專利名稱：克倫特羅單克隆抗體的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種克倫特羅的特異性單克隆抗體的制備，并用于對(duì)飼料及動(dòng)物性食品中克倫特羅的快速測定，屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
克倫特羅又叫瘦肉精，屬β -腎上腺素受體激動(dòng)劑類(簡稱β -激動(dòng)劑)藥物，具有促進(jìn)動(dòng)物肌肉生長，減少胴體脂肪含量，改善飼料利用率，顯著提高瘦肉率的作用，是最為實(shí)用的激動(dòng)劑之一?？藗愄亓_在家畜和人體內(nèi)吸收好，而且與其它興奮劑相比， 它的生物利用度高，以至食用了含有克倫特羅的豬肉出現(xiàn)中毒。早在1986年歐洲就頒布禁用激動(dòng)劑的禁令。我國農(nóng)業(yè)部與質(zhì)檢總局也全面禁止該類物質(zhì)的使用。瘦肉精在上海曾經(jīng)引發(fā)了幾百人的中毒事件。而在臺(tái)灣，由于從美國進(jìn)口的豬肉里含有瘦肉精，幾乎挑起一場政治爭端。近年來雖加大了打擊非法使用瘦肉精的力度，但在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，仍有很多非法使用瘦肉精的情況發(fā)生。為了打擊非法使用違禁藥物，除了健全法律法規(guī)，建立有效的監(jiān)督管理體系外，還需要健全相應(yīng)的檢測方法。申請(qǐng)人通過檢索發(fā)現(xiàn)，目前國內(nèi)報(bào)道所制備的克倫特羅單克隆抗體的特異性不強(qiáng)，在以單抗為核心所制備的膠體金試紙條的應(yīng)用中， 未見對(duì)不同檢測樣品的處理方法及最低檢測濃度的報(bào)道，且目前市場上的試紙條假陽性率偏高。因此克倫特羅的檢測遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足快速、廉價(jià)、穩(wěn)定和準(zhǔn)確等方面的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種克倫特羅單克隆抗體的制備方法及其在檢測克倫特羅上的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，技術(shù)方案通過如下方式實(shí)現(xiàn)一種克倫特羅單克隆抗體的制備方法，其特征在于以鹽酸克倫特羅與牛血清白蛋白的偶聯(lián)物為免疫原免疫小鼠，再通過細(xì)胞融合技術(shù)獲得雜交瘤細(xì)胞，誘生腹水制備出克倫特羅單克隆抗體。所述免疫原是通過重氮法合成的。一種克倫特羅單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于以克倫特羅單克隆抗體為核心試劑制備檢測克倫特羅的膠體金免疫試紙條。所述膠體金免疫試紙條由PVC底板、樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊幾部分組成，其中膠體金結(jié)合墊包被有克倫特羅的膠體金標(biāo)記物，硝酸纖維素膜上包被有克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測線(T)和包被羊抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線(C)。所述膠體金免疫試紙條，檢測飼料中克倫特羅的最低濃度為0. 005mg · kg_S 動(dòng)物肌肉和肝臟中克倫特羅的最低濃度為1.6ng· g—1，豬尿中克倫特羅的最低濃度為 1. 5ng · mL-1 ；檢測時(shí)以控制線(C)和檢測線⑴兩條顯色線作為結(jié)果判斷的主要依據(jù)。1.人工免疫抗原和包被抗原的制備
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精確的稱取定量的鹽酸克倫特羅溶解在適量的HCl邊震蕩邊向其中緩緩加入 NaNO2,并不斷用微量移液器蘸取少許與淀粉碘化鉀試紙檢測，直到試紙顏色剛好變?yōu)樗{(lán)紫色，停止加NaNO2，繼續(xù)震蕩使反應(yīng)充分進(jìn)行就得到了重氮化的克倫特羅溶液，將重氮化合物分別緩慢加入牛血清白蛋白和卵清蛋白中，震蕩反應(yīng)。4°C冰箱繼續(xù)放置他后，在4°C冰箱中用PBS連續(xù)透析3天。2.克倫特羅單克隆抗體制備及鑒定(1)動(dòng)物免疫程序?qū)?100 μ g · mLtL-BSA的PBS溶液(0. 22 μ m濾膜過濾除菌)與等體積弗氏完全佐劑混合成乳劑，皮下分點(diǎn)注射健康6周齡雌性BALB/C小鼠，每只 0. 4mL (含CL-BSA100 μ g)，首免2周后同樣劑量加強(qiáng)免疫，佐劑為弗氏不完全佐劑，共免3 次，每次間隔2周，間接ELISA法監(jiān)測血清抗體效價(jià)，選擇效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合，融合前三天以CL-BSA對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫注射。(2)細(xì)胞融合與克隆化取經(jīng)過加強(qiáng)免疫的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)過多次亞克隆獲得穩(wěn)定分泌抗克倫特羅的單克隆抗體細(xì)胞株5G8。(3)單克隆抗體制備、純化及鑒定取8 10周齡的BALB/c小鼠，用滅菌石蠟對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，10天后腹腔注射所述單克隆抗體細(xì)胞株5G8，注射量為5 X IO5個(gè)/只，待小鼠腹部明顯膨大，采集腹水，用辛酸-硫酸銨鹽析法及ftOtein A免疫層析法對(duì)腹水純化， 即得克倫特羅單克隆抗體。通過亞型鑒定得出本發(fā)明單克隆抗體的亞型為IgGl型。采用間接競爭ELISA測定抗體特異性及其與同類其它化合物的交叉反應(yīng)性。3.克倫特羅膠體金免疫試紙條的研制以單克隆抗體為核心試劑制備檢測克倫特羅膠體金免疫試紙條，確定免疫膠體金試紙條中各種試劑的配方以及生產(chǎn)工藝，對(duì)試紙條性能進(jìn)行鑒定，并確定了檢測樣品的前處理方法。本發(fā)明的有益效果是通過小鼠雜交瘤細(xì)胞珠5G8產(chǎn)生特異性強(qiáng)的克倫特羅單克隆抗體，與其它類藥物交叉反應(yīng)率低，能夠大量生產(chǎn)，可用于制備檢測克倫特羅的膠體金試紙條，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和操作簡便和穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，適合于對(duì)大量樣品的篩檢， 應(yīng)用前景十分廣闊。


圖1為本發(fā)明純化后克倫特羅單克隆抗體SDS-PAGE電泳圖譜；圖2為本發(fā)明單克隆抗體與克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)曲線示圖；圖3為本發(fā)明膠體金試紙條的敏感性示圖。
具體實(shí)施例方式為對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，下面結(jié)合具體實(shí)施例做進(jìn)一步說明，實(shí)施例1人工免疫抗原和包被抗原的合成CL-BSA, CL-OVA的制備(反應(yīng)在2 4°C條件下進(jìn)行)。精確稱取CL 3. (約 0. Olmmol)溶于 400ul 0. IM HCl (0. 04mmol)，邊震蕩邊向其中緩緩加入10mg/ml的NaNO2 (約O.Olmmol)，并不斷用微量移液器蘸取少許與淀粉碘化鉀試紙檢測，直到試紙顏色剛好變?yōu)樗{(lán)紫色，停止加NaN02。繼續(xù)震蕩35min使反應(yīng)充分進(jìn)行就得到了重氮化的克倫特羅溶液。將重氮化產(chǎn)物緩慢加入溶解與8XPBS(PH8. 6)的蛋白溶液(BSA 和 0VA4ml)，BSA5. Omg(0. 08X l(T3mmol) ；0VA5. Omg(0. IlX l(T3mmol)。使重氮化的克倫特羅與蛋白的分子數(shù)量比為50 1左右。檢查pH值，pH值8.0仍在以上，繼續(xù)震蕩反應(yīng)45min。4°C冰箱繼續(xù)放置Mi后，在4°C冰箱中用PBS (0. Olmol/L)，pH值7. 4連續(xù)透析3天，換液8次。重氮鹽在與一種芳香胺或苯酚化合時(shí)，生成偶氮化合物，而偶氮基是發(fā)色基團(tuán)，觀察偶氮后的鹽酸克倫特羅滴入蛋白時(shí)的顏色變化，初步確認(rèn)是否偶聯(lián)成功。由紫外全波長掃描最后計(jì)算得CL與BSA偶聯(lián)比在35 1 ;CL與OVA偶聯(lián)比在 46 1。由 Gene5 檢測系統(tǒng)的 CL-BSA 為 1. lmg/ml ；CL-OVA 濃度為 1. 6mg/ml。實(shí)施例2單克隆抗體的制備將1100 μ g -Iiir1CL-BSA的PBS溶液(0. 22 μ m濾膜過濾除菌)與等體積弗氏完全佐劑混合成乳劑，皮下分點(diǎn)注射健康6周齡雌性BALB/C小鼠5只，每只0. 4mL (含CL-BSA 100 μ g)，首免后3周后同樣劑量加強(qiáng)免疫，佐劑為弗氏完全佐劑，共免3次，每次間隔2周。在三免以后檢測小鼠的抗體效價(jià)和阻斷情況。方陣法確定ELISA檢測抗原最佳包被濃度，通過試驗(yàn)確定包被抗原CL-OVA的包被濃度為0. 8 μ g/ml ；陰性對(duì)照濃度為1 2560。再由間接ELISA法檢測5只小鼠的血清效價(jià)，CL-BSA小鼠血清的效價(jià)在1 10240稀釋度以上是2、3、4號(hào)老鼠，1、5號(hào)老鼠血清效價(jià)在1 20480稀釋度。由以上結(jié)果判斷對(duì)5號(hào)老鼠進(jìn)行沖擊免疫。取5號(hào)小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，加入HAT培養(yǎng)基，37°C、6% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5天后用新鮮HAT培養(yǎng)基換出一半的培養(yǎng)基，8-10天后用HT培養(yǎng)基換出 HAT培養(yǎng)基。每天觀察雜交瘤細(xì)胞的生長情況，待其分布至孔底面積2/5以上時(shí)，取上清液采用間接ELISA篩選特異性抗體，再用有限稀釋法進(jìn)行2-3次亞克隆，檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清， 有細(xì)胞的孔陽性率達(dá)到100%，得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株5G8。取8 10周齡的BALB/c小鼠10只，用滅菌石蠟對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，10天后腹腔注射所述單克隆抗體細(xì)胞株5G8，注射量為5X IO5個(gè)/0. 5mL/只，待小鼠腹部明顯膨大，采集腹水，腹水中即含有大量單克隆抗體。以上所述步驟中采用的間接ELISA方法以及方陣實(shí)驗(yàn)的方法參照精編免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南和臨川免疫技術(shù)中的方法進(jìn)行。實(shí)施例3單克隆抗體的純化及其鑒定1.抗體純化腹水采用辛酸-硫酸銨鹽析法及ftOteinA免疫層析法進(jìn)行純化，用SDS-PAGE電泳鑒定純化物，出現(xiàn)51KD的抗體重鏈條帶和^KD的抗體輕鏈條帶(圖1)。2.抗體測定方法的建立2. 1單抗5G8效價(jià)檢測由方陣實(shí)驗(yàn)得包被原的濃度在0.79ug，該孔的抗體效價(jià)在1 20480倍稀釋。
2. 2單抗5G8特異性測定將同系物沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅配制成1000ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、IOng/ ml、5ng/ml、lng/ml六個(gè)濃度，與5G8抗體做間接競爭ELISA試驗(yàn)，判斷抗體與同系物沙丁胺醇、萊克多巴胺、去甲腎上腺素和異丙腎上腺素的有無交叉反應(yīng)。(結(jié)果如表1)表1單克隆抗體5G8特異性測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種克倫特羅單克隆抗體的制備方法，其特征在于以鹽酸克倫特羅與牛血清白蛋白的偶聯(lián)物為免疫原免疫小鼠，再通過細(xì)胞融合技術(shù)獲得雜交瘤細(xì)胞，誘生腹水制備出克倫特羅單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克倫特羅單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述免疫原是通過重氮法合成的。
3.一種用權(quán)利要求1所述的制備方法制備出的克倫特羅單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于以克倫特羅單克隆抗體為核心試劑制備檢測克倫特羅的膠體金免疫試紙條。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克倫特羅單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于所述膠體金免疫試紙條由PVC底板、樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊幾部分組成，其中膠體金結(jié)合墊包被有克倫特羅的膠體金標(biāo)記物，硝酸纖維素膜上包被有克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測線(T)和包被羊抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線(C)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種特異性單克隆抗體的制備方法及其應(yīng)用，涉及檢測技術(shù)領(lǐng)域，以鹽酸克倫特羅與牛血清白蛋白的偶聯(lián)物為免疫原免疫小鼠，再通過細(xì)胞融合技術(shù)獲得雜交瘤細(xì)胞，制備特異性克倫特羅單克隆抗體，并通過制備的克倫特羅單克隆抗體為核心試劑制備檢測克倫特羅的膠體金免疫試紙條。本發(fā)明制備的克倫特羅抗體是高特異性的單克隆抗體，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)；本發(fā)明利用該高特異性單克隆抗體為基礎(chǔ)制備的試紙條，用于檢測克倫特羅殘留，具有簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、廉價(jià)的特點(diǎn)，其應(yīng)用具有廣闊前景。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102432684SQ201110258770
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月2日
發(fā)明者吳雙, 孫勇, 孟婷, 左偉勇, 李柏林, 洪偉鳴, 王帥兵, 王永娟 申請(qǐng)人:安徽緣遠(yuǎn)博愛生物技術(shù)有限公司