熒光微球標(biāo)記克倫特羅單克隆抗體的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，公開(kāi)一種熒光微球標(biāo)記克倫特羅單克隆抗體的方法，具體為：氨基修飾的熒光微球與活潑酯化的生物素偶聯(lián)，將鏈霉親和素與上述偶聯(lián)物以1000:1的比例混合反應(yīng)后，得到熒光微球與生物素-鏈霉親和素的偶聯(lián)物，最后將生物素化的克倫特羅單克隆抗體加入到熒光微球-生物素-鏈霉親和素的偶聯(lián)物溶液中反應(yīng)即可得到目標(biāo)產(chǎn)物。本發(fā)明得到的熒光微球標(biāo)記克倫特羅單克隆抗體的新型偶聯(lián)物能有效應(yīng)用于克倫特羅熒光微球試紙條中，相應(yīng)地提高了試紙條的特異性、靈敏度，從而能快速準(zhǔn)確地定性且定量檢測(cè)動(dòng)物性食品中克倫特羅的殘留量。
【專利說(shuō)明】熒光微球標(biāo)記克倫特羅單克隆抗體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品安全中β2-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種用熒光微球標(biāo)記克倫特羅單克隆抗體的偶聯(lián)物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]克倫特羅(clenbuterol)作為一種β 受體激動(dòng)劑能起到調(diào)節(jié)交感神經(jīng)興奮、松弛氣管平滑肌的功能，常以其鹽酸鹽的形式使用，在臨床上能用于人和動(dòng)物哮喘類病癥的治療。但用超過(guò)治療劑量的鹽酸克倫特羅長(zhǎng)期給動(dòng)物飼喂時(shí)，它在動(dòng)物體內(nèi)具有營(yíng)養(yǎng)再分配作用，能顯著提高瘦肉率及減少脂肪率，故很多不法分子常將鹽酸克倫特羅作為飼料添加劑用于動(dòng)物飼養(yǎng)中，從而使肉品瘦肉率增加、提早上市、降低成本。鹽酸克倫特羅的濫用勢(shì)必會(huì)在畜產(chǎn)品中殘留，而給人類的健康帶來(lái)相當(dāng)大的威脅。
[0003]免疫層析技術(shù)由于具有快速、準(zhǔn)確、方便的優(yōu)點(diǎn)，在鹽酸克倫特羅及其替代物的檢測(cè)應(yīng)用上已得到很大的推廣，它是以抗原抗體間的特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過(guò)標(biāo)記物對(duì)某種物質(zhì)進(jìn)行定性或定量檢測(cè)的研究手段。目前，常用于免疫層析技術(shù)檢測(cè)鹽酸克倫特羅的標(biāo)記物有膠體金、熒光微球等，這些標(biāo)記物保持了克倫特羅單克隆抗體的活性，而標(biāo)記物的活性不受影響，當(dāng)它與相應(yīng)抗原反應(yīng)后，可以直接測(cè)定復(fù)合物中的標(biāo)記物，直接對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行定性甚至定量分析。
[0004]目前，標(biāo)記物與抗體之間大多是通過(guò)共價(jià)鍵或物理吸附的方式直接偶聯(lián)，特別是β -受體激動(dòng)劑抗體的標(biāo)記。該種偶聯(lián)方式有偶聯(lián)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，但這種偶聯(lián)方式，由于抗體任意與標(biāo)記物結(jié)合使一些抗原結(jié)合位點(diǎn)被屏蔽，即所謂的空間位阻，導(dǎo)致抗體標(biāo)記效率和標(biāo)記物的分散性降低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供熒光微球標(biāo)記克倫特羅單克隆抗體的方法，該方法減少了抗體與熒光微球相連的空間位阻，提高了標(biāo)記效率高，制得的偶聯(lián)物能表現(xiàn)出良好的膠體穩(wěn)定性和結(jié)合性能。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
熒光微球標(biāo)記克倫特羅單克隆抗體的方法:(I)氨基修飾的熒光微球與活潑酯化的生物素在PBS溶液中偶聯(lián)反應(yīng)2 h得到熒光微球-生物素偶聯(lián)物，再離心、洗滌除去未結(jié)合的生物素；(2)將鏈霉親和素與熒光微球-生物素偶聯(lián)物混合輕搖反應(yīng)2 h后，離心、用PBS溶液洗滌移除未偶聯(lián)的鏈霉親和素，得到熒光微球-生物素-鏈霉親和素偶聯(lián)物；(3)將生物素化的克倫特羅單克隆抗體加入到熒光微球-生物素-鏈霉親和素的偶聯(lián)物溶液中輕搖反應(yīng)I h后，洗滌、離心以除去未偶聯(lián)上的生物素化克倫特羅單克隆抗體，即得到熒光微球標(biāo)記克倫特羅單克隆抗體即熒光微球-生物素-鏈霉親和素-生物素化克倫特羅單克隆抗體；所述活潑酯化的生物素為將生物素-PEG5000復(fù)合物溶于DMF溶液中，加入二環(huán)己基碳亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺后室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24 h，然后離心棄沉淀，得到活潑酯化的生物素；所述氨基修飾的突光微球的制備方法:10 mg突光微球洗凈后超聲溶解于I mL蒸懼水中，加入20 yL冰乙酸和20 μ L(3-三甲氧基硅丙基)-二乙基乙二胺超聲溶解后，磁力攪拌3?4 h，用10 mM pH5.5的MES緩沖液洗滌并重懸；所述熒光微球粒徑為175 nm。
[0007]所述生物素化克倫特羅單克隆抗體的的制備方法:用I mL DMSO溶液溶解生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯NHSB配制成濃度為I mg/mL的溶液，取120 μ L加入到ImL克倫特羅單克隆抗體溶液中，在室溫下持續(xù)攪拌，保溫2?4 h;然后加入9.6 μ L I mol/L的NH4C1溶液在室溫下攪拌10 min，用PBS溶液在4°C下充分透析除去游離的生物素；將透析完后的樣品上I ml的分子篩柱，以PBS溶液緩慢洗脫，抗體在f 3 ml之間洗下，再在收集到的目標(biāo)產(chǎn)物中加入疊氮鈉及1.0 g/L的BSA溶液，在4 °C下避光保存?zhèn)溆谩?br> [0008]所述鏈霉親和素與熒光微球-生物素偶聯(lián)物混合反應(yīng)的投料摩爾比為1000:1。
[0009]所述熒光微球標(biāo)記生物素化克倫特羅單克隆抗體與熒光微球-生物素-鏈霉親和素的偶聯(lián)物的投料摩爾比為1:1000。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:
1、標(biāo)記效率高:與傳統(tǒng)的熒光微球直接偶聯(lián)抗體相比，生物素-鏈霉親和素作為偶聯(lián)臂使熒光微球與克倫特羅單克隆抗體之間結(jié)合的空間位阻效應(yīng)減小，而且一個(gè)熒光微球-PEG5_-生物素-鏈霉親和素能與生物素化抗體1:4的偶聯(lián)，從而使標(biāo)記效率得到了相應(yīng)地提聞。
[0011]2、分散性和可溶性好:與熒光微球結(jié)合的生物素是用親水性的PEG5_修飾的復(fù)合物，親水性的peg5_的嵌入提高了熒光微球-抗體偶聯(lián)物的在復(fù)溶液中的可溶性，而且因?yàn)檩^長(zhǎng)的偶聯(lián)臂，偶聯(lián)物能很好的分散在溶液中，基本不會(huì)發(fā)生絮凝沉淀，表現(xiàn)出良好的膠體穩(wěn)定性。
[0012]3、結(jié)合性強(qiáng):PEG5_-生物素-鏈霉親和素偶聯(lián)臂與克倫特羅單克隆抗體上的生物素結(jié)合后，保證了熒光微球表面的抗體結(jié)合位點(diǎn)定向分布，增強(qiáng)了熒光微球-克倫特羅單克隆抗體偶聯(lián)物與目標(biāo)被檢物質(zhì)的結(jié)合性能，這點(diǎn)主要體現(xiàn)在提高的熒光微球試紙條的靈敏度和穩(wěn)定性。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解:
圖1本發(fā)明制得的熒光微球標(biāo)記克倫特羅單克隆抗體。
【具體實(shí)施方式】
[0014]本實(shí)施例給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0015]生物素-PEG.復(fù)合物購(gòu)于上海炎怡生物有限公司；
熒光微球購(gòu)于德國(guó)Merck公司，粒徑為175 nm。
[0016]實(shí)施例1:本發(fā)明中熒光微球標(biāo)記克倫特羅單克隆抗體的新型偶聯(lián)物的制備方法
1、氨基修飾的熒光微球的制備方法
10 mg熒光微球洗凈后超聲溶解于I mL蒸餾水中，加入20 μ L冰乙酸和20 μ L (3-三甲氧基硅丙基)-二乙基乙二胺超聲溶解后，磁力攪拌3~4 h，用10 mM的MES緩沖液(ρΗ5.5)洗漆并重懸。
[0017]、活潑酯化的生物素的制備方法 準(zhǔn)確稱取4.5 mg生物素-PEG5qqq復(fù)合物溶于2 mL的DMF溶液中，加入20.5 mg 二環(huán)己基碳亞胺和10.5 mg N-羥基琥拍酰亞胺后,室溫磁力攪拌反應(yīng)24 h,然后以4000 rpm離心5 min，棄沉淀，得到活潑酯化的生物素，備用。
[0018]3、熒光微球標(biāo)記克倫特羅單克隆抗體的方法，其特征在于:所述生物素化克倫特羅單克隆抗體的的制備方法:用I mL DMSO溶液溶解生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHSB)配制成濃度為I mg/mL的溶液，取120 μ L加入到ImL濃度為1.7 mg/mL的克倫特羅單克隆抗體溶液中，在室溫下持續(xù)攪拌，保溫2~4h ;然后加入9.6 Ul^ANH4Cl (I mol/L)溶液在室溫下攪拌10 min，用PBS溶液在4 °C下充分透析除去游離的生物素；將透析完后的樣品上I ml的分子篩柱，以PBS溶液緩慢洗脫，抗體在f 3 ml之間洗下，再在收集到的目標(biāo)產(chǎn)物中加入疊氮鈉及1.0 g/L的BSA溶液，在4 °C下避光保存?zhèn)溆谩?br> [0019]4、以5 mL體系標(biāo)記35 yg/mg (抗體/微球)的免疫微球,具體方法:2.0 mg氨基修飾的熒光微球與3.5 mg活潑酯化的生物素在5 mL的PBS溶液(pH 7.4左右)中偶聯(lián)反應(yīng)2 h，再離心、洗滌除去未結(jié)合的生物素，得到熒光微球-生物素偶聯(lián)物；將上述制得的熒光微球-生物素偶聯(lián)物加入到10 mg/mL鏈霉親和素溶液中，所述鏈霉親和素與熒光微球-生物素偶聯(lián)物混合反應(yīng)的投料摩爾比為1000:1，保證終體積為5 mL，輕搖反應(yīng)2 h后，離心、用PBS緩沖溶液洗滌移除未偶聯(lián)的鏈霉親和素，得到熒光微球-生物素-鏈霉親和素偶聯(lián)物；再將相應(yīng)標(biāo)記量的生物素化的克倫特羅單克隆抗體(稀釋10倍并緩慢加入)加入到上述偶聯(lián)物溶液至終濃度為35 yg/mg，輕搖反應(yīng)I h后，洗滌、離心以除去未偶聯(lián)上的生物素化抗體，即得到熒光微球標(biāo)記克倫特羅單克隆抗體的新型偶聯(lián)物，用500 μ L復(fù)溶液復(fù)溶。
[0020]上述制得的新型偶聯(lián)物與傳統(tǒng)的熒光微球-抗體偶聯(lián)物相比，在電鏡下觀察分散性明顯更好，在4 °C條件下放置6個(gè)月后，仍很透明，不會(huì)發(fā)生絮凝沉淀現(xiàn)象，表現(xiàn)出良好的膠體穩(wěn)定性。其較強(qiáng)的結(jié)合能力則通過(guò)下面實(shí)施例中的熒光微球試紙條靈敏度提高得到體現(xiàn)。
[0021]實(shí)施例2:熒光微球標(biāo)記克倫特羅單克隆抗體的新型偶聯(lián)物在熒光微球試紙條上的應(yīng)用
1、熒光微球免疫層析試紙條的制備
熒光微球墊的制備:用0.01 M的PNPB (其中包含5%蔗糖和0.05% Tween-20)復(fù)溶實(shí)施例I制得的偶聯(lián)物至起始體積后，用BIODOT Dispensing System,按照4 μ L/cm的量噴涂至玻璃纖維膜上，25 °C真空干燥I~2 h，放于干燥環(huán)境備用。
[0022]克倫特羅-BSA偶聯(lián)物和驢抗鼠二抗包被到NC膜上:分別用0.01 M的PBS緩沖液調(diào)節(jié)包被物濃度為0.4 mg/mL和0.4 mg/mL,噴膜量為0.74 μ L/cm,檢測(cè)線包被克倫特羅-BSA偶聯(lián)物，質(zhì)控線包被驢抗鼠二抗，兩區(qū)位置相隔6 mm，質(zhì)控線距NC膜頂端10 mm，檢測(cè)線距NC膜底端9 mm, 37°C烘干處理過(guò)夜后，于室溫干燥的環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?br> [0023]熒光微球免疫層析試紙條的制備:在底板上依次搭連地粘貼濾紙、樣本墊、熒光微球墊、NC膜和吸水紙，粘貼好的試紙條板用切割機(jī)裁切成試紙條，并組裝到準(zhǔn)備好的試紙條盒中，裝入鋁箔袋，加入干燥劑后，封口保存，于室溫干燥的環(huán)境下至少可保存一年。
[0024]、熒光微球試紙條定量檢測(cè)豬肉中的克倫特羅
樣品前處理:取2.5 g豬肉樣品于50 mL離心管中，加入5 mL蒸餾水在沸水中加熱提取15 min，取出全部上清于新的10 mL離心管中，加入I mL正已烷輕搖后靜置I min，移除上面脂肪層，下層清液備用。
[0025]檢測(cè)步驟:(1)把陰性樣本和添加系列濃度(0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、15 ng/mL)的樣本提取液加入試紙條樣本孔中，反應(yīng)10 min后，將檢測(cè)試紙條放入熒光微球讀取儀檢測(cè)窗口 ；
(2)熒光微球在LED燈源激發(fā)下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光；
(3)發(fā)射的熒光經(jīng)CCD掃描系統(tǒng)匯聚后，經(jīng)過(guò)光電聚集管，送入光電倍增管，光信號(hào)得到增強(qiáng)，在經(jīng)過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)換元件，經(jīng)過(guò)軟件處理后，熒光的強(qiáng)弱以數(shù)值的高低輸入出來(lái)。
[0026](4)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，以系列濃度測(cè)出其對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度的數(shù)值，從而根據(jù)這一系列數(shù)值和克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)濃度建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后根據(jù)檢測(cè)樣本的輸出數(shù)值，計(jì)算出檢測(cè)樣本中克倫特羅的含量。
[0027](5)吸取100 μ L提取液，進(jìn)行檢測(cè)，最后根據(jù)檢測(cè)樣本的數(shù)據(jù)輸出的數(shù)值分別為
4.08，查標(biāo)準(zhǔn)曲線圖得出檢測(cè)樣本中克倫特羅的殘留量為O。
[0028]實(shí)施例3:用熒光微球標(biāo)記克倫特羅單克隆抗體的新型偶聯(lián)物制備的熒光微球試紙條上檢測(cè)豬肝中的克倫特羅殘留量
樣品前處理方法、試紙條制作同實(shí)施例2。
[0029]定性、定量檢測(cè)方法同實(shí)施例2，以添加系列濃度(0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、15 ng/mL)和對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取100 μ L提取液加入樣本孔中，10 min后用讀取儀進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)樣本的數(shù)據(jù)輸出的數(shù)值分別為3.67，查標(biāo)準(zhǔn)曲線圖得出檢測(cè)樣本中克倫特羅的殘留量0.8 ng/mL。
[0030]實(shí)施例4:用熒光微球標(biāo)記克倫特羅單克隆抗體的新型偶聯(lián)物制備的熒光微球試紙條上檢測(cè)飼料中的克倫特羅殘留量
樣品前處理:稱取0.5 g飼料樣品，加入I mL樣品提取液(pH7.0 50 mmol/LTris-HCl)，在試管中攪拌I min，靜置10 min后，取上層清液作待測(cè)樣品。
[0031 ] 試紙條制作同實(shí)施例2。
[0032]定性、定量檢測(cè)方法同實(shí)施例2，以添加系列濃度(0.1,0.5、1、2、2.5、3、5、7、10、15ng/mL)和對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取100 μ L提取液加入樣本孔中，10 min后用讀取儀進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)樣本的數(shù)據(jù)輸出的數(shù)值分別為4.03，查標(biāo)準(zhǔn)曲線圖得出檢測(cè)樣本中克倫特羅的殘留量為O。
[0033]實(shí)施例5:用熒光微球標(biāo)記克倫特羅單克隆抗體的新型偶聯(lián)物制備的熒光微球試紙條上檢測(cè)豬尿中的克倫特羅殘留量
尿樣可直接進(jìn)行檢測(cè)，不需前處理。定性、定量檢測(cè)方法同實(shí)施例2，以添加系列濃度(0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、5、7、10 ng/mL)和對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取100μ L尿樣加入樣本孔中，10 min后用讀取儀進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)樣本的數(shù)據(jù)輸出的數(shù)值分別為2.79，查標(biāo)準(zhǔn)曲線圖得出檢測(cè)樣本中克倫特羅的殘留量為1.46 ng /mL。
【權(quán)利要求】
1.熒光微球標(biāo)記克倫特羅單克隆抗體的方法，其特征在于:(1)氨基修飾的熒光微球與活潑酯化的生物素在PBS溶液中偶聯(lián)反應(yīng)2 h得到熒光微球-生物素偶聯(lián)物，再離心、洗滌除去未結(jié)合的生物素；(2)將鏈霉親和素與熒光微球-生物素偶聯(lián)物混合輕搖反應(yīng)2 h后，離心、用PBS溶液洗滌移除未偶聯(lián)的鏈霉親和素，得到熒光微球-生物素-鏈霉親和素偶聯(lián)物；(3)將生物素化的克倫特羅單克隆抗體加入到熒光微球-生物素-鏈霉親和素的偶聯(lián)物溶液中輕搖反應(yīng)I h后，洗滌、離心以除去未偶聯(lián)上的生物素化克倫特羅單克隆抗體，即得到熒光微球標(biāo)記克倫特羅單克隆抗體即熒光微球-生物素-鏈霉親和素-生物素化克倫特羅單克隆抗體； 所述活潑酯化的生物素為將生物素-PEG5000復(fù)合物溶于DMF溶液中，加入二環(huán)己基碳亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺后室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24 h，然后離心棄沉淀，得到活潑酯化的生物素；所述氨基修飾的突光微球的制備方法:10 mg突光微球洗凈后超聲溶解于I mL蒸懼水中，加入20 yL冰乙酸和20 μ L(3-三甲氧基硅丙基)-二乙基乙二胺超聲溶解后，磁力攪拌3?4 h，用10 mM pH5.5的MES緩沖液洗滌并重懸；所述熒光微球粒徑為175 nm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光微球標(biāo)記克倫特羅單克隆抗體的方法，其特征在于:所述生物素化克倫特羅單克隆抗體的的制備方法:用I mL DMSO溶液溶解生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯NHSB配制成濃度為I mg/mL的溶液，取120 μ L加入到ImL濃度為1.7 mg/mL克倫特羅單克隆抗體溶液中，在室溫下持續(xù)攪拌，保溫21 h;然后加入9.6 UL I mol/L的NH4C1溶液在室溫下攪拌10 min，用PBS溶液在4°C下充分透析除去游離的生物素；將透析完后的樣品上I ml的分子篩柱，以PBS溶液緩慢洗脫，抗體在f 3 ml之間洗下，再在收集到的目標(biāo)產(chǎn)物中加入疊氮鈉及1.0 g/L的BSA溶液，在4 °C下避光保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光微球標(biāo)記克倫特羅單克隆抗體的方法，其特征在于:所述鏈霉親和素與熒光微球-生物素偶聯(lián)物混合反應(yīng)的投料摩爾比為1000:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光微球標(biāo)記克倫特羅單克隆抗體的方法，其特征在于:所述熒光微球標(biāo)記生物素化克倫特羅單克隆抗體與熒光微球-生物素-鏈霉親和素的偶聯(lián)物的投料摩爾比為1:1000。
【文檔編號(hào)】G01N33/533GK103675261SQ201310348210
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月12日
【發(fā)明者】賴衛(wèi)華, 彭濤 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)