inase)、丙酮酸脫駿酶（pyruvatedecarboxylase)、磷 酸果糖激酶（phospho-fructokinase)、葡萄糖 _6_ 磷酸異構(gòu)酶（glucose-6-phosphate isomerase)、3_ 磷酸甘油酸變位酶（3-phosphoglyceratemutase)、丙酮酸激酶 (pyruvatekinase)、磷酸丙糖異構(gòu)酶（triosephosphateisomerase)、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶 (phosphoglucoseisomerase)和葡萄糖激酶（glucokinase)等用于糖酵解（glycolytic) 酶的啟動子。在具備進一步具有根據(jù)生長條件控制轉(zhuǎn)錄的優(yōu)點的誘導(dǎo)型啟動子的其它酵母 啟動子中，存在用于醇脫氫酶2(alcoholdehydrogenase2)、異細(xì)胞色素C(isocytochrome C)、酸性磷酸酶（acidphosphatase)的啟動子部分，且存在如下酶的啟動子部分：與氮代謝 有關(guān)的降解酶，參與金屬硫蛋白（metallothionein)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glycerald ehyde-3-phosphatedehydrogenase)、麥芽糖（maltose)和半乳糖（galactose)的利用的 酶。適合用于酵母表達的載體和啟動子記載于EP第73, 657號。此外，酵母增強子與酵母 啟動子一起被有效利用。從哺乳動物宿主細(xì)胞中存在的載體進行的轉(zhuǎn)錄被由如下病毒的 基因組得到的啟動子控制：多瘤病毒（polyomavirus)、禽痘病毒（fowlpoxvirus)、腺病 毒 2(adenovirus2)、牛乳頭狀瘤病毒（bovinepapillomavirus)、禽類肉瘤病毒（avian sarcomavirus)、巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus)、逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus)、乙型肝炎 病毒（hepatitis-Bvirus)、最優(yōu)選的猿猴病毒40(simianvirus40 :SV40)，也被從雜合哺 乳動物啟動子（肌動蛋白（actin)啟動子、免疫球蛋白質(zhì)（immunoglobulin)啟動子等）和 熱休克（heat-shock)啟動子得到的啟動子控制，這樣的啟動子提供與宿主細(xì)胞體系的相 容性。為了優(yōu)化的翻譯，也可以使Kozak序列包含于5'非翻譯區(qū)。此外，利用于真核宿主 細(xì)胞（酵母、菌類、昆蟲、植物、動物、人類細(xì)胞）的表達載體包含轉(zhuǎn)錄終止及mRNA穩(wěn)定所需 的序列。在mRNA加工過程、特別是mRNA剪接及加工的情況下，根據(jù)結(jié)構(gòu)基因的特性（外顯 子/內(nèi)含子比率、長度等），不僅可以包含mRNA剪接信號，而且可以包含多腺苷酸化及加工 信號。
[0017] 上述發(fā)明提供由圖2所示的密碼子序列構(gòu)成的翻譯速度改善用RAMP標(biāo)記（ramp tag)與目標(biāo)基因融合而發(fā)揮功能的策略和獨立地表達的策略。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的RAMP標(biāo)記即使融合于目標(biāo)基因的5'或3'，或者導(dǎo)入到目標(biāo)基因 的內(nèi)部，或者配置成獨立地進行翻譯，也增加目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達效率，可以觀察到與對照組 相比總蛋白質(zhì)量增加約2. 5~7. 5倍以上。
[0019] 本發(fā)明作為制作與被已知為報告蛋白（reporterprotein)的焚光蛋白質(zhì)基因匹 配的RAMP標(biāo)記（ramptag)并測定蛋白質(zhì)表達量增加的方法，包括證明標(biāo)記的建模。
[0020] 本發(fā)明作為利用上述表達標(biāo)記制作與被已知為難表達的基因匹配的RAMP標(biāo)記 (ramptag)并測定蛋白質(zhì)表達量增加的方法，包括證明標(biāo)記的功能性。
[0021] 此外，本發(fā)明作為使純化目的的組氨酸稀有密碼子間斷排列在上述表達標(biāo)記內(nèi)， 以制作不僅能夠誘導(dǎo)過表達而且能夠通過單一過程將目標(biāo)蛋白質(zhì)純分離的RAMP標(biāo)記 (ramptag)為目的的方法，包括證明標(biāo)記的多功能性。
[0022] 在本發(fā)明中，以附加價值高但難表達的工業(yè)用酶和藥物蛋白質(zhì)即酯酶 (esterase)、葡萄糖苷酶（0-glucosidase)、溶細(xì)胞素（cytolysinA)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn) 移酶（chloramphenicolacetyltransferase)、新普魯蘭酶（neopullulanase)、天冬酰胺酶 B(asparaginaseB)為對象制作與它們匹配的RAMP標(biāo)記，利用大腸菌和真核細(xì)胞作為宿主， 測定這些蛋白質(zhì)的表達量時，確認(rèn)到與對照組相比顯著增加表達和活性。
[0023] 在本發(fā)明中，以用于醫(yī)學(xué)、研究的價值大的細(xì)胞因子和激素即白細(xì)胞介 素-1 (interleukin-1)、白細(xì)胞介素-32 (interleukin-32)為對象制作與它們匹配的RAMP 標(biāo)記，利用大腸菌和真核細(xì)胞作為宿主，測定這些蛋白質(zhì)的表達量時，確認(rèn)到與對照組相比 顯著增加蛋白質(zhì)量和活性。
[0024] 在本發(fā)明中，以用作診斷或治療用抗體的重組抗體（單鏈Fv，scFv)，四-細(xì)胞 粘附分子（T-CAM)、B3(Fv)PE38、抗-CD20(抗-B淋巴細(xì)胞抗體CD20(anti-B-lymphocyte antigenCD20))、抗-TNFa(抗腫瘤壞死因子a(anti-tumourNecrosisFactorAlpha)) 為對象制作與它們匹配的RAMP標(biāo)記，利用真核細(xì)胞作為宿主，測定這些蛋白質(zhì)的表達量 時，確認(rèn)到與對照組相比顯著增加抗體和活性。
[0025] 此外，本發(fā)明提供將RAMP標(biāo)記（ramptag)與已商品化的其它標(biāo)記或融合伴侶 (fusionpartner)融合而使用的方法。
[0026] 在將根據(jù)本發(fā)明的RAMP標(biāo)記與His-標(biāo)記、T7-標(biāo)記、HA-標(biāo)記等標(biāo)記和GST、GFP、 MBP等融合蛋白質(zhì)一起使用時，也可以確認(rèn)到在不阻礙它們的功能的同時增加目標(biāo)蛋白質(zhì) 的表達量。
[0027] 此外，本發(fā)明提供通過使能與親和層析結(jié)合的稀有密碼子間斷嫁接到RAMP標(biāo)記 而能夠進行過表達的同時容易分離目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法。
[0028] 在制作根據(jù)本發(fā)明的RAMP標(biāo)記時，間斷嫁接可應(yīng)用的組氨酸稀有密碼子而使用 的情況下，確認(rèn)到目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達量增加，可以確認(rèn)到通過單一過程的純化能夠進行目 標(biāo)蛋白質(zhì)的純分離。
[0029] 此外，提供從將根據(jù)本發(fā)明的RAMP標(biāo)記與信號序列或特異的切割位點融合而表 達的蛋白質(zhì)中去除RAMP標(biāo)記的方法。上述切割位點雖然沒有限制，但是可以存在于IgA-蛋 白酶、粒酶（granzyme)B、Tev蛋白酶、預(yù)切割（prescission)蛋白酶、凝血酶、Xa因子或腸 激酶識別的序列上。
[0030] 即使在為了將根據(jù)本發(fā)明的RAMP標(biāo)記與目標(biāo)蛋白質(zhì)分離而一起使用信號序列或 特異的切割位點的情況下，也確認(rèn)到在不阻礙它們的功能的同時增加蛋白質(zhì)的表達量，即 使在去除RAMP標(biāo)記后，也可以確認(rèn)到目標(biāo)蛋白質(zhì)的活性或穩(wěn)定性沒有變化。
[0031] 此外，本發(fā)明提供與以往已知的表達系統(tǒng)一起使用的方法。
[0032] 在將根據(jù)本發(fā)明的RAMP標(biāo)記與誘導(dǎo)型啟動子、Kozak序列、mRNA剪接信號、多腺苷 酸化信號、夏因-達爾加諾序列（Shine-Dalgarno-Sequence)等一起使用的情況下，也可以 確認(rèn)到在不阻礙它們的功能的同時與單獨存在表達系統(tǒng)時相比蛋白質(zhì)的表達量增加。
[0033] 此外，本發(fā)明提供使用RAMP標(biāo)記（ramptag)的適當(dāng)?shù)拿艽a子長度的方法。
[0034] 在縮小RAMP標(biāo)記的序列并用于根據(jù)本發(fā)明的目標(biāo)蛋白質(zhì)的情況下，確認(rèn)到目標(biāo) 蛋白質(zhì)的表達量增加，即使在增加RAMP標(biāo)記的序列的情況下，也可以確認(rèn)到目標(biāo)蛋白質(zhì)的 表達增加。
[0035] 此外，本發(fā)明提供組合RAMP標(biāo)記的密碼子順序而進行配置的方法。
[0036] 在更換根據(jù)本發(fā)明的RAMP標(biāo)記的密碼子順序后使用的情況下，可以確認(rèn)到與借 助于以往的RAMP標(biāo)記而增加的目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達量的差異變化不大。
[0037] 此外，本發(fā)明提供載體內(nèi)的多基因表達方法。
[0038]即使在使應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的RAMP標(biāo)記的目標(biāo)基因在一個載體中表達的情況下， 也確認(rèn)到與對照組相比各蛋白質(zhì)量增加，即使在將其應(yīng)用于其它載體的情況下，也可以確 認(rèn)到目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達增加。
[0039] 此外，本發(fā)明還公開了RAMP標(biāo)記不僅能夠在原核生物而且能夠在真核生物中利 用于目標(biāo)基因的過表達。
[0040] 即使在使根據(jù)本發(fā)明的RAMP標(biāo)記在除了大腸菌之外的微生物和真核生物中表達 的情況下，也可以確認(rèn)到目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達增加。
[0041] 此外，本發(fā)明提供增加目標(biāo)蛋白質(zhì)的可溶性（Solubility)的RAMP標(biāo)記的使用方 法。
[0042] 在將根據(jù)本發(fā)明的RAMP標(biāo)記使用于目標(biāo)蛋白質(zhì)的情況下，可以確認(rèn)到蛋白質(zhì)的 表達和可溶性增加。
[0043] 此外，本發(fā)明提供增加目標(biāo)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性（stability)的RAMP標(biāo)記的使用方 法。
[0044] 在將根據(jù)本發(fā)明的RAMP標(biāo)記使用于目標(biāo)蛋白質(zhì)的情況下，可以確認(rèn)到蛋白質(zhì)的 表達和穩(wěn)定性增加。
[0045] 此外，本發(fā)明提供增加目標(biāo)蛋白質(zhì)的酶活性（enzymicactivity)的RAMP標(biāo)記的 使用方法。
[0046] 在將根據(jù)本發(fā)明的RAMP標(biāo)記使用于目標(biāo)蛋白質(zhì)的情況下，可以確認(rèn)到蛋白質(zhì)的 表達和酶活性增加。
[0047] 本發(fā)明作為在分析收集稀有密碼子并制作RAMP標(biāo)記（ramptag)來制造重組蛋白 質(zhì)的過程中能夠提高翻譯效率的新的方法，其與密碼子優(yōu)化或密碼子去優(yōu)化方法不同，具 有即使不更換原來的0RF序列也能夠增加翻譯效率的優(yōu)點。
[0048] 由此，不需要用于置換密碼子的基因水平的DNA人工合成，從而能夠節(jié)省費用，能 夠根據(jù)目的而有機調(diào)節(jié)RAMP標(biāo)記的密碼子的長度和配置順序，可以進行通用RAMP標(biāo)記 (universalramptag)的設(shè)計而能夠針對各種蛋白質(zhì)快速增加翻譯效率。此外提供在標(biāo)記 中排列能與親和層析結(jié)合的稀有密碼子的情況下可以同時實現(xiàn)過表達和純分離的方法。
[0049] 本發(fā)明顯示如下效果：即使將RAMP標(biāo)記配置在相對于目標(biāo)蛋白質(zhì)的RAMP標(biāo)記的 多種融合位置（導(dǎo)入N-末端、C-末端或基因內(nèi)部），而且即使將RAMP標(biāo)記配置成RAMP標(biāo) 記被翻譯為獨立的肽，也能夠增加目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達量，并且即使與多種標(biāo)記或融合蛋白 質(zhì)一起使用，也顯示出在照樣發(fā)揮標(biāo)記或融合蛋白質(zhì)的作用的同時增加目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達 量的效果。
[0050] 此外，在與用于使目標(biāo)蛋白質(zhì)過表達的質(zhì)粒水平的表達系統(tǒng)一起使用的情況下， 顯示出在不阻礙它們的功能的同時與單獨存在表達系統(tǒng)時相比增加表達量的效果。這樣的 效果能夠改善外源基因與宿主細(xì)胞的密碼子使用相容性問題而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的量，因此能夠 解決將大腸菌以及酵母或動植物細(xì)胞作為宿主時的目標(biāo)蛋白質(zhì)難表達問題。
[0051]這樣的方法能夠進行與藥物蛋白質(zhì)即ClyA、scFV、天冬酰胺酶（ansB)、T-CAM、 B3(Fv)PE38匹配的RAMP標(biāo)記的設(shè)計，從而具有能夠直接利用于醫(yī)藥品或工業(yè)用酶的大量 生產(chǎn)的優(yōu)點，通過從將根據(jù)本發(fā)明的RAMP標(biāo)記與信號序列或特異的切割位點融合而表達 的蛋白質(zhì)中去除RAMP標(biāo)記，能夠獲得完整的目標(biāo)蛋白質(zhì)，能夠確認(rèn)到原來的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和 活性。
[0052] 此外，因目標(biāo)蛋白質(zhì)的可溶性增加、無活性包涵體（inclusionbody)形成受阻等 而消除了不溶性蛋白質(zhì)的再水化工序的必要性，在為了工業(yè)生產(chǎn)而擴大規(guī)模（scale-up) 時具有經(jīng)濟性高的優(yōu)點。除此之外，能夠使蛋白質(zhì)的酶活性和穩(wěn)定性持續(xù)而高收獲目標(biāo)產(chǎn) 物，從而能夠大量供應(yīng)生命工程學(xué)和醫(yī)藥領(lǐng)域中所需的活性蛋白質(zhì)。
【附圖說明】
[0053] 圖1是說明翻譯過程中的稀有密碼子（rarecodon)的影響（A)和用RAMP標(biāo)記 (ramptag)解決的原理（B)的示意圖。
[0054] 圖2是顯示出翻譯速度改善用RAMP標(biāo)記（ramptag)融合于目標(biāo)基因而發(fā)揮功能 (A)以及進行表達（B)的策略的示意圖。
[0055] 圖3是利用SDS-PAGE分析包含本發(fā)明的RAMP標(biāo)記（ramptag)的熒光蛋白質(zhì) DsRed(A)、GFPuv(B)、mBFP(C)的表達量的圖。在圖中，以R表示的是融合有標(biāo)記的蛋白質(zhì) (泳道NC:pTrc99A，T:全體蛋白質(zhì)，S:可溶性蛋白質(zhì)）。
[0056] 圖4是利用SDS-PAGE分析核糖體結(jié)合位點（RBS)導(dǎo)入以及包含本發(fā)明的RAMP標(biāo) 記（ramptag)的焚光蛋白質(zhì)mBFP的表達量的圖。以R表示的是融合標(biāo)記的蛋白質(zhì)（泳 道 1 :pTrc99A，2 :pTrc99A-mBFP，3 :導(dǎo)入RBS的pTrc99A-mBFP，4 :pTrc99A-Rl-mBFP，5 :導(dǎo)入 RBS的pTrc99A-Rl-mBFP，6 :導(dǎo)入RBS的pTrc99A-R2-mBFP)。
[0057] 圖5是通過RT-PCR分析包含本發(fā)明的RAMP標(biāo)記（ramptag)的熒光蛋白質(zhì) mBFP的轉(zhuǎn)錄物（mRNA)量的圖（條帶 1 :pTrc99A-mBFP，2 :導(dǎo)入RBS的pTrc99A-mBFP，3 : pTrc99A-Rl-mBFP，4 :導(dǎo)入RBS的pTrc99A-Rl-mBFP，5 :導(dǎo)入RBS的pTrc99A-R2-mBFP)。
[0058] 圖6是分析用包含本發(fā)明的RAMP標(biāo)記（ramptag)的焚光蛋白質(zhì)mBFP轉(zhuǎn)化的大 腸菌宿主的生理影響的生長曲線。以R表示的是融合標(biāo)記的蛋白質(zhì)（符號A:pTrC99A，符 號B :pTrc99A-mBFP，符號C :pTrc99A-R-mBFP)。
[0059] 圖7是分析包含本發(fā)明的RAMP標(biāo)記（ramptag)的酯酶（1767)和新普魯蘭酶 (BCN)的表達量的圖。以R表不的是融合標(biāo)記的蛋白質(zhì)（T:全體蛋白質(zhì)，S:可溶性蛋白質(zhì)）。
[0060] 圖8是分析包含本發(fā)明的RAMP標(biāo)記（ramptag)的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT)的表 達量（A)和酶活性（B)的圖。酶活性利用MIC測定法進行測定，以R表示的是融合標(biāo)記的 蛋白質(zhì)（T:全體蛋白質(zhì)，S:可溶性蛋白質(zhì)，w/o:無IPTG，w/ :有IPTG)。
[0061] 圖9是分析包含本發(fā)明的RAMP標(biāo)記（ramptag)的天冬酰胺酶B(ansB)的表達量 (A)和酶活性（B)的圖。酶活性利用酶譜（zymogram)法進行測定（泳道1 :pBAD，泳道2 : pBAD-Rl-ansB，泳道 3 :pBAD-R2_ansB，泳道 4 :pBAD_ansB) 〇
[0062] 圖10是確認(rèn)根據(jù)時間的包含本發(fā)明的RAMP標(biāo)記（ramptag)的天冬酰胺酶 B(ansB)在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性的結(jié)果。以R表示的是融合標(biāo)記的蛋白質(zhì)，穩(wěn)定性是通過在誘 導(dǎo)蛋白質(zhì)表達后，對于隨時間經(jīng)過的試樣利用蛋白質(zhì)印跡法（westernblot)進行確認(rèn)。
[0063] 圖11是將本發(fā)明的RAMP標(biāo)記融合于氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT)的C-末端并分析 表達量的SDS-PAGE結(jié)果。以R表示的是融合標(biāo)記的蛋白質(zhì)，所表示的位置是融合于末端的 位置。
[0064] 圖12是分析包含本發(fā)明的RAMP標(biāo)記（ramptag)的人類（A)和小鼠⑶來源的白 細(xì)胞介素-1的表達量的圖。以R表示的是融合標(biāo)記的蛋白質(zhì)，小寫h是人類來源的基因， m是小鼠來源的基因，s是密碼子優(yōu)化合成基因（T:全體蛋白質(zhì)，S:可溶性蛋白質(zhì)，I:IPTG 誘導(dǎo)表達蛋白質(zhì)）。
[0065]圖13是分析包含本發(fā)明的RAMP標(biāo)記（ramptag)的白細(xì)胞介素-32的全體蛋白 質(zhì)（A)和可溶性蛋白質(zhì)（B)的表達量的圖。以R表示的是融合標(biāo)記的蛋白質(zhì)，表達量通過蛋 白質(zhì)印跡進行確認(rèn)（泳道 1 :pTrc99A-IL32 0，2 :pTrc99A-R-IL32 0，3 :pTrc99A-IL32y， 4 ：pTrc99A-Rl-IL32y,5 ：pTrc99A-R2-IL32y)〇
[0066]圖14是組合本發(fā)明的RAMP標(biāo)記（ramptag)稀有密碼子順序后分析白細(xì)胞 介素-32的表達量的圖。以R表示的是融合標(biāo)記的蛋白質(zhì)，表達量通過蛋白質(zhì)印跡進 行確認(rèn)（泳道 1 :pTrc99A-IL32 0，2 :pTrc99A-R-IL32 0，3 :pTrc99A-Rl-IL32 0，4 : pTrc99A-R2-IL32 0，5 :pTrc99A-R3-IL32 0)。
[0067]圖15是分析包含本發(fā)明的RAMP標(biāo)記（ramptag)和切割位點序列的溶細(xì)胞 素（ClyA)的表達量的圖。以R表示的是融合標(biāo)記的蛋白質(zhì)，表達量通過蛋白質(zhì)印跡進 行確認(rèn)（泳道 1 :pET，2 :pET-ClyA，3 :pET-Rl-ClyA，4 :pET-R2-ClyA，5 :pET-R3-ClyA，6 : pET-Rl-Cl