專利名稱：一種莪術(shù)醇的微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物及其用途和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，確切地說(shuō)它是一種莪術(shù)醇的微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物及其醫(yī)藥用途和制備方法。

背景技術(shù)：
病毒作為一種致病源，一直以來(lái)都是藥物研究工作者的關(guān)注對(duì)象。由于其對(duì)宿主細(xì)胞的侵染性強(qiáng)，破壞不可逆轉(zhuǎn)并且難以徹底消滅，對(duì)人類健康造成了嚴(yán)重的威脅。莪術(shù)為姜科多年生草本，亦稱“蓬莪術(shù)”、“山姜黃”，根莖入中藥。綱目名蓬莪茂，列入草部芳香部。本品為植物蓬莪術(shù)Curcuma phaeocaulisValeton、廣西莪術(shù)Curcuma kwangsiensis S.G..Lee et C.F.Liang或溫郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根莖，自古就被認(rèn)為有行氣破血、消積止痛的功效，用于治療淤血經(jīng)閉、食積脹痛等癥。近年研究發(fā)現(xiàn)其揮發(fā)油具有抗病毒功用，莪術(shù)靜脈注射液對(duì)呼吸道合胞病毒(RSV)有直接滅活作用。(鄭企靜，復(fù)方莪術(shù)注射液治療嬰幼兒病毒肺炎的試驗(yàn)和臨床研究。友誼醫(yī)刊，1986，19(3)88-92)。研究表明莪術(shù)靜脈注射液治療幼兒RSV肺炎有較好療效且無(wú)副作用，其機(jī)理包括(1)抑制病毒作用；(2)改善肺部微循環(huán)；(3)減輕支氣管的高過(guò)敏反應(yīng)(閻田玉，莪術(shù)靜脈注射液治療小兒呼吸道合胞病毒肺炎及其作用原理。中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，1992，12(12)711-715)。莪術(shù)醇為莪術(shù)揮發(fā)油中主要有效成份之一，對(duì)病毒有明顯的滅活作用，但其缺點(diǎn)在于水溶性很差，難以制成良好的藥物劑型，而且具有一定的毒性，LD50為250mg/kg(遼寧中醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)系腫瘤組，溫莪術(shù)有效成分抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究。新醫(yī)藥學(xué)雜志，1976，17(12)28-32)。因此一直以來(lái)未被開發(fā)為臨床用藥。
所謂微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)就是利用微生物代謝過(guò)程中某個(gè)或一組酶對(duì)底物進(jìn)行催化的反應(yīng)。具有高度立體選擇性，不僅對(duì)結(jié)構(gòu)有化學(xué)選擇性和非對(duì)映異構(gòu)體選擇性，并且有嚴(yán)格的區(qū)域選擇性、面選擇性和對(duì)映異構(gòu)體選擇性。而且反應(yīng)條件溫和，公害少，成本低廉。對(duì)中藥成分生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行研究，其主要目的就是通過(guò)對(duì)中藥有效成分在微生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的研究來(lái)尋找新藥源，以及對(duì)新活性成分的發(fā)現(xiàn)、新前體物質(zhì)的制備，都有著極其重要的意義。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是尋找較莪術(shù)醇更加高效低毒，具有較好水溶性，更適合藥物制劑的有效化合物一種莪術(shù)醇的微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物及其醫(yī)藥用途和制備方法。本試驗(yàn)使用黑曲霉(AS 3.739)對(duì)莪術(shù)醇進(jìn)行了微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，獲得了一種具有抗病毒活性的新化合物--3β羥基莪術(shù)醇，該化合物為莪術(shù)醇在黑曲霉作用下的主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，收率約為26％。
本發(fā)明中轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可以由以下方式得到 a)微生物的培養(yǎng)將微生物從固體培養(yǎng)基接種至預(yù)先配置好的液體土豆培養(yǎng)基(含2％葡萄糖)中，置于恒溫振蕩器中于180rpm，25C條件下培養(yǎng)兩日。
b)加入底物將底物溶于適量丙酮中，配成10mg/ml丙酮溶液。加入已培養(yǎng)2日的微生物發(fā)酵液中，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)5日。
c)發(fā)酵液的處理發(fā)酵液抽濾后收集濾液，在減壓條件下低溫濃縮至小體積，用等體積乙酸乙酯萃取3遍，萃取液合并濃縮至干，獲得粗浸膏。
d)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離純化將步驟c)得到的粗浸膏用硅膠柱層析分離，以環(huán)己烷∶丙酮梯度洗脫(100，50∶1，25∶1，20∶1，10∶1，5∶1)。在10∶1洗脫部分得到無(wú)色結(jié)晶即為所需轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。其純度經(jīng)薄層色譜和高效液相色譜(檢測(cè)器UV、RID)檢測(cè)達(dá)到99.1％(見附圖1和2) 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為(1)
所示的-3β-羥基莪術(shù)醇化合物。
所述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為-3β-羥基莪術(shù)醇化合物可用于制備抗病毒藥物。
利用微生物黑曲霉(AS3.739)對(duì)底物莪術(shù)醇進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，并利用乙酸乙酯對(duì)發(fā)酵液中的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行萃取、利用硅膠柱層析法進(jìn)行轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離制備。
所制得的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其純度根據(jù)薄層色譜和高效液相色譜檢測(cè)可達(dá)到99％以上。
該化合物具有以下理化數(shù)據(jù)colorless needles；[α]25D＝-49.4 (c 0.13，MeOH)；HRMScalcd for C15H25O3[M+H]+，253.1798，found 253.1795；IR νmax(KBr)3433，3073，2968，1646，1460，1367，1333，1281，1131，1053，989，893，799，613cm-1；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ0.87(d，J＝6.5Hz，3H，H-13)，1.00(d，J＝6.4Hz，3H，H-12)，1.10(d，J＝7.0Hz，3H，H-15)，1.25(q，J＝6.7Hz，1H，H-6β)，1.45(m，J＝6.8Hz，1H，H-7)，1.62(o，1H，H-2a)，1.71(o，1H，H-11)，1.80(o，1H，H-4)，2.15(t，J＝12.3Hz，1H，H-6α)，2.18(o，1H，H-2b)，2.49(t，J＝14.6Hz，1H，H-9a)，2.51(o，1H，H-1)，2.55(t，J＝14.9Hz，1H，H-9b)，4.11(t，J＝6.5Hz，1H，H-3)，4.91(t，J＝3.0Hz，2H，H-14).13C NMR(CDCl3，100MHz)δ10.1(C-15)，21.4(C-12)，23.0(C-13)，28.5(C-11)，35.0(C-6)，38.5(C-9)，38.9(C-2)，49.4(C-4)，51.7(C-1)，56.2(C-7)，79.3(C-3)，88.1(C-5)，104.6(C-8)，113.6(C-14)，143.4(C-10).(見附圖2) 經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該化合物具有顯著的抗病毒活性?？赏苽淇共《舅幬?。



圖1為莪術(shù)醇轉(zhuǎn)化產(chǎn)物正相高效薄層色譜圖。(薄層條件正相高效薄層板，展開條件環(huán)己烷∶丙酮(2∶1)，顯色條件10％H2SO4) 圖2為莪術(shù)醇轉(zhuǎn)化產(chǎn)物反相高效薄層色譜圖。
圖3為莪術(shù)醇轉(zhuǎn)化產(chǎn)物高效液相色譜分析圖(紫外檢測(cè)器)(分析色譜柱VP-ODS；流動(dòng)相50％MeOH；流速1ml/min) 圖4為莪術(shù)醇轉(zhuǎn)化產(chǎn)物高效液相色譜分析圖(示差檢測(cè)器)(分析色譜柱VP-ODS；流動(dòng)相50％MeOH；流速Iml/min)
具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1取底物莪術(shù)醇500mg，溶解后加入已培養(yǎng)2日的微生物發(fā)酵液中，繼續(xù)培養(yǎng)5日后取下?lián)u瓶。發(fā)酵液抽濾除去菌絲體，合并濾液，濃縮至小體積，用等體積乙酸乙酯萃取3遍，萃取液合并濃縮至干，得1.2g粗浸膏。將該浸膏用甲醇溶解，拌入3g100-140目硅膠，揮發(fā)溶劑至于，待上樣。取50g200-300目硅膠，濕法裝柱，然后加入處理好的樣品，進(jìn)行柱層析。用環(huán)己烷∶丙酮梯度洗脫(100，50∶1，25∶1，20∶1，10∶1，5∶1)。在10∶1洗脫部分獲得無(wú)色結(jié)晶130mg(收率為26％)，即為轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。
試驗(yàn)例1本發(fā)明轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的體外抗病毒試驗(yàn) 用Hela細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層。
(1)細(xì)胞毒性試驗(yàn)將莪術(shù)醇和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別稀釋為100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml.等濃度，將上述用培養(yǎng)液稀釋好的不同濃度的藥品滴加于Hela單層細(xì)胞上，每孔0.2ml，37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)，每天鏡下觀察細(xì)胞病變(CPE)，求出藥液致細(xì)胞毒性，計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞毒性濃度。結(jié)果表明莪術(shù)醇在25μg/ml及以上稀釋的各濃度對(duì)Hela細(xì)胞無(wú)毒性作用；轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在50μg/ml及以上稀釋的各濃度對(duì)Hela細(xì)胞無(wú)毒性作用。
(2)藥物對(duì)病毒致細(xì)胞病變作用的影響在Hela細(xì)胞上分別加入6種病毒液(流感病毒FM1株，呼吸道合胞病毒(RSV)，腺病毒3型(AdV-III)，柯薩奇病毒B3(CVB3)株，副流感病毒，單純皰疹病毒I型(HSV-I)SM44株)在37℃吸附1h后洗去病毒液，加入無(wú)毒界限藥液(莪術(shù)醇25μg/ml、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物50μg/ml、病毒唑62.5μg/ml)，同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照，細(xì)胞對(duì)照。置37℃ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天在倒置顯微鏡下觀察病變，連續(xù)7d，記錄各孔病變情況。結(jié)果表明轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在體外有較好的抑制抗流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒III型和單純皰疹病毒I型的致細(xì)胞病變作用，如下表所示 表1莪術(shù)醇及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對(duì)病毒致細(xì)胞病變作用的影響 病毒株 流感病毒 副流感病毒 CVB5RSV AdVIII HSV-I 感染量100100301003050 莪術(shù)醇+±++±++ 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物± -+-±± 病毒唑± -±-±- 細(xì)胞對(duì)照- --- --病毒對(duì)照++++++++++++ ++++++++ ++++ (注-示無(wú)細(xì)胞病變；±示有延緩細(xì)胞病變作用；+示1/4以下的細(xì)胞病變；++示1/4～1/2的細(xì)胞有病變；+++示1/2～3/4的細(xì)胞有病變；++++示3/4以上的細(xì)胞有病變。) 體外抗病毒試驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)化產(chǎn)物較底物莪術(shù)醇的毒性降低了一倍，在相同毒性條件下，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的抗病毒活性較強(qiáng)，和陽(yáng)性對(duì)照藥病毒唑基本相當(dāng)。
試驗(yàn)例2本發(fā)明轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在小鼠體內(nèi)抗RSV病毒試驗(yàn) 取昆明種小鼠95只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組A組22只，RSV感染(感染組)；B組23只，RSV感染后，腹腔注射乙醇異丙醇溶液(1∶10)(對(duì)照組)；C組25只，RSV感染后，腹腔注射轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的乙醇異丙醇溶液(1mg/ml)(治療組)；D組25只，RSV感染后，腹腔注射病毒唑水溶液(1mg/ml)(藥物對(duì)照組)。小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，經(jīng)鼻腔滴入1∶5稀釋的RSV懸液0.2ml，4h后，B組給以乙醇異丙醇溶液0.5ml/只；C組給以藥液0.5ml/只；D組給以病毒唑0.5ml/只。每日一次，7日為一療程，分別于5、8天將鼠處死，無(wú)菌取肺，用于RSV分離。
表2感染RSV病毒5、8天鼠肺RSV分離陽(yáng)性率比較 組別 鼠數(shù)5天鼠數(shù)8天感染數(shù)感染率％感染數(shù)感染率％感染組對(duì)照組治療組 藥物對(duì)照組 11 11 12 1211115410010041.733.3 11 12 13 1311113310091.723.123.1 經(jīng)X2檢驗(yàn)，治療組與感染組及對(duì)照組之間有較顯著差異(5天P＜0.001，8天P＜0.0001)，而與藥物對(duì)照組的感染率接近(P＞0.05)，該結(jié)果表明轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在動(dòng)物模型體內(nèi)具有抑制RSV病毒作用。
試驗(yàn)例3本發(fā)明轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在小鼠體內(nèi)抗副流感病毒試驗(yàn) 取昆明種小鼠70只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組14只。A組副流感病毒感染(感染組)；B組副流感病毒感染后，腹腔注射乙醇異丙醇溶液(1∶10)(對(duì)照組)；C組副流感病毒感染后，腹腔注射轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的乙醇異丙醇溶液(1mg/ml)(治療組)；D組副流感病毒感染后，腹腔注射病毒唑水溶液(1mg/ml)(藥物對(duì)照組)；E組不感染病毒，腹腔注射乙醇異丙醇溶液(陰性對(duì)照組)。小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，經(jīng)鼻腔滴入未稀釋的病毒液0.05ml，1h后，B組給以乙醇異丙醇溶液0.5ml/只；C組給以藥液0.5ml/只；D組給以病毒唑0.5ml/只；E組不感染病毒，給以乙醇異丙醇溶液0.5ml/只。每日一次，7日為一療程，連續(xù)觀察14天，記錄小鼠死亡情況。
表3感染副流感病毒14天后小鼠的死亡情況組別鼠數(shù)死亡數(shù)死亡率(％)感染組對(duì)照組14141414100100治療組 藥物對(duì)照組 陰性對(duì)照組14141432021.414.30 經(jīng)X2檢驗(yàn)，治療組與感染組及對(duì)照組之間有較顯著差異(P＜0.0001)，而與藥物對(duì)照組的死亡率接近(P＞0.05)，該結(jié)果表明轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在動(dòng)物模型體內(nèi)具有抑制副流感病毒作用。
實(shí)施例3 取3β羥基莪術(shù)醇50g，加入淀粉細(xì)粉160g，用等量遞增法混勻，用80％的乙醇，制成顆粒，干燥，整粒，混勻，加入化石粉4g，硬脂酸鎂1.6g壓片即得(1000片)，每日兩次，每次一片。
實(shí)施例4 取3β羥基莪術(shù)醇100g，加入淀粉細(xì)粉200g，化石粉10g，硬脂酸鎂5g，制成顆粒，干燥，裝入膠囊(2000粒)，每日兩次，每次一粒。
實(shí)施例5 取3β羥基莪術(shù)醇50g，微晶纖維素250g，交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮70g，混勻，加入適量乙醇制粒，干燥、整粒，在加入羧甲基淀粉鈉8g，硬脂酸鎂4g，混勻，壓片(1000片)，每日兩次，每次一片。
權(quán)利要求
1、一種莪術(shù)醇的微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其特征在于轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為(1)
所示的3β-羥基莪術(shù)醇化合物。
2、根劇權(quán)力要求1所述的一種莪術(shù)醇的微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其特征在于所述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物3β-羥基莪術(shù)醇化合物可用于制備抗病毒藥物。
3、一種如權(quán)力要求1所述的莪術(shù)醇的微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的制備方法，其特征在于利用微生物黑曲霉(AS3.739)對(duì)底物莪術(shù)醇進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，并利用乙酸乙酯對(duì)發(fā)酵液中的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行萃取、利用硅膠柱層析法進(jìn)行轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離制備。
4、據(jù)權(quán)利要求3所述的莪術(shù)醇的微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的制備方法，其特征在于所制得的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其純度根據(jù)薄層色譜和高效液相色譜檢測(cè)可達(dá)到99％以上。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種莪術(shù)醇的微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物及其用途和制備方法。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為3β－羥基莪術(shù)醇化合物。所述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物3β－羥基莪術(shù)醇化合物可用于制備抗病毒藥物。利用微生物黑曲霉(AS3.739)對(duì)底物莪術(shù)醇進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，并利用乙酸乙酯對(duì)發(fā)酵液中的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行萃取、利用硅膠柱層析法進(jìn)行轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離制備。所制得的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其純度根據(jù)薄層色譜和高效液相色譜檢測(cè)可達(dá)到99％以上。
文檔編號(hào)C07D493/08GK1680568SQ20051004577
公開日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2005年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月26日
發(fā)明者邱峰, 姚新生, 張卉, 曲戈霞 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)藥科大學(xué)