專利名稱：一種莪術(shù)醇半抗原和人工抗原及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種莪術(shù)醇半抗原、人工抗原及其制備方法，屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
免疫分析是一種基于抗原抗體抗原抗體特異性識別和結(jié)合反應(yīng)的分析方法，不僅可用于測 定蛋白質(zhì)、酶等大分子物質(zhì)，而且還廣泛用于測定小分子量的藥物，特別適用于那些色譜法 難以分析的藥物，該法已成為藥物分析中一種必不可少的基本檢測技術(shù)。免疫分析不僅為臨 床診斷提供了依據(jù)，在內(nèi)分泌學(xué)、病毒學(xué)、藥理學(xué)、血液學(xué)及腫瘤學(xué)等研究方面得以應(yīng)用， 而且在農(nóng)業(yè)科學(xué)、食品科學(xué)、環(huán)境保護(hù)、生態(tài)學(xué)及法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用也有所進(jìn)展。免疫分 析具有檢測靈敏度高、特異性強、前處理簡單、反應(yīng)速度快、檢測費用低廉，適于現(xiàn)場監(jiān)控
和大批量樣品分析的特點。
莪術(shù)醇(curcumol)又名姜黃環(huán)奧醇，姜黃醇，屬萜類化合物，是莪術(shù)揮發(fā)油中的重要成分。 具有抗癌、抗早孕、抗病毒、抗突變、保肝、活血化瘀等藥理作用。特別是在免疫分析檢測 方面具有獨特作用，但莪術(shù)醇為小分子天然化合物，相對分子質(zhì)量較小，僅具有反應(yīng)原性，
而不具有免疫原性，因此不能直接采用免疫方法檢測，需要與大分子蛋白等偶聯(lián)形成復(fù)合物 后才能成為完全抗原。但是小分子化合物必須具有或衍生出能與載體進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)的功能基 團(如氨基，羧基，重氮基等)，對于含羥基的半抗原需要將其羥基衍生為羧基再與蛋白質(zhì)載 體交聯(lián)合成人工抗原。根據(jù)莪術(shù)醇結(jié)構(gòu)中存在C6羥基的特點，先將莪術(shù)醇的羥基衍生為羧基， 然后再與大分子蛋白偶聯(lián)形成復(fù)合物，從而成為完全抗原才行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種莪術(shù)醇半抗原和人工抗原；
本發(fā)明的另一個目的是要提供上述莪術(shù)醇半抗原和人工抗原的制備方法，所制備出的產(chǎn)品 用于含有莪術(shù)醇的中草藥的免疫方法研究，其制備方法合成步驟簡單，實驗條件溫和，產(chǎn)物 容易得到，且產(chǎn)率較高。
實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是 一種莪術(shù)醇半抗原和人工抗原的制備方法，以莪術(shù)醇為原料， 利用丁二酸酐與莪術(shù)醇反應(yīng)生成莪術(shù)醇琥珀酸單酯(Cur-HS)，得到莪術(shù)醇人工半抗原，用MS 質(zhì)譜和130NMR譜測定半抗原的結(jié)構(gòu)；將莪術(shù)醇半抗原制備成吡啶水溶液，然后使之與牛血清 蛋白結(jié)合，制得莪術(shù)醇人工抗原，即Cur-HS-BSA，用MALDI-T0F-MS鑒定莪術(shù)醇人工抗原； 其反應(yīng)方程式為
(1)莪術(shù)醇琥珀酸單酯(Cur,HS)
莪術(shù)醇 丁二酸酐 莪術(shù)醇琥珀酸單酉i莪術(shù)醇琥珀酸單酯 牛血清蛋白 莪術(shù)醇人工抗原本發(fā)明所述莪術(shù)醇半抗原的制備方法步驟如下1、 取三氯甲烷置于反應(yīng)瓶，加入少量無水MgS04，攪拌過夜，濾去MgS04;2、 取上述濾液，加入莪術(shù)醇和丁二酸酐，攪拌溶解，加入適量的4-甲基氨基吡啶，于65 'C回流，TLC檢測反應(yīng)進(jìn)度，反應(yīng)結(jié)束，冷卻；3、 將反應(yīng)物傾入冰水中，用乙醚萃取，合并有機相，回收有機溶劑，得莪術(shù)醇半抗原粗D叩54、 用石油醚-乙酸乙酯進(jìn)行硅膠柱層析，得到純度較高的莪術(shù)醇丁二酯油狀物，此即為莪 術(shù)醇半抗原莪術(shù)醇琥珀酸單酯，置4'C冰箱保存；所述石油醚與乙酸乙酯的體積比為8 : 1。將上述所得產(chǎn)品用MS質(zhì)譜和13C-NMR譜測定其結(jié)構(gòu)，從Cur-HS的MS (APCI) m/z:337.14(M—)，推出其分子量為336，初步認(rèn)為Cur-HS為合成的目標(biāo)產(chǎn)物；再分別測定出 原莪術(shù)醇、Cur-HS的13C-NMR譜，比較兩者13C-醒R譜的不同，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物多出S 172. 48， 169. 15， 30. 2， 29.13，共四條譜線，其中S 169.15為莪術(shù)醇成丁二酸單酯后酯羰基碳原子，S 172. 48 為莪術(shù)醇成丁二酸單酯鏈羧基羰基碳原子，而S 29. 13， 5 30. 2為丁二酸單酯鏈中2個亞甲 基碳原子。結(jié)合MS的數(shù)據(jù)，對原料莪術(shù)醇和和合成出的產(chǎn)物碳譜的化學(xué)位移數(shù)據(jù)的差異分析 表明，從而確定合成出的產(chǎn)物就是所需要的目標(biāo)產(chǎn)物Cur-HS。本發(fā)明所述莪術(shù)醇人工抗原的制備方法步驟如下1、 稱取莪術(shù)醇琥珀酸單酯，加入吡啶和H20，攪拌溶解，所加入的吡啶與H20的體積比為 1 二 1;2、 稱取BSA，加入PH8. 0的碳酸氫鈉緩沖液，攪拌溶解，加入l-乙基-3 (3-二甲基氨基 丙基)碳二亞胺(EDC)，將莪術(shù)醇丁二酸單脂的吡啶水溶液加入前反應(yīng)液中，于室溫反應(yīng)15 小時；3、 將其反應(yīng)物裝入透析袋，用純凈水于4'C透析，每5小時換水一次，透析3天，經(jīng)冷 凍干燥，得莪術(shù)醇人工抗原Cur-HS-BSA，于-2(TC下保存。將上述所得產(chǎn)品用MALDI-TOF-MS進(jìn)行鑒定，其鑒定方法是(1)先配置基質(zhì)輔助溶液將O. 15%三氟醋酸(TFA) 666ul加入到乙腈(CH3CN) 333ul 中，取lOmg芥子酸加入到前配的O. 15y。TFA-CH3CN混合液lul，超聲波10-15min后溶解，備 用；(2) 供試品處理取Cur-HS-BSA，溶解在8mol/L的尿素溶液中，然后將其稀釋成濃度 在l-10pmol/L;另稱取BSA0.5mg溶于水100ul，配置成5mg/ml的BSA水溶液。(3) MALDI-T0F-MS測定各取供試品和基質(zhì)輔助溶液lul，充分混勻，吸取混合液lul 滴加在鍍金樣品板上，室溫下晾干后，送入質(zhì)譜儀分析。結(jié)合比=(偶聯(lián)物相對分子質(zhì)量-蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量)/莪術(shù)醇相對分子質(zhì)量 結(jié)合比=(73302.3-66713.4) /336. 42=19. 6。根據(jù)MALDI-T0F-MS圖譜，可以清晰的判斷出Cur-HS與BSA偶聯(lián)形成了新的復(fù)合物，改 復(fù)合物的相對分子質(zhì)量約為73302;對比BSA的相對分子質(zhì)量66731以及Cur-HS的相對分 子質(zhì)量336，可以求出Cur-HS-BSA的結(jié)合比19.6，本試驗中人工合成的半抗原-蛋白復(fù)合物 Cur-HS-BSA的結(jié)合數(shù)值較大，每個載體蛋白分子平均與19.6個半抗原分子結(jié)合，說明半抗 原與載體的偶聯(lián)情況良好，這為后續(xù)的抗莪術(shù)醇抗體的制備提供了可靠的實驗基礎(chǔ)。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明合成了莪術(shù)醇的半抗原和人工抗原，所制備的產(chǎn)品可用于含莪 術(shù)醇成分樣品的研究，合成步驟簡單，所需的實驗條件溫和，在常溫下就能進(jìn)行，產(chǎn)物容易 得到，且產(chǎn)率較高，有效，完全可用于免疫分析中，為以后人們的研究提供了方便，可以滿 足國內(nèi)外對其研究的需要。


圖1為莪術(shù)醇13C-NMR圖2為莪術(shù)醇琥珀酸單酯(Cur.-HS) 13C-NMR 圖3為莪術(shù)醇琥珀酸單酯(Cur.-HS) MS (APCI) 圖4為牛血清蛋白(BSA)的MALDI-TOF-MS譜圖 圖5為莪術(shù)醇人工抗原(Cur-HS-BSA)的MALDI-TOF-MS譜圖具體實施方式
實施例1一種莪術(shù)醇人工半抗原的制備方法按如下步驟進(jìn)行(1) 稱取莪術(shù)醇0.1170g (即0.495函o1)與丁二酸酐0.12g (即1.2mmol);(2) 取10ml三氯甲烷置于反應(yīng)瓶，加入少量無水MgS04,攪拌過夜，濾去MgS04;(3) 取上述濾液，將稱好的莪術(shù)醇與丁二酸酐加入到濾液中，攪拌溶解，加入適量的4-甲基氨基吡啶，于65"回流，TLC檢測反應(yīng)進(jìn)度，反應(yīng)結(jié)束，冷卻；(4) 將反應(yīng)物傾入冰水中，用乙醚萃取，合并有機相，回收有機溶劑，得莪術(shù)醇半抗原 粗品；(5) 用石油醚-乙酸乙酯進(jìn)行硅膠柱層析，得到純度較高的莪術(shù)醇丁二酯油狀物O. 1450g， 產(chǎn)率87%，此即為莪術(shù)醇半抗原莪術(shù)醇琥珀酸單酯0.431mmo1，置4'C冰箱保存，石油醚-乙 酸乙酯的體積比為8:1。實施例2(1) 稱取莪術(shù)醇0.234g (即0.99mmoD與丁二酸酐0.24g (即2.4mmol);(2) 取20ml三氯甲烷置于反應(yīng)瓶，加入少量無水MgS04,攪拌過夜，濾去MgS04;(3) 取上述濾液，將稱好的莪術(shù)醇與丁二酸酐加入到濾液中，攪拌溶解，加入適量的4-甲基氨基吡啶，于65'C回流，TLC檢測反應(yīng)進(jìn)度，反應(yīng)結(jié)束，冷卻；(4) 將反應(yīng)物傾入冰水中，用乙醚萃取，合并有機相，回收有機溶劑，得莪術(shù)醇半抗原粗品；(5) 用石油醚-乙酸乙酯進(jìn)行硅膠柱層析，得到純度較高的莪術(shù)醇丁二酯油狀物0. 29g， 產(chǎn)率87%，此即為莪術(shù)醇半抗原莪術(shù)醇琥珀酸單酯0.862mmo1，置4'C冰箱保存，石油醚-乙 酸乙酯的體積比為8 : 1。實施例3一種莪術(shù)醇人工抗原的制備方法按如下步驟進(jìn)行(1) 稱取4. 15mg(12.3Xl(Tmo1)莪術(shù)醇琥珀酸單酯，加吡啶與水的混合液250ul (二者 體積比為h l),攪拌溶解；(2) 稱取BSA2.8mg (4. 2X 10—5mmol),加入PH8. 0的碳酸氫鈉緩沖液250ul，攪拌溶解， 加入l-乙基-3 (3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)4.7mg(24.6X10-6mol)，將莪術(shù)醇丁二酸 單脂的吡啶水溶液加入前反應(yīng)液中，于室溫反應(yīng)15小時；(3) 將其反應(yīng)物裝入透析袋，用純凈水于4'C透析，每5小時換水一次，透析3天，經(jīng)冷 凍干燥，得1. 60mg莪術(shù)醇人工抗原Cur-HS-BSA，產(chǎn)率52%，于-20'C下保存。實施例4(1) 稱取8.3mg(24.6Xl(Tmo1)莪術(shù)醇琥珀酸單酯，加吡啶與水的混合液250ul(二者體 積比為l: l)，攪拌溶解；(2) 稱取BSA5.6mg (8. 4X l(T誦ol)，加入PH8. 0的碳酸氫鈉緩沖液250ul，攪拌溶解， 加入l-乙基-3 (3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)9.4mg(49.2X10-6mol)，將莪術(shù)醇丁二酸 單脂的吡啶水溶液加入前反應(yīng)液中，于室溫反應(yīng)15小時；(3) 將其反應(yīng)物裝入透析袋，用純凈水于4'C透析，每5小時換水一次，透析3天，經(jīng)冷 凍干燥，得3. 2mg莪術(shù)醇人工抗原Cur-HS-BSA,產(chǎn)率52%，于-2(TC下保存。權(quán)利要求
1、一種莪術(shù)醇半抗原，其特征在于它以莪術(shù)醇為原料，應(yīng)用丁二酸酐與莪術(shù)醇反應(yīng)生成莪術(shù)醇琥珀酸單酯制得，其分子結(jié)構(gòu)式為
2、 一種莪術(shù)醇半抗原的制備方法，其特征在于該方法步驟如下(1) 取三氯甲垸置于反應(yīng)瓶，加入少量無水MgS04，攪拌過夜，濾去MgS04;(2) 取上述濾液，加入莪術(shù)醇和丁二酸酐，攪拌溶解，加入適量的4-甲基氨基吡啶，于65'C回流，TLC檢測反應(yīng)進(jìn)度，反應(yīng)結(jié)束，冷卻;(3) 將反應(yīng)物傾入冰水中，用乙醚萃取，合并有機相，回收有機溶劑，得莪術(shù)醇半抗原粗品；(4) 用石油醚-乙酸乙酯進(jìn)行硅膠柱層析，得到莪術(shù)醇丁二酯油狀物，此即為莪術(shù)醇半抗原，置4'C冰箱保存，所述的石油醚與乙酸乙酯的體積比為8 : 1。
3、 一種莪術(shù)醇人工抗原，其特征在于它以莪術(shù)醇為原料，應(yīng)用丁二酸酐與莪術(shù)醇反應(yīng)生成莪術(shù)醇琥珀酸單酯制得莪術(shù)醇人工半抗原，用MS質(zhì)譜和13C_NMR譜測定半抗原的結(jié)構(gòu)，再將莪術(shù)醇半抗原制備成吡啶水溶液，然后再與牛血清蛋白結(jié)合制成，其分子結(jié)構(gòu)式為<formula>formula see original document page 2</formula>
4、 一種莪術(shù)醇人工抗原的制備方法，其特征在于該方法步驟如下(1) 稱取莪術(shù)醇琥珀酸單酯，加入吡啶和H20，攪拌溶解，所加入的吡啶H20的體積比為l:l;(2) 稱取BSA,加入碳酸氫鈉緩沖液，攪拌溶解，加入1-乙基-3 (3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺,將莪術(shù)醇丁二酸單脂的吡啶水溶液加入前反應(yīng)液中，于室溫反應(yīng)15小時；(3) 將其反應(yīng)物裝入透析袋，用純凈水于4'C透析，每5小時換水一次，透析3天，經(jīng)冷凍干燥，得Cur-HS-BSA，于-20'C下保存。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種莪術(shù)醇半抗原和人工抗原及其制備方法，所制備的莪術(shù)醇半抗原的結(jié)構(gòu)式為右式(Ⅰ)，人工抗原的結(jié)構(gòu)式為右式(Ⅱ)，其制備方法為本發(fā)明以莪術(shù)醇為原料，利用丁二酸酐與莪術(shù)醇反應(yīng)生成莪術(shù)醇琥珀酸單酯(Cur-HS)，得到人工半抗原，將莪術(shù)醇的半抗原制備成吡啶水溶液，然后使之與牛血清蛋白結(jié)合，制備出莪術(shù)醇的人工抗原。本發(fā)明合成了莪術(shù)醇的半抗原和人工抗原，所制備的產(chǎn)品可用于含莪術(shù)醇成分樣品的研究，合成步驟簡單，所需的實驗條件溫和，在常溫下就能進(jìn)行，產(chǎn)物容易得到，且產(chǎn)率較高，有效，完全可用于免疫分析中，為以后人們的研究提供了方便，可以滿足國內(nèi)外對其研究的需要。
文檔編號C07K14/435GK101671345SQ20091011445
公開日2010年3月17日 申請日期2009年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月28日
發(fā)明者付明磊, 平 戴, 曾建紅, 楊新平, 娟 王, 旭 陳, 黃鳳香 申請人:桂林醫(yī)學(xué)院