多效唑半抗原、抗原、抗體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及半抗原、抗原、抗體及其制備方法，特別設(shè)及一種多效挫半抗原、抗原、 抗體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（PlantGrowthRegulator)是一類(lèi)具有植物激素活性的人工合 成農(nóng)藥，可用于調(diào)節(jié)果蔬的生長(zhǎng)和膽藏，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量發(fā)揮著 重要作用。多效挫是20世紀(jì)70年代末英國(guó)化學(xué)公司研制開(kāi)發(fā)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，是一種 高效低毒的生長(zhǎng)延緩劑，它能夠降低赤霉素和嗎I噪乙酸的含量，增加乙締的釋放量，提高抗 倒伏、抗旱等抗逆性，增加產(chǎn)量，改善作物品質(zhì)。然而隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，有關(guān)植物生長(zhǎng)調(diào) 節(jié)劑安全性的報(bào)道越來(lái)越引起世界各國(guó)普遍關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，多效挫在±壤中殘留半衰期 較長(zhǎng)，可能對(duì)非目標(biāo)物產(chǎn)生危害，因此很多國(guó)家對(duì)多效挫在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留量有嚴(yán)格的限 量標(biāo)準(zhǔn)。
[0003] 目前，歐盟、澳大利亞、日本、韓國(guó)、新加坡等國(guó)均已制定果蔬中多種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié) 劑的限量。其中，歐盟規(guī)定蔬菜、水果（除葡萄）、葡萄中多效挫的限量分別為〇.〇2mg/kg、 0. 5mg/kg、0. 05mg/kg;澳大利亞規(guī)定各類(lèi)熱帶和亞熱帶水果（除鱷梨和芒果）、鱷梨、芒果、 大麥和小麥中多效挫的限量分別為0.01mg/kg、0.lmg/kg、lmg/kg、0.Img/kg;日本規(guī)定桃、 蘋(píng)果、香蕉中多效挫的限量分別為0. 2mg/kg、0. 5mg/kg、0.Olmg/kg;韓國(guó)規(guī)定桃、杏、李子 和樓桃中多效挫的限量為0. 〇5mg/kg，蘋(píng)果中多效挫限量為0. 5mg/kg;新加坡規(guī)定鱷梨和 核果中多效挫的限量為0.Olmg/kg。我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2763-2014(食品中農(nóng)藥最 大殘留限量）對(duì)多效挫殘留量的規(guī)定如下：稻谷、小麥、花生仁、菜巧油、蘋(píng)果、慕枝中多效 挫的限量為0. 5mg/kg，油菜巧中多效挫的限量為0. 2mg/kg。
[0004] 傳統(tǒng)的多效挫殘留分析方法，主要是依靠液相色譜法、氣相色譜法或質(zhì)譜法等儀 器分析方法，檢測(cè)儀器昂貴，運(yùn)些檢測(cè)方法雖然能夠滿足限量檢測(cè)的需要，但存在操作過(guò)程 繁瑣復(fù)雜、成本較高、分析速度慢等問(wèn)題，不適用于大批量樣品的篩選檢測(cè)。免疫分析，由于 在抗原抗體的定性定量方面獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和操作簡(jiǎn)便快速、成本低、靈敏度較高、分析樣本量 大的優(yōu)點(diǎn)彌補(bǔ)了理化分析的不足，在化合物殘留檢測(cè)中起著越來(lái)越重要的作用。 陽(yáng)〇化]影響免疫化學(xué)分析質(zhì)量的根本因素是抗體的特異性與親和性，運(yùn)些性質(zhì)又決定于 免疫半抗原分子的結(jié)構(gòu)，因此免疫半抗原的分子設(shè)計(jì)與合成就是產(chǎn)生特異性抗體和建立小 分子化合物殘留快速檢測(cè)技術(shù)最基礎(chǔ)和最關(guān)鍵的步驟。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種高免疫原性的多效挫人工半抗原、抗原并獲得抗體。 同時(shí)達(dá)到制備方法重復(fù)性好、易于標(biāo)準(zhǔn)化及可保證無(wú)限量供應(yīng)的目標(biāo)。
[0007] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種多效挫半抗原，其特征在于，所述多效挫半抗 原具有如下結(jié)構(gòu)式：
[0008]
[0009] 本發(fā)明還提供了所述多效挫半抗原的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0010] S1、按1:1的摩爾比稱取多效挫和4-(漠甲基）苯甲酸，(TC溶于四氨巧喃中；向所 得四氨巧喃溶液中加入氨化鋼，冰浴下攬拌30~60min后，室溫下攬拌30~60min;加入 艦化鐘反應(yīng)，加熱回流10~1她；所述多效挫與四氨巧喃的質(zhì)量體積比為1:20g/ml，所述多 效挫與氨化鋼的質(zhì)量比為10:3,所述多效挫與艦化鐘的質(zhì)量比為（15~20) :1 ;
[0011] S2、將步驟S1得到的反應(yīng)液冷卻至室溫，加水后，加入2mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)抑至5 ; 60~70°C旋蒸除四氨巧喃；所述水的加入量為步驟S1所述多效挫質(zhì)量的10倍；
[0012] S3、用乙酸乙醋萃取步驟S2得到的有機(jī)相3~5次；將得到的萃取相通過(guò)無(wú)水硫 酸鋼干燥，直至溶劑完全揮干；
[0013] S4、將步驟S3得到的殘留物用沸程為60~90°C的石油酸與乙酸乙醋按體積比 4:1配制成的淋洗液淋洗過(guò)硅膠柱；而后，將淋洗液濃縮至多效挫加入量的0. 5~0. 7倍， 所得濃縮液即為多效挫半抗原；所述硅膠柱規(guī)格為30g，25cm。
[0014] 本發(fā)明所制得的多效挫半抗原為將多效挫進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造得到的簇基化多效挫化 合物，在多效挫的徑基上引入活性官能團(tuán)結(jié)構(gòu)，既最大程度保留了多效挫的特征結(jié)構(gòu)，又具 有可W與載體蛋白發(fā)生偶聯(lián)的活性基團(tuán)。
[0015] 本發(fā)明提供了一種多效挫抗原，其特征在于，所述多效挫抗原具有如下結(jié)構(gòu)式：
[0016]
[0017] 式中：Protein為載體蛋白。
[0018] 本發(fā)明還提供了所述多效挫抗原的制備方法，其特征在于，多效挫半抗原與載體 蛋白通過(guò)氨基與簇基的縮合反應(yīng)偶聯(lián)，即得到多效挫抗原；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、 卵清白蛋白或鑰孔血藍(lán)蛋白。
[0019] 優(yōu)選方式下，所述多效挫抗原的制備方法包括如下步驟：
[0020] T1、稱取所述多效挫半抗原，溶解于無(wú)水二氧六環(huán)試劑中，加入1-(3-二甲氨基丙 基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽巧DC·肥1)、N-^基班巧酷亞胺（N服），室溫下攬拌反應(yīng)6個(gè)小 時(shí)，得到溶液A，備用；所述多效挫半抗原、無(wú)水二氧六環(huán)試劑、1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙 基碳二亞胺鹽酸鹽巧DC·肥1)與N-徑基班巧酷亞胺（N服）的質(zhì)量體積比為5~20mg: 1~ 2. 5ml:60 ~120mg:40 ~60mg;
[0021] 稱取載體蛋白溶于碳酸鹽緩沖液中，得到溶液B，備用；所述載體蛋白與碳酸鹽緩 沖液的質(zhì)量體積比為20~lOOmg:3~15ml;
[0022] T2、將步驟T1得到的溶液A按所述多效挫半抗原與載體蛋白質(zhì)量比5~20:20~ 100的比例加入到溶液B中，室溫?cái)埌?0~1她，裝入透析袋，在PBS緩沖液中4°C透析72 小時(shí)，中間置換所述緩沖液6次；SOOOrmp離屯、30min，得到的上清液即為多效挫抗原溶液；
[0023] 步驟T1所述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清白蛋白或鑰孔血藍(lán)蛋白。
[0024] 本發(fā)明制得的多效挫抗原中，多效挫半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)比為8~11:1，所 述偶聯(lián)比為摩爾比。
[00巧]本發(fā)明所述多效挫人工抗原可W作為免疫原也可W作為檢測(cè)用包被原。
[00%] 本發(fā)明還提供了多效挫抗原制備的抗體，其特征在于，所述抗體通過(guò)將所述多效 挫抗原刺激動(dòng)物機(jī)體免疫應(yīng)答獲得。
[0027] 優(yōu)選方式下，所述抗體為多效挫多克隆抗體。
[0028] 優(yōu)選方式下，所述抗體為多效挫單克隆抗體。
[0029] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0030] 通過(guò)化學(xué)合成多效挫免疫抗原，對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，制備得到高度均質(zhì)、純度高、專 一性強(qiáng)的抗多效挫單克隆抗體，制備方法具有重復(fù)性好、易于標(biāo)準(zhǔn)化及可保證無(wú)限量供應(yīng) 等優(yōu)勢(shì)。
【附圖說(shuō)明】 陽(yáng)03U 圖1為多效挫人工抗原的SDS-PAGE圖。
[0032] 圖2為單克隆抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0033]W下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。W下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置Ξ次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。
[0034] 實(shí)施例中所用的PBS緩沖液均為抑7.4、0.Olmol/L的PBS緩沖液。實(shí)施例中所用 的碳酸鹽緩沖液均為pH9. 6、0.05mol/L的碳酸鋼緩沖液。牛血清白蛋白簡(jiǎn)稱BSA，卵清蛋白 簡(jiǎn)稱OVA，鑰孔血藍(lán)蛋白簡(jiǎn)稱KLH。
[0035] 多效挫，如式（1)所不，購(gòu)自Sigma-Al化ich公司，分子量為293. 79。
[0036]
陽(yáng)037]式（1)
[0038] 4-(漠甲基）苯甲酸，式似所示，購(gòu)自Sigma-Al化ich公司，分子量為214. 0366。
[0039]
W40] 式似
[00川實(shí)驗(yàn)用Ba化/c小鼠和新西蘭白兔由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中屯、提供。
[0042] 實(shí)施例1、制備多效挫半抗原
[0043] 稱取1.Og多效挫和0.73g4-(漠甲基）苯甲酸，在0°C下，溶解于20血四氨巧喃 中，向溶液中加入0. 3g氨化鋼，冰浴下攬拌30min。然后室溫下繼續(xù)攬拌30min后，加入 〇.〇56g艦化鐘后，加熱回流1她。上述反應(yīng)液冷卻到室溫并緩慢加入lOmL蒸饋水，2M肥！ 調(diào)抑到5,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分四氨巧喃，用乙酸乙醋萃取有機(jī)相Ξ次，乙酸乙醋提取 物經(jīng)無(wú)水硫酸鋼干燥后，溶劑被完全揮干。殘留物用石油酸化0-90°C)-乙酸乙醋（4:1，V/ V)淋洗過(guò)硅膠柱（30g，25cm)。淋洗液濃縮至0.7g，即為多效挫半抗原。 W44] 實(shí)施例2、制備多效挫人工抗原
[0045] 1、多效挫免疫原的制備
[0046] 取8mg實(shí)施例1制備得到的多效挫半抗原所示化合物，溶解于1. 0ml無(wú)水二氧 六環(huán)試劑中，分別加入90mg1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽巧DC.肥1)， 53. 5mgN-徑基班巧酷亞胺（N服），室溫下攬拌反應(yīng)6個(gè)小時(shí)，得到多效挫的活化液；稱取載 體蛋白BSA20mg溶于3mL碳酸鹽緩沖液中；向BSA溶液中緩慢加入多效挫活化液，室溫下 磁力攬拌1她，裝入透析袋，在PBS緩沖液中4°C透析72小時(shí)（中間置換緩沖液6次），然后 于SOOOrmp離屯、30min，取上清即為多效挫抗原溶液（多效挫免疫原溶液）；將得到多效挫 抗原溶液分裝于安培瓶中，-20°C保存。偶聯(lián)BSA的多效挫免疫原簡(jiǎn)稱PBZ-BSA，其溶液簡(jiǎn) 稱PBZ-BSA溶液。
[0047] 用同樣的方法可W制備多效挫的偶聯(lián)物PBZ-KLH，或PBZ-0VA。
[0048] 上述方法制備的多效挫偶聯(lián)物同樣可W作為多效挫的包被原。
[0049] 將PBZ-BSA溶液用PBS緩沖液稀釋后，測(cè)定280nm和260nm的分光光度值，按公式 計(jì)算稀釋液中的蛋白的濃度，乘W稀釋倍數(shù)后即為PBZ-BSA溶液中的PBZ-BSA濃度。蛋白 質(zhì)濃度（mg/ml) = 1.45X0D280-0. 74X0D260。
[0050] 2、多效挫免疫原的表征
[0051] 將PBZ-BSA溶液用PBS緩沖液稀釋（使PBZ-BSA的濃度為5mg/mL)，作為溶液甲； 將含5mg/mL多效挫的PBS緩沖液作為溶液乙；將含5mg/mLBSA的PBS緩沖液作為溶液丙。 分別將溶液甲、溶液乙和溶液丙進(jìn)行紫外（200-380nm)光譜掃描，分別采用溶液乙和溶液 丙的最大吸收波長(zhǎng)值對(duì)溶液甲進(jìn)行紫外光譜掃描，并根據(jù)已經(jīng)計(jì)算出的該化合物的消光系 數(shù)反向計(jì)算該化合物在溶液甲中的濃度，用濃度值除W分子量得到該化合物的摩爾濃度， 計(jì)算偶聯(lián)比，簇基化的多效挫半抗原和BSA的偶聯(lián)比為10:1，即10個(gè)多效挫半抗原所示化 合物結(jié)合1個(gè)BSA。
[0052]SDS-PAGE凝膠電泳鑒定，濃縮膠濃度為5 %，分離膠濃度為12 %，濃縮膠電壓60V， 分離膠電壓80V，上樣量為2μg，考馬斯亮藍(lán)染色3~地后，置脫色液中過(guò)夜脫色。根據(jù)條 帶分子量的大小變化判斷偶聯(lián)效果。
[0053] SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，如圖1所示，BSA的泳動(dòng)速度大于PBZ-BSA，即PBZ-BSA的 分子量大于