出可結(jié)合抗原的Fab區(qū)域，從而提高免疫微球的生物活性，提高檢測的靈敏度。
[0010]為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是:
一種定向自標記免疫納米微球的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟:
步驟一、對納米顆粒進行改性,并且改性后成為ZZ-多肽或protein A或protein G或protein A/G蛋白納米顆粒:
1)每10-20mg納米顆粒，直徑50-1000nm，加EDC10_200mg，納米顆粒和EDC的質(zhì)量比為1:1-1:10，在pH4-6的50mmol/L MES緩沖液中活化10-500分鐘；
2)加入ZZ-多妝、protein A> protein G 或 protein A/G 蛋白中的一種 0.1-10.0mg,納米顆粒與蛋白的質(zhì)量比為1:0.05-1:20，室溫放置0.1-2.0小時。
[0011]3)加入牛血清白蛋白，使牛血清白蛋白終濃度為0.1-10%,室溫反應(yīng)I小時，封閉納米顆粒上多余的空位；
4)離心去除上清，用等體積磷酸鹽緩沖液重懸。
[0012]步驟二、定向自標記免疫納米微球的制備:
1)把步驟一所得的改性納米顆粒用磷酸鹽緩沖液稀釋到0.1-2%的濃度；
2)向上述納米顆粒中加入特異性的抗體，使抗體終濃度為0.1-5.0mg/ml,室溫反應(yīng)1-2小時；
3)加入可以與ZZ-多肽、proteinA、protein G或protein A/G反應(yīng)的IgG或其它衍生物，室溫I小時封閉掉多余的ZZ-多肽、protein A、protein G或protein A/G的結(jié)合位點和非特異性結(jié)合位點；
4)離心洗滌上述納米顆粒即可得到相應(yīng)的特異性定向自標記免疫納米微球。
[0013]優(yōu)選的，所述步驟二為定向自標記免疫納米微球的制備:
1)把步驟一所得的改性納米顆粒用磷酸鹽緩沖液稀釋到0.1-2%的濃度；
2)向上述納米顆粒中加入特異性的抗體，使抗體終濃度為0.1-5.0mg/ml,室溫反應(yīng)1-2小時；
3)加入可以與ZZ-多肽、proteinA、protein G或protein A/G反應(yīng)的IgG或其它衍生物，室溫I小時封閉掉多余的ZZ-多肽、protein A、protein G或protein A/G的結(jié)合位點和非特異性結(jié)合位點；
優(yōu)選的，所述納米顆粒表面具有活性基團氨基、羧基、巰基、羥基、醛基中的一種。
[0014]優(yōu)選的，所述納米顆粒為ZZ-多肽、protein A、protein G或protein A/G蛋白制成的定向自標記納米顆粒。
[0015]本發(fā)明還提供了一種定向自標記免疫納米微球的應(yīng)用，所述定向自標記免疫納米微球應(yīng)用在膠乳增強免疫比濁測定中。
[0016]優(yōu)選的，應(yīng)用內(nèi)含有所述定向自標記免疫納米微球的試劑盒。
[0017]優(yōu)選的，所述試劑盒為用于對D- 二聚體進行比濁定量檢測的D- 二聚體比濁定量檢測試劑盒，所述D- 二聚體比濁定量檢測試劑盒包括Rl試劑和R2試劑；其中Rl試劑配方為50 mmol/L Tris,用鹽酸調(diào)節(jié)pH到8.0,再加入0.85%氯化鈉、2% PEG8000、0.1%疊氮鈉；所述R2試劑配方為將所述定向自標記免疫納米顆粒用50mmol/L Tris-Hcl,pH 8.0,2%BSA，0.1%疊氮鈉，1% NaCl緩沖液稀釋到0.1%。
[0018]優(yōu)選的，內(nèi)含有所述定向自標記免疫納米微球的試劑盒適用340nm-700nm波長的檢測。
[0019]優(yōu)選的，內(nèi)含有所述定向自標記免疫納米微球的試劑盒適用于透射儀和散射比濁儀。
[0020]所述步驟一的納米微球可以購自任何公司，也可自己制備，納米微球直徑20-4000nm，優(yōu)選直徑 50_1000nm。
[0021]所述步驟一中ZZ-多肽、protein A、protein G或protein A/G可購自任何公司，也可自己表達制備。
[0022]所述步驟一改性的原理如圖1所示，其基本原理是在酸性環(huán)境中，使用EDC活化納米顆粒表面羧基基團，活化的羧基基團可以快速和加入的蛋白進行結(jié)合，從而使納米顆粒表面得以改性。
[0023]步驟二定向自標記納米免疫顆粒的制備原理如圖2所示，其基本原理是利用ZZ-多肽、protein A、protein G或protein A/G可特異且快速結(jié)合抗體Fe端的特點，從而使抗體Fab端能定向排列在改性后的納米顆粒表面。
[0024]本發(fā)明還提供了定向自標記免疫納米微球的應(yīng)用，即將所述定向自標記免疫納米微球應(yīng)用在膠乳增強免疫比濁測定中。
[0025]進一步的，應(yīng)用內(nèi)含有所述定向自標記免疫納米微球的D-二聚體比濁定量檢測試劑盒對D- 二聚體進行比濁定量檢測。
[0026]進一步的，所述D- 二聚體比濁定量檢測試劑盒有Rl試劑和R2試劑；其中Rl試劑配方為50mmol/L Tris,用鹽酸調(diào)節(jié)pH到8.0,再加入0.85%氯化鈉、2% PEG8000、0.1%疊氮鈉；R2試劑配方為將所述定向自標記免疫納米顆粒用50mmol/L Tris-Hcl, pH 8.0,2%BSA，0.1%疊氮鈉，1% NaCl緩沖液稀釋到0.1%。
[0027]進一步的，所述的定向自標記免疫納米微球的應(yīng)用，其特征在于，內(nèi)含有所述定向自標記免疫納米微球的試劑盒適用340nm-700nm波長的檢測。
[0028]進一步的，所述的定向自標記免疫納米微球的應(yīng)用，其特征在于，內(nèi)含有所述定向自標記免疫納米微球的試劑盒適用于透射儀和散射比濁儀。
[0029]本發(fā)明提供一種定向自標記免疫納米微球的制備方法及其應(yīng)用，本方法制備的定向自標記納米微球能夠與抗體Fe區(qū)高特異性地結(jié)合，使與納米微球結(jié)合的抗體暴露出可結(jié)合抗原的Fab區(qū)域，從而提高免疫微球的生物活性，提高檢測的靈敏度，并應(yīng)用在D-二聚體定量檢測中。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]附圖1是對納米顆粒進行改性的示意圖。
[0031]附圖2是定向自標記納米免疫顆粒的制備原理示意圖。
[0032]附圖3是Protein A納米顆粒結(jié)構(gòu)示意圖。
[0033]附圖4是葡萄球菌A蛋白ZZ結(jié)合位點納米顆粒上的ZZ-domain。
[0034]附圖5是定向自標記免疫納米微球結(jié)構(gòu)圖。
[0035]附圖6是Protein A定向自標記免疫納米微球作用機理圖。
[0036]附圖7是實施例1中D- 二聚體定標曲線

【具體實施方式】
[0037]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的描述，但本發(fā)明并不限于這些實施例。
[0038]實施例1:ZZ-多肽納米顆粒制備，并制成定向自標記D-二聚體納米免疫顆粒，用于D-二聚體的檢測。
[0039]步驟一:對納米顆粒進行改性
1)1mg納米顆粒，直徑150nm，羧基基團，加EDC lOOmg，納米顆粒和EDC的質(zhì)量比為1:10.在ρΗ4.5的50mmol/L MES緩沖液中活化60分鐘；
2)加入ZZ-多肽lmg，室溫放置2小時。
[0040]3)加入牛血清白蛋白，使牛血清白蛋白終濃度為1%，到上述納米顆粒中，室溫反應(yīng)I小時，封閉納米顆粒上多余的空位；
4)12000rpm離心去除上清,用等體積50mmol/L, pH7.4磷酸鹽緩沖液重懸。
[0041]步驟二:定向自標記免疫納米微球的制備
1)把步驟一所得的改性納米顆粒用等體積50mmol/L,pH7.4磷酸鹽緩沖液稀釋到0.1%的濃度；
2)向上述納米顆粒中加入D-二聚體抗體,使D- 二聚體抗體終濃度為0.5mg/ml,室溫反應(yīng)2小時；
3)加入10%的牛血清，牛血清終濃度為5%，室溫I小時封閉掉多余的TL、proteinA、protein G或protein A/G的結(jié)合位點和非特異性結(jié)合位點；
4)離心洗滌上述納米顆粒即可得到相應(yīng)的特異性的定向自標記免疫納米微球。
[0042]D- 二聚體測定試劑盒制備及檢測
其中Rl試劑配方為50mmol/L Tris,用鹽酸調(diào)節(jié)pH到8.0，再加入0.85%氯化鈉、2% PEG8000、0.1%疊氮鈉；R2試劑配方為將所述定向自標記免疫納米顆粒用50mmol/LTris-Hcl,pH 8.0,2% BSA，0.1%疊氮鈉，1% NaCl緩沖液稀釋到0.1%。D-二聚體校準品為外購校準品，濃度為8mg/L,用生理鹽水稀釋成0mg/L，0.4mg/L, 1.6mg/L, 4.8mg/L, 8mg/L,在生化分析儀上進行定標，見附圖7
實施例2:Protein G蛋白納米顆粒制備，并定向自標記D-二聚體納米免疫顆粒,用于D-二聚體的檢測。
[0043]步驟一:對納米顆粒進行改性
l)15mg納米顆粒，直徑250nm，氨基基團，加EDC 120mg，納米顆粒和EDC的質(zhì)量比為1:8.在pH5的50mmol/L MES緩沖液中活化120分鐘；2)加入protein G蛋白3mg,室溫放置2小時。
[0044]3)加入牛血清白蛋白，使牛血清白蛋白終濃度為0.5%，到上述納米顆粒中，室溫反應(yīng)I小時，封閉納米顆粒上多余的空位；
4)12000rpm離心去除上清,用等體積50mmol/L, pH8.0磷酸鹽緩沖液重懸。
[0045]步驟二:定向自標記免疫納米微球的制備
1)把步驟一所得的改性納米顆粒用等體積50mmol/L,pH8.0磷酸鹽緩沖液稀釋到0.1%的濃度；
2)向上述納米顆粒中加入D-二聚體抗體，使D-二聚體抗體終濃度為lmg/ml，室溫反應(yīng)2小時；
3)加入10%的牛血清，終濃度為5%，室溫I小時封閉掉多余的ZZ、proteinA、proteinG、protein A/G的結(jié)合位點和非特異性結(jié)合位點；
4)離心洗滌上述納米顆粒即可得到相應(yīng)的特異性的定向自標記免疫納米微球。
[0046]D- 二聚體測定試劑盒制備及檢測
其中Rl試劑配方為50mmol/L Tris,用鹽酸調(diào)節(jié)pH到8.0，再加入0.85%氯化鈉、2% PEG8000、0.1%疊氮鈉；R2試劑配方為將所述定向自標記免疫納米顆粒用50mmol/LTris-Hcl,pH 8.0,2% BSA，0.1%疊氮鈉，1% NaCl緩沖液稀釋到0.1%。D-二聚體校準品為外購校準品，濃度為8mg/L,用生理鹽水稀釋成Omg/L, 0.4mg/L, 1.6mg/L, 4.8mg/L, 8mg/L,進行定標。
[0047]實施例3:Protein A蛋白納米顆粒制備，并定向自標記D- 二聚體納米免疫顆粒，用于D-二聚體的檢測。
[0048]步驟一:對納米顆粒進行改性
1)20mg納米顆粒，直徑300nm，羧基基團，加EDC180mg，納米顆粒和EDC的質(zhì)量比為1:9.在ρΗ5.5的50mmol/L MES緩沖液中活化100分鐘；
2)加入proteinA蛋白8mg,室溫放置2小時。
[0049]3)加入牛血清白蛋白，使牛血清白蛋白終濃度為1%，到上述納米顆粒中，室溫反應(yīng)I小時，封閉納米顆粒上多余的空位；
4)12000rpm離心去除上清,用等體積50mmol/L, pH8.0磷酸鹽緩沖液重懸。
[0050]步驟二:定向自標記免疫納米微球的制備
1)把步驟一所得的改性納米顆粒用等體積50mmol/L,pH8.0磷酸鹽緩沖液稀釋到0.1%的濃度；
2)向上述納米顆粒中加入D-二聚體抗體，使D- 二聚體抗體終濃度為2mg/ml，室溫反應(yīng)2小時；
3)加入10%的牛血清，終濃度為5%，室溫I小時封閉掉多余的ZZ、proteinA、proteinG、protein A/G的結(jié)合位點和非特異性結(jié)合位點；
4)離心洗滌上述納米顆粒即可得到相應(yīng)的特異性的定向自標記免疫納米微球。
[0051]D-二聚體測定試劑盒制備及檢測
其中Rl試劑配方為50mmol/L Tris,用鹽酸調(diào)節(jié)pH到8.0，再加入0.85%氯化鈉、2% PEG8000、0.1%疊氮鈉；R2試劑配方為將所述定向自標記免疫納米顆粒用50mmol/LTris-Hcl,pH 8.0,2% BSA，0.1%疊氮鈉，1% NaCl緩沖液稀釋到0.1%。D-二聚體校準品為外購校準品，濃度為8mg/L,用生理鹽水稀釋成Omg/L, 0.4mg/L, 1.6mg/L, 4.8mg/L, 8mg/L,進行定標。
[0052]本發(fā)明提供一種定向自標記納米微球的制備方法，該方法制備的定向自標記納米微球能與抗體Fe區(qū)域特異性地結(jié)合，暴露出結(jié)合抗原的Fab區(qū)域，從而提高免疫微球的生物活性。
[0053]本發(fā)明制備的定向自標記免疫納米微球應(yīng)用到臨床免疫比濁檢測后，能明顯提高免疫比濁檢測方法的靈敏度。
[0054]以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種定向自標記免疫納米微球的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟: 步驟一、對納米顆粒進行改性,并且改性后成為ZZ-多肽或protein A或protein G或protein A/G蛋白納米顆粒: 1)每10-20mg納米顆粒，直徑50-1000nm，加EDC10_200mg，納米顆粒和EDC的質(zhì)量比為1:1-1:10，在pH4-6的50mmol/L MES緩沖液中活化10-500分鐘； 2)加入ZZ-多妝、protein A> protein G 或 protein A/G 蛋白中的一種 0.1-10.0mg,納米顆粒與蛋白的質(zhì)量比為1:0.05-1:20，室溫放置0.1-2.0小時； 3)加入牛血清白蛋白，使牛血清白蛋白終濃度為0.1-10%，室溫反應(yīng)I小時，封閉納米顆粒上多余的空位； 4)離心去除上清，用等體積磷酸鹽緩沖液重懸。
2.步驟二、定向自標記免疫納米微球的制備: 1)把步驟一所得的改性納米顆粒用磷酸鹽緩沖液稀釋到0.1-2%的濃度； 2)向上述納米顆粒中加入特異性的抗體，使抗體終濃度為0.1-5.0mg/ml,室溫反應(yīng)1-2小時； 3)加入可以與ZZ-多肽 、proteinA、protein G或protein A/G反應(yīng)的IgG或其它衍生物，室溫I小時封閉掉多余的ZZ-多肽、protein A、protein G或protein A/G的結(jié)合位點和非特異性結(jié)合位點； 4)離心洗滌上述納米顆粒即可得到相應(yīng)的特異性定向自標記免疫納米微球。
3.如權(quán)利要求1所述的定向自標記免疫納米微球的制備方法，其特征在于，所述步驟二為定向自標記免疫納米微球的制備: 1)把步驟一所得的改性納米顆粒用磷酸鹽緩沖液稀釋到0.1-2%的濃度； 2)向上述納米顆粒中加入特異性的抗體，使抗體終濃度為0.1-5.0mg/ml,室溫反應(yīng)1-2小時； 3)加入可以與ZZ-多肽、proteinA、protein G或protein A/G反應(yīng)的IgG或其它衍生物，室溫I小時封閉掉多余的ZZ-多肽、protein A、protein G或protein A/G的結(jié)合位點和非特異性結(jié)合位點； 如權(quán)利要求1所述的定向自標記免疫納米微球的制備方法，其特征在于，所述納米顆粒表面具有活性基團氨基、羧基、巰基、羥基、醛基中的一種。
4.如權(quán)利要求1所述的定向自標記免疫納米微球的制備方法，其特征在于，所述納米顆粒為ZZ-多肽、protein A、protein G或protein A/G蛋白制成的定向自標記納米顆粒。
5.如權(quán)利要求1到4任一所述定向自標記免疫納米微球的應(yīng)用，其特征在于，所述定向自標記免疫納米微球應(yīng)用在膠乳增強免疫比濁測定中。
6.如權(quán)利要求5所述的定向自標記免疫納米微球的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用內(nèi)含有所述定向自標記免疫納米微球的試劑盒。
7.如權(quán)利要求6所述的定向自標記免疫納米微球的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑盒為用于對D- 二聚體進行比濁定量檢測的D- 二聚體比濁定量檢測試劑盒，所述D- 二聚體比濁定量檢測試劑盒包括Rl試劑和R2試劑；其中Rl試劑配方為50 mmol/L Tris,用鹽酸調(diào)節(jié)pH到8.0,再加入0.85%氯化鈉、2% PEG8000、0.1%疊氮鈉；所述R2試劑配方為將所述定向自標記免疫納米顆粒用50mmol/L Tris-Hcl,pH 8.0,2% BSA，0.1%疊氮鈉，1% NaCl緩沖液稀釋到0.1%。
8.如權(quán)利要求6所述的定向自標記免疫納米微球的應(yīng)用，其特征在于，內(nèi)含有所述定向自標記免疫納米微球的試劑盒適用340nm-700nm波長的檢測。
9.如權(quán)利要求7所述的定向自標記免疫納米微球的應(yīng)用，其特征在于，內(nèi)含有所述定向自標記免疫納米微 球的試劑盒適用于透射儀和散射比濁儀。
【文檔編號】G01N33/532GK104049079SQ201310082103
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月14日
【發(fā)明者】王濱, 趙年福, 吳一凡, 杜薇薇 申請人:蘇州德沃生物技術(shù)有限公司