一種楠木脂素a的提取分離方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種楠木脂素 A的提取分離方法與應(yīng)用，具體是涉及一種應(yīng)用高速逆 流色譜技術(shù)從紅楠干燥樹皮中分離純化楠木脂素 A的方法，還涉及楠木脂素 A在抗腫瘤藥 物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 紅楠 Sieb. et Zucc.系棒科植物，主要分布于我國(guó)山東、江 蘇、浙江、安徽、江西、福建、臺(tái)灣、四川、廣東、廣西等省區(qū)?，F(xiàn)代藥理研宄表明，楠木脂素 A 具有免疫抑制活性，對(duì)分裂素(刀豆球蛋白A)誘導(dǎo)的人外周血液淋巴細(xì)胞增生有極強(qiáng)的抑 制作用，其IC5tl為0.02 μ g/ml，與強(qiáng)的松龍相當(dāng)；另外還具有細(xì)胞毒活性，對(duì)人型白血病細(xì) 胞株HL-60和Molt-4細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性，其IC 5tl (ng/ml)分別為26和54。
[0003] 楠木脂素 A (Machilin A)，分子式為C2tlH22O4，分子量為326. 39,為無(wú)色針晶，是從 紅楠的樹皮分離出的一種木脂素類化合物。
[0004] 現(xiàn)有提取楠木脂素 A的報(bào)道并不多見，市場(chǎng)上也尚未有楠木脂素 A對(duì)照品的出售， 因此提供一種楠木脂素 A的提取分離方法與應(yīng)用則很有必要，可以為其后續(xù)研宄提供支 持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種楠木脂素 A的提取分離方法與應(yīng)用，本發(fā)明方法制得的 楠木脂素 A質(zhì)量好，純度高。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 一種楠木脂素 A的提取分離方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 提取：將紅楠干燥樹皮粉碎，加入7-12倍藥材重量的70-90%乙醇水溶液，空化混 懸20-40min，進(jìn)行負(fù)壓空化混懸固液萃取1-2次，得到萃取液； (2) 大孔樹脂富集：萃取液回收乙醇得總生物堿浸膏，加入大孔樹脂，拌勻、干燥后裝 柱，醇水溶液洗脫，收集楠木脂素 A流分，濃縮得楠木脂素 A粗品； (3) 純化：將上述粗品采用高速逆流色譜法分離純化，以氯仿-甲醇-水為兩相溶劑系 統(tǒng)，ELSD檢測(cè)器監(jiān)測(cè)，收集目標(biāo)流分，回收試劑，真空干燥得產(chǎn)品。
[0007] 步驟（1)所述乙醇水溶液濃度為75%，用量為10倍藥材重量。
[0008] 步驟（1)所述混懸時(shí)間為30min，萃取2次。
[0009] 步驟（2)所述萃取液濃縮至密度1. 1-1. 2g/ml。
[0010] 步驟（2)所述大孔樹脂為DlOl型，醇水溶液為85%的乙醇溶液。
[0011] 步驟（3 )所述氯仿-甲醇-水體積比為（5-9 ) : (15-17 ) : (6-8 )。
[0012] 本發(fā)明提取分離方法制得的化合物在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明提取分離方法制得的化合物進(jìn)行抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)表明：該化合物具有較強(qiáng) 的抗腫瘤活性，在天然新藥開發(fā)中具有良好的應(yīng)用前景。
[0014] 本發(fā)明提取分離方法制得的楠木脂素 A采用MTT法（四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng) 比色法）進(jìn)行抗腫瘤活性測(cè)試。
[0015] 試驗(yàn)用細(xì)胞株： HeLa :人子宮頸癌細(xì)胞株；HEC-I :人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株；T-98和U251-SP :人腦神經(jīng)膠 質(zhì)瘤細(xì)胞株；HLE :人肝癌細(xì)胞株；MMl-CB和HMV-I :人黑色素瘤細(xì)胞株。
[0016] 方法：（1) 0. 25%胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，10%NBS的RPMI 1640調(diào)細(xì)胞濃度 50000個(gè)/ml。96孔板IOOul/孔。設(shè)溶劑對(duì)照，每組3平行孔。37°C，5%C0 2、95%空氣的 培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h，棄上清。
[0017] (2)加藥物5個(gè)10倍稀釋的濃度(溶劑為有二甲亞砜和水），為KT4 mol/L。
[0018] (3)細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)48h，每孔加入10 μ I 5mg/ml的MTT溶液（以無(wú)血清培養(yǎng)基配 制)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。
[0019] (4)吸去上清。加入200 μ1 DMS0,輕輕振蕩以使甲臜完全溶解。570nm處用酶標(biāo) 儀測(cè)定OD值。
[0020] (5)計(jì)算抑制率（%)=(對(duì)照OD-藥物0D) /對(duì)照0D*100% 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：本發(fā)明化合物的抑制率以相對(duì)于對(duì)照(添加 DMS0)的結(jié)果如下表1表示。
[0021] 表1楠木脂素 A的腫瘤細(xì)胞增值抑制率％
以上試驗(yàn)表明，楠木脂素 A具有良好的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性，其可在制備抗腫瘤 藥物中得到應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明為制備抗腫瘤藥物提供了一種新的選擇。
[0023] 本發(fā)明所述楠木脂素 A在制備抗腫瘤藥物時(shí)，可按照常規(guī)的制劑方法以楠木脂素 A為藥物活性成分，添加適宜的藥物載體，制成各種藥物劑型，如片劑、膠囊、滴丸、注射劑、 緩控釋劑等等。
[0024] 在用于治療腫瘤疾病時(shí)，口服制劑的用量一般可控制在每日服用楠木脂素 A200-500mg。其他劑型的用量可參考該用量。本發(fā)明的藥物用法用量，也不完全限于此，臨 床醫(yī)師也可以根據(jù)病人的具體情況決定藥物的用法用量。
[0025] 下面將結(jié)合【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限 于下列實(shí)施方式。
[0026]
【具體實(shí)施方式】： 實(shí)施例1 : 取紅楠干燥樹皮lkg，粉碎成粗粉，與10kg75%的乙醇溶液混合后，空化混懸30min，進(jìn) 行負(fù)壓空化混懸固液萃取2次，得到萃取液，濃縮至密度I. 2g/ml，得總生物堿浸膏，向浸膏 中加 DlOl型大孔樹脂拌勻、干燥后裝柱，先用水洗至色淺，再用6倍柱體積的85%的乙醇溶 液洗脫，薄層檢測(cè)，收集目標(biāo)流分，濃縮得粗品。
[0027] 取氯仿-甲醇-水按（5:15:6)體積比置于分液漏斗中，混勻后，靜置，放出上層作 為固定相，下層作為流動(dòng)相，將粗品用下相溶解，開啟制備型高速逆流色譜儀，先將固定相 泵入色譜柱中，再以4ml/min流速泵入流動(dòng)相，并通過(guò)進(jìn)樣閥連續(xù)進(jìn)樣，控制轉(zhuǎn)速為850r/ min，ELSD檢測(cè)器監(jiān)測(cè)，收集流出液，濃縮，干燥得楠木脂素 A，檢測(cè)含量96. 4%。
[0028] 實(shí)施例2 : 取紅楠干燥樹皮2kg，粉碎成粗粉，與20kg75%的乙醇溶液混合后，空化混懸30min，進(jìn) 行負(fù)壓空化混懸固液萃取2次，得到萃取液，濃縮至密度I. 2g/ml，得總生物堿浸膏，向浸膏 中加 DlOl型大孔樹脂拌勻、干燥后裝柱，先用水洗至色淺，再用5倍柱體積的85%的乙醇溶 液洗脫，薄層檢測(cè)，收集目標(biāo)流分，濃縮得粗品。
[0029] 取氯仿-甲醇-水按（9:17:8)體積比置于分液漏斗中，混勻后，靜置，放出上層 作為固定相，下層作為流動(dòng)相，將粗品用下相溶解，開啟制備型高速逆流色譜儀，先將固定 相泵入色譜柱中，再以3. 5ml/min流速泵入流動(dòng)相，并通過(guò)進(jìn)樣閥連續(xù)進(jìn)樣，控制轉(zhuǎn)速為 900r/min，ELSD檢測(cè)器監(jiān)測(cè)，收集流出液，濃縮，干燥得楠木脂素 A，檢測(cè)含量97. 2%。
[0030] 實(shí)施例3 : 取紅楠干燥樹皮2kg，粉碎成粗粉，與20kg75%的乙醇溶液混合后，空化混懸30min，進(jìn) 行負(fù)壓空化混懸固液萃取2次，得到萃取液，濃縮至密度I. lg/ml，得總生物堿浸膏，向浸膏 中加 DlOl型大孔樹脂拌勻、干燥后裝柱，先用水洗至色淺，再用6倍柱體積的85%的乙醇溶 液洗脫，薄層檢測(cè)，收集目標(biāo)流分，濃縮得粗品。
[0031] 取氯仿-甲醇-水按（7:16:7)體積比置于分液漏斗中，混勻后，靜置，放出上層作 為固定相，下層作為流動(dòng)相，將粗品用下相溶解，開啟制備型高速逆流色譜儀，先將固定相 泵入色譜柱中，再以4ml/min流速泵入流動(dòng)相，并通過(guò)進(jìn)樣閥連續(xù)進(jìn)樣，控制轉(zhuǎn)速為1000 r/ min，ELSD檢測(cè)器監(jiān)測(cè)，收集流出液，濃縮，干燥得楠木脂素 A，檢測(cè)含量97. 0%。
[0032] 實(shí)施例4 : 取紅楠干燥樹皮2kg，粉碎成粗粉，與20kg75%的乙醇溶液混合后，空化混懸30min，進(jìn) 行負(fù)壓空化混懸固液萃取2次，得到萃取液，濃縮至密度I. 2g/ml，得總生物堿浸膏，向浸膏 中加 DlOl型大孔樹脂拌勻、干燥后裝柱，先用水洗至色淺，再用5倍柱體積的85%的乙醇溶 液洗脫，薄層檢測(cè)，收集目標(biāo)流分，濃縮得粗品。
[0033] 取氯仿-甲醇-水按（8:15:7)體積比置于分液漏斗中，混勻后，靜置，放出上層 作為固定相，下層作為流動(dòng)相，將粗品用下相溶解，開啟制備型高速逆流色譜儀，先將固定 相泵入色譜柱中，再以3. 5ml/min流速泵入流動(dòng)相，并通過(guò)進(jìn)樣閥連續(xù)進(jìn)樣，控制轉(zhuǎn)速為 950r/min，ELSD檢測(cè)器監(jiān)測(cè)，收集流出液，濃縮，干燥得楠木脂素 A，檢測(cè)含量96. 3%。
[0034] 實(shí)施例5 : 本發(fā)明藥物顆粒劑 將實(shí)施例1所制楠木脂素 A加入乙醇作黏合劑，加入淀粉作填充劑，制成顆粒。
[0035] 實(shí)施例6 : 本發(fā)明藥物片劑 將實(shí)施例1所制楠木脂素 A，加入淀粉、糊精、硬脂酸鎂等，混合制成濕粒，壓片，每片含 楠木脂素 A200mg。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種楠木脂素A的提取分離方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 提取：將紅楠干燥樹皮粉碎，加入7-12倍藥材重量的70-90%乙醇水溶液，空化混 懸20-40min，進(jìn)行負(fù)壓空化混懸固液萃取1-2次，得到萃取液； (2) 大孔樹脂富集：萃取液回收乙醇得總生物堿浸膏，加入大孔樹脂，拌勻、干燥后裝 柱，醇水溶液洗脫，收集楠木脂素A流分，濃縮得楠木脂素A粗品； (3) 純化：將上述粗品采用高速逆流色譜法分離純化，以氯仿-甲醇-水為兩相溶劑系 統(tǒng)，ELSD檢測(cè)器監(jiān)測(cè)，收集目標(biāo)流分，回收試劑，真空干燥得產(chǎn)品。2. 如權(quán)利要求1所述的提取分離方法，其特征在于步驟（1)所述乙醇水溶液濃度為 75%，用量為10倍藥材重量。3. 如權(quán)利要求1所述的提取分離方法，其特征在于步驟（1)所述混懸時(shí)間為30min，萃 取2次。4. 如權(quán)利要求1所述的提取分離方法，其特征在于步驟（2)所述萃取液濃縮至密度 I. 1-1. 2g/ml〇5. 如權(quán)利要求1所述的提取分離方法，其特征在于步驟（2)所述大孔樹脂為DlOl型， 醇水溶液為85%的乙醇溶液。6. 如權(quán)利要求1所述的提取分離方法，其特征在于步驟（3)所述氯仿-甲醇-水體積 比為（5-9) : (15-17) : (6-8)。7. 如權(quán)利要求1~6所述提取分離方法制得的化合物在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種楠木脂素A的提取分離方法與應(yīng)用，提取分離方法包括以下步驟：（1）將紅楠干燥樹皮粉碎，加入乙醇水溶液，進(jìn)行負(fù)壓空化混懸固液萃取，得到萃取液，萃取液回收試劑得總生物堿浸膏；（2）總生物堿浸膏加入大孔樹脂，拌勻、干燥后裝柱，醇水溶液洗脫，收集楠木脂素A流分，濃縮得楠木脂素A粗品；（3）將上述粗品采用高速逆流色譜法分離純化得楠木脂素A。本發(fā)明方法具有所得產(chǎn)品含量高，操作簡(jiǎn)單，提率高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明方法所制化合物為開發(fā)應(yīng)用新一代天然來(lái)源的抗腫瘤藥物開拓了新徑。
【IPC分類】A61P35/00, A61K31/36, C07D317/50
【公開號(hào)】CN104910126
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510266004
【發(fā)明人】劉東鋒, 楊成東
【申請(qǐng)人】南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2015年9月16日
【申請(qǐng)日】2015年5月22日