專利名稱：莪術(shù)醇單克隆抗體在含莪術(shù)醇類中藥中的免疫分析應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及莪術(shù)醇單克隆抗體，及應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)對(duì)中藥中的莪術(shù)醇進(jìn)行定性與定量分析。
背景技術(shù)：
單克隆抗體技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的重要工具，在基因和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究方面有著不可或缺的作用。在農(nóng)業(yè)科學(xué)、食品科學(xué)、環(huán)境保護(hù)、生態(tài)學(xué)及法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用也有很大的進(jìn)展，亦可用于以單抗為彈頭的“生物導(dǎo)彈”藥物。單克隆抗體可用于分析抗原的細(xì)微結(jié)構(gòu)及檢驗(yàn)抗原抗體未知的結(jié)構(gòu)關(guān)系；生產(chǎn)出針對(duì)復(fù)雜生物混合物中的特定分子的抗體，可用于分離、分析及純化該特定分子抗原；其試劑可用于臨床診斷和治療。隨著人們對(duì)單克隆抗體認(rèn)識(shí)的深入，這一技術(shù)被逐漸應(yīng)用到食品、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物、植物病毒學(xué)等方面，但在天然藥物研究領(lǐng)域中的應(yīng)用國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道。以單克隆抗體為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫分析法以其靈敏、精確、迅速和簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，可用于天然產(chǎn)物活性成分的檢識(shí)與含量測(cè)定，另外還可用于天然藥物有效成分的分離與純化、藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究、質(zhì)量監(jiān)控、新藥篩選以及擴(kuò)大藥用植物資源，對(duì)于天然藥物的開發(fā)和利用、加速中醫(yī)藥現(xiàn)代化的進(jìn)程有著重要的意義。目前日本、泰國(guó)、韓國(guó)已開展針對(duì)中藥活性成分的免疫分析技術(shù)研究，根據(jù)免疫分析靈敏、快速、特異、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)主要應(yīng)用于大樣本量的快速及在線檢測(cè)；活性成分在植物體中含量低或前處理復(fù)雜樣本；毒性成分的檢出及分析；中藥藥代動(dòng)力學(xué)研究等方面。且已制備出30多種單克隆抗體(如抗甘草酸、抗馬兜鈴酸I、抗人參皂苷Rgl、抗青蒿素、抗柴胡皂苷等的單克隆抗體)，日本已研制出商品化的甘草酸ELISA試劑盒。國(guó)內(nèi)目前對(duì)于中藥活性成分單克隆抗體的制備及應(yīng)用研究較少，有制備出海洋硫酸多糖類藥物(國(guó)家一類新藥)的單克隆抗體，并建立了 ELISA檢測(cè)方法，用于該藥物藥代動(dòng)力學(xué)研究；薯蕷皂苷單克隆抗體制備，用于分析細(xì)胞培養(yǎng)獲取薯蕷皂苷的在線監(jiān)測(cè)；對(duì)靈芝多糖GLPLl免疫原進(jìn)行優(yōu)化并制備出其相應(yīng)的單克隆抗體；用ELISA法分析柴胡藥材的質(zhì)量等幾例報(bào)道。此外均是多克隆抗體的研究與應(yīng)用報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種莪術(shù)醇單克隆抗體，將該抗體做為一抗，建立了莪術(shù)醇的ELISA法，采用ELISA法分析中藥中莪術(shù)醇的有無與含量，為含有莪術(shù)醇類中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供一種新的方法。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是
一、用現(xiàn)有技術(shù)制備莪術(shù)醇單克隆抗體，具體方法步驟如下
(I)制備免疫原莪術(shù)醇為天然小分子化合物，相對(duì)分子量236. 35，與牛血清白蛋白偶聯(lián)成 Cur-BSA。(2)免疫本實(shí)驗(yàn)根據(jù)莪術(shù)醇的性質(zhì)及注射免疫后小鼠的反應(yīng)設(shè)計(jì)第I及第2次免疫劑量為50μ g/只，之后每次的免疫劑量為ΙΟΟμ g/只。首次免疫采用皮下多點(diǎn)接近淋巴結(jié)注射，第2次免疫起采用腹腔注射，注射時(shí)要小心操作，針頭切勿刺破內(nèi)臟，避免造成污染，每次免疫間隔2周，共免疫4次。(3)篩選每次免疫后4天眼球采血分離血清，用直接或競(jìng)爭(zhēng)的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，檢測(cè)莪術(shù)醇血清抗體效價(jià)。若效價(jià)高于104，即可用于細(xì)胞融合。(4)骨髓瘤細(xì)胞的選擇選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、細(xì)胞形態(tài)佳和活性大于95%的細(xì)胞作為融合細(xì)胞。(5)細(xì)胞融合超強(qiáng)免疫后第4天，眼球采 血分離陽性血清，并處死小鼠，無菌取免疫鼠脾臟，分離脾細(xì)胞，與SP2 / O小鼠骨髓瘤細(xì)按5 :1數(shù)量融合。(6)陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選及克隆融合細(xì)胞以HAT選擇培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)，10天后，ELISA直接法檢測(cè)上清液抗體水平吸收值(OD)大于陰性對(duì)照組值2. I倍以上者；且以Cur-HSA和HSA包被96孔酶標(biāo)板，兩者相互對(duì)照，Cur-HSA包被板為陽性、HSA包被板的相應(yīng)孔為陰性者，為陽性孔。對(duì)陽性孔用有限稀釋法作單克隆化，多次克隆后檢測(cè)值都為高陽性且鏡下觀察細(xì)胞克隆狀態(tài)良好者，即為篩選出的單克隆株。(7)腹水制備抗體及純化BAL B/C小鼠體內(nèi)誘生腹水，用Protein-G蛋白分離柱收集純化腹水。(8)將收集的腹水，用I mol的Tris溶液將腹水的PH值調(diào)至7. 0，然后通過蛋白分離柱，用10 mmol (PH 7. O)的磷酸鹽緩沖液清洗柱子，被吸附的抗體用100 mmol (PH3. 0)的檸檬酸鹽緩沖液洗脫下來，再用IM的Tris溶液中和，以PH7. 4的PBS對(duì)沖透析三次，最后凍干即成。二、應(yīng)用莪術(shù)醇單克隆抗體，采取ELISA法分析中藥中莪術(shù)醇，包括如下步驟
(I)供試品的制備采用揮發(fā)油提取器提取揮發(fā)油，所得揮發(fā)油以無水硫酸鈉除去水
分，以乙醚定容，做供試品。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制莪術(shù)醇標(biāo)準(zhǔn)品用20%甲醇做系列濃度稀釋，以莪術(shù)醇單克隆抗體為一抗，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)，405nm測(cè)定OD值，以莪術(shù)醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度-A4tl5 做標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3) ELISA法用pH 9.6的PBS將Cur-HSA配制為濃度為I μ g/ml的溶液，以100 μ I/孔包被96孔免疫板，37°C孵育Ih;用含5%脫脂奶粉的PBS溶液于37°C封閉2h:加入I 6400倍稀釋的莪術(shù)醇單抗(用PBS稀釋)100 μ I/孔，再加入供試品100μ I/孔，37°C孵育I h，加入羊抗鼠酶標(biāo)抗體(I 1000稀釋)100 μ I/孔，37°C孵育I h，加ABTS顯色液，100 μ I/孔，于37°C反應(yīng)15 min，用酶標(biāo)儀讀出各孔在波長(zhǎng)405 nm處的吸光度值(A4tl5J?？瞻讓?duì)照為PBS，每一濃度的供試品設(shè)置3個(gè)平行孔。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是制備出的單克隆抗體可用于莪術(shù)醇的定性與定量分析，另外還可用于莪術(shù)醇活性成分的分離與純化、藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究、質(zhì)量監(jiān)控、新藥篩選以及擴(kuò)大藥用植物資源，對(duì)于莪術(shù)類藥材的開發(fā)和利用、加速中醫(yī)藥現(xiàn)代化的進(jìn)程有著重要的意義。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不是對(duì)本發(fā)明內(nèi)容的限定。實(shí)施例I.材料 BALB/C純系小鼠，雌性，4周齡(由桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。SP2/O骨髓瘤細(xì)胞株(購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù))、RPMI1640培養(yǎng)基、新生牛血清、次黃嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶(HAT)、次黃嘌呤-胸腺嘧啶(HT)、聚乙二醇(PEG4000)(全部購(gòu)自SIGMA公司)，人工抗原(cur-BSA)是有本實(shí)驗(yàn)室自行合成的，該技術(shù)已經(jīng)獲得國(guó)家專利(專利號(hào)200910114452. I),鼠二抗購(gòu)自上海博奧森生物技術(shù)公司，預(yù)染的蛋白質(zhì)Marker (購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司)。試劑的配制① PBS (稱取 Nacl:8g，Na2HPO4:1. 15g, KH2PO4:0. 24g, Kcl :0. 2g,加入1000ml去離子水即得)②PH9. 6的碳酸鹽緩沖液O. ImoI/L(Na2CO3 · IOH2O 8. 58g，NaHCO3 5. 8g,溶于去離子水中至1000ml)③O. 05%的T-PBS (2000mlPBS,加入Iml的吐溫，磁珠攪拌混勻)
④5%的脫脂奶粉(IOOml的PBS加入5g的脫脂奶粉)⑤檸檬酸鹽緩沖液的配制含過氧化氫(檸檬酸三鈉25. 8g,檸檬酸一水合物21. 0g，溶于500ml去離子水中，過氧化氫IOOul)⑥ABTS原液(120mgABTS加入20ml去離子水，即為6mg/ml)⑦ABTS染色劑的配制(ABTS原液O. 5ml,含過氧化氫的檸檬酸鹽緩沖液5ml，去離子水4. 5ml)
3方法步驟
3. I莪術(shù)醇單克隆抗體的制備
3.1.1免疫原制備以莪術(shù)醇為原料，利用丁二酸酐與莪術(shù)醇反應(yīng)生成莪術(shù)醇琥珀酸單酯(Cur-HS)，得到人工半抗原，用MS質(zhì)譜和13C-NMR譜測(cè)定半抗原的結(jié)構(gòu)；將莪術(shù)醇的半抗原制備成吡啶水溶液，然后使之與牛血清蛋白結(jié)合，制備莪術(shù)醇的人工抗原即Cur-HS-BSA，用MALDI-TOF-MS鑒定莪術(shù)醇人工抗原(具體操作詳見發(fā)明專利“一種莪術(shù)醇半抗原和人工抗原及其制備方法”，專利號(hào)200910114452. I)
3. I. 2免疫本實(shí)驗(yàn)根據(jù)莪術(shù)醇的性質(zhì)及注射免疫后小鼠的反應(yīng)設(shè)計(jì)第I及第2次免疫劑量為50μ g/只，之后每次的免疫劑量為ΙΟΟμ g/只。首次免疫采用皮下多點(diǎn)接近淋巴結(jié)注射，第2次免疫起采用腹腔注射，注射時(shí)要小心操作，針頭切勿刺破內(nèi)臟，避免造成污染。篩選分別用HSA-cur和HAS包被酶標(biāo)板(濃度均為lug/ml )，各包被一半的酶標(biāo)板上的孔，每孔lOOul，37°C孵育lh，棄掉包被液，用T-PBS洗三遍，用5%的脫脂奶粉包被酶標(biāo)板，每孔300ul，37°C孵育lh，棄掉脫脂奶粉，用T-PBS洗三遍，加入包被孔稀釋小鼠血清或雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清lOOul，37°C孵育lh，棄掉稀釋血清或上清，用T-PBS洗三遍，加入用T-PBS稀釋的1000:1的鼠二抗，37°C孵育lh，棄掉鼠二抗，加入ABTS染色劑，37°C孵育25min,以T-PBS或骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)的上清液為陰性對(duì)照。骨髓瘤細(xì)胞的選擇采用骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0，該細(xì)胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈，且生長(zhǎng)及融合效率均佳。細(xì)胞的最高生長(zhǎng)刻度為9X105/mL，倍增時(shí)間通常為10 15h。處于相似分裂期的兩個(gè)親代細(xì)胞易于融合，所以選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(細(xì)胞數(shù)為IO4 106，此時(shí)細(xì)胞渾圓透亮、大小均一、邊緣清晰、排列整齊、呈半致密分布)、細(xì)胞形態(tài)佳和活性大于95%的細(xì)胞作為融合細(xì)胞。在準(zhǔn)備融合前的兩周開始復(fù)蘇SP2/0，為確保該細(xì)胞對(duì)HAT的敏感性，每3-6月應(yīng)用8-AG(8-氮-鳥嘌呤)篩選一次，防止細(xì)胞的突變。在細(xì)胞融合的前一天用新鮮培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為9X105/mL，次日一般即為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。細(xì)胞融合融合過程均在無菌條件下進(jìn)行。最佳的融合效果應(yīng)是最低程度的細(xì)胞損傷而又產(chǎn)生最高頻率的融合。聚乙二醇(PEG100(T4000)是目前最常用的細(xì)胞融合劑，其溶液在PH6. O時(shí)細(xì)胞融合率最高。本實(shí)驗(yàn)融合時(shí)所用PEG2000濃度為50% (W/V)，此濃度能夠產(chǎn)生最多的雜交細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)過程中時(shí)注意控制滴加PGE的時(shí)間(Imin)及方式，利于細(xì)胞在質(zhì)膜之間形成分子橋，使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進(jìn)而促使質(zhì)膜的融合。陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆在小鼠免疫中，應(yīng)選用高純度抗原。一種抗原往往有多個(gè)決定簇，小鼠在受抗原刺激后產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，實(shí)質(zhì)是眾多B細(xì)胞群的抗體分泌。而針對(duì)目標(biāo)抗原表位的B細(xì)胞只占極少部分。由于細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的過程，在已融合的細(xì)胞中，有相當(dāng)比例的非目的細(xì)胞的融合體，需篩選除去。篩選過程一般分為融合細(xì)胞的抗體篩選和特異性抗體篩選兩步進(jìn)行。將融合的細(xì)胞充分稀釋，使分配到細(xì)胞培養(yǎng)板的每一孔中的細(xì)胞數(shù)在O至數(shù)個(gè)細(xì)胞之間，培養(yǎng)后取上清以ELISA法選出抗體高分泌性的細(xì)胞這一過程常被習(xí)慣地稱作克隆化。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用特異性抗原(Cur-HAS)包被的ELISA找出針對(duì)目標(biāo)抗原(Cur)的抗體陽性細(xì)胞株，將這些陽性細(xì)胞重復(fù)克隆3次后，細(xì)胞培養(yǎng)板中陽性率為100%，且細(xì)胞生長(zhǎng)良好，穩(wěn)定分泌特異性抗體，符合建株要求。
腹水制備抗體及純化雜交瘤腹腔注射前一周給8周齡雌性BALB/c小鼠腹腔注射石蠟油，每只O. 5 mL，誘導(dǎo)產(chǎn)生腹水。10 d后收集腹水，離心得到小鼠腹水。腹水用Protein-G蛋白分離柱純化，將收集的腹水，用I mol的Tris溶液將腹水的PH值調(diào)至7. 0，然后通過蛋白分離柱，用10 mmol (PH 7. O)的磷酸鹽緩沖液清洗柱子，被吸附的抗體用100mmol (PH3. O)的檸檬酸鹽緩沖液洗脫下來，再用IM的Tris溶液中和，以PH7. 4的PBS對(duì)沖透析三次，最后凍干。應(yīng)用ELISA法分析中藥中莪術(shù)醇
3. 2. I供試品的制備精密稱取藥材50. 00g，置1000ml圓底燒瓶中，加水400ml及數(shù)粒玻璃珠，均勻，浸泡2 h，連接揮發(fā)油測(cè)定器與回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充滿揮發(fā)油測(cè)定器的刻度部分并溢流入燒瓶為止，置加熱套中，設(shè)定加熱溫度為130-140°C，緩緩加熱至微沸7 h，冷卻2 h，開啟揮發(fā)油測(cè)定器下端活塞，將水緩緩放出，至油層上端到達(dá)刻度O線上面5 mm處為止。所得揮發(fā)油用無水硫酸鈉除去水分，以乙醚定容至100ml，取0.1ml定容至IOmL容量瓶中，做供試品。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制莪術(shù)醇標(biāo)準(zhǔn)品用20%甲醇做系列濃度稀釋，以莪術(shù)醇單克隆抗體為一抗，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)，405nm測(cè)定OD值，以莪術(shù)醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度-A4tl5 做標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為 Y= — I. 1754 1ηΧ+1. 7581，R2=O. 9619。法用pH 9. 6的PBS將Cur-HSA配制為濃度為I μ g/ml的溶液，以100 μ I/孔包被96孔免疫板，37°C孵育Ih;用含5%脫脂奶粉的PBS溶液于37°C封閉2 h:加入I : 6400倍稀釋的莪術(shù)醇單抗(用PBS稀釋)100μ I/孔，再加入供試品100μ I/孔，37°C孵育I h，加入羊抗鼠酶標(biāo)抗體(I 1000稀釋)100 μ I/孔，37°C孵育I h，加ABTS顯色液，100 μ I/孔，于37°C反應(yīng)15 min，用酶標(biāo)儀讀出各孔在波長(zhǎng)405 nm處的吸光度值(A4tl5 J?？瞻讓?duì)照為PBS，每一濃度的供試品設(shè)置3個(gè)平行孔。莪術(shù)醇ELISA法的方法學(xué)考察
方法學(xué)考察顯示該方法的重現(xiàn)性(9. 02%)、精密度(< 9%)、加樣回收率(10. 01%)、板間 10%)板內(nèi)(< 10%)差異程度符合免疫分析要求，最低檢測(cè)限為78ng/mL。以該法測(cè)定廣西莪術(shù)、溫莪術(shù)、含莪術(shù)醇的生物樣本，其檢測(cè)結(jié)果如表I，與氣相色譜分析結(jié)果無顯著差巳表I ELISA法與GC-MS法的結(jié)果比較
權(quán)利要求
1.莪術(shù)醇單克隆抗體在含莪術(shù)醇類中藥中的免疫分析應(yīng)用，其特征是以莪術(shù)醇單克隆抗體為一抗，采用酶聯(lián)免疫吸附分析法對(duì)莪術(shù)醇進(jìn)行的定性與定量分析，具體包括如下步驟 (1)供試品的制備采用揮發(fā)油提取器提取揮發(fā)油，所得揮發(fā)油以無水硫酸鈉除去水分，以乙醚定容，做供試品； (2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制莪術(shù)醇標(biāo)準(zhǔn)品用20%甲醇做系列濃度稀釋，以莪術(shù)醇單克隆抗體為一抗，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)，405nm測(cè)定OD值，以莪術(shù)醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度-A4tl5 做標(biāo)準(zhǔn)曲線； (3)ELISA法用pH9. 6的PBS將Cur-HSA配制為濃度為I y g/ml的溶液，以100 U I/孔包被96孔免疫板，37°C孵育Ih;用含5%脫脂奶粉的PBS溶液于37°C封閉2 h :加入I 6400倍稀釋的莪術(shù)醇單抗(用PBS稀釋)100 iil/孔，再加入供試品100 iil/孔，37°C孵育I h，加入羊抗鼠酶標(biāo)抗體(I 1000稀釋UOOiU/孔，37°C孵育I h，加ABTS顯色液，100 u I/孔，于37V反應(yīng)15 min，用酶標(biāo)儀讀出各孔在波長(zhǎng)405 nm處的吸光度值(A4M J，空白對(duì)照為PBS，每一濃度的供試品設(shè)置3個(gè)平行孔。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種莪術(shù)醇單克隆抗體在含莪術(shù)醇類中藥中的免疫分析應(yīng)用，其方法為應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備出天然小分子化合物莪術(shù)醇的單克隆抗體，再以莪術(shù)醇單克隆抗體為一抗，采用酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA法)對(duì)莪術(shù)醇進(jìn)行的定性與定量分析。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、特異性好、樣本前處理簡(jiǎn)單、檢驗(yàn)批次大、操作簡(jiǎn)便，適于大批量檢驗(yàn)及在線監(jiān)測(cè)。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102759625SQ201210260609
公開日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月26日
發(fā)明者付明磊, 刁珂, 曾建紅, 王娟, 陳旭, 黃鳳香 申請(qǐng)人:桂林醫(yī)學(xué)院