低溫誘導型啟動子pcp1及應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及低溫誘導型啟動子PCPl及應用。
技術(shù)背景
[0002]誘導型啟動子(Inducible Promoter)是指在某些特定的物理或化學信號的刺激下，該種類型的啟動子可以大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平。長期進化過程中，植物通過啟動不同基因的表達可在一定范圍內(nèi)適應光、溫、水等環(huán)境的變化。這些基因的啟動子通常包含比較保守的順式作用元件，利用這些保守元件可以推測新基因的可能功能，也可用這些環(huán)境應答基因的啟動子與抗逆基因融合，從而使轉(zhuǎn)基因植物更好地適應逆境。誘導型啟動子包括光、溫度、激素應答啟動子等。光應答啟動子中通常存在GT-l-motif，1-box, G-box和AT-rich sequence等順式作用元件；溫度應答啟動子中多存在HSE_motif, CCAAT_box,CCGAC-motif等；激素應答啟動子中則包含各種激素應答元件。G-box作為蛋白結(jié)合的一個高度保守的位點，是植物中通用的受信號誘導的順式作用元件，在植物和動物中具高度保守的核心序列CACGT。G-box通常與另外一個順式作用元件如1-box, H_box等協(xié)同作用，在細胞接受外界信號時調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的頻率。這種機制可能是通過G-box及其結(jié)合蛋白相互作用產(chǎn)生一個內(nèi)部環(huán)境，其他調(diào)節(jié)蛋白與啟動子區(qū)域有效結(jié)合，使細胞準確而有選擇地起始轉(zhuǎn)錄。有些誘導型啟動子同時具有組織特異性，如RBCSl啟動子，既包含葉特異表達元件，又帶有幾個光應答元件(LREs)，受光的誘導調(diào)節(jié)。當轉(zhuǎn)基因煙草由光照轉(zhuǎn)入黑暗時，該啟動子驅(qū)動的GUS活性比在光下低許多，Northern雜交幾乎檢測不到GUS的表達。平菇是我國栽培量最大的食用菌，過低的生長溫度對平菇的生長情況、菇型、產(chǎn)量都有非常重要的影響。而至今未有從平菇中鑒定出來的低溫誘導型啟動子，國內(nèi)也沒有關(guān)于其他食用菌低溫誘導啟動子的報道，這對食用菌耐逆育種具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種低溫誘導型啟動子序列PCP1。
[0004]低溫誘導型啟動子PCPl，其堿基序列如序列表SEQ ID N0.1所示；
它來源于平菇品種“沈平35”；
低溫誘導型啟動子PCPl的制備方法，它包括:
提取平菇品種“沈平35”總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈，以其為模板，用引物: PCPlS:5’ CAGCATCTGCGACCACCCTAGCACG 3’ ；
PCPlAS:5’ AGTGAGTGCCGATGGAT 3’ ；
進行PCR擴增獲得。
[0005]—種植物表達載體,它是在植物表達載體中插入了如序列表SEQ ID N0.1所不的基因。
[0006]低溫誘導型啟動子PCPl在培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物和食用菌品種中的應用。
[0007]低溫誘導型啟動子PCPl作為低溫脅迫選擇標記的應用。
[0008]本發(fā)明提供了低溫誘導型啟動子序列PCP1，是平菇中新發(fā)現(xiàn)的與低溫脅迫相關(guān)誘導型啟動子。經(jīng)實驗表明，將構(gòu)建好的帶有平菇低溫誘導型啟動子和GFP基因的植物表達載體轉(zhuǎn)入煙草中，在低溫脅迫下，GFP基因能夠表達，而未低溫脅迫時候GFP基因不能表達，本發(fā)明的基因來源于食用菌，具有適合于食用菌的優(yōu)化密碼子，其基因工程受體主要適合于食用菌的榆黃蘑、杏鮑菇、白靈菇等。培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物及食用菌品種中，低溫脅迫性選擇標記具有廣泛的應用前景。
【附圖說明】
[0009]圖1為平菇低溫誘導型啟動子PCPl的PCR電泳檢測圖；
圖2為平菇低溫誘導型啟動子PCPl連接到T載體后的PCR電泳檢測圖；
圖3平菇低溫誘導型啟動子PCPl連T載酶切鑒定結(jié)果；
圖4為平菇低溫誘導型啟動子PCPl連植物表達載體pCAMBIA1302-勺酶切鑒定結(jié)果;
圖5為平菇低溫誘導型啟動子PCPl在植物表達載體pCAMBIA1302- PCP1-GFm綠菌菌液PCR鑒定結(jié)果；
圖6、7為轉(zhuǎn)基因煙草在低溫4°C脅迫下GFP基因的表達鑒定結(jié)果；
圖8為轉(zhuǎn)基因煙草在常溫25°C培養(yǎng)下GFP基因的表達鑒定結(jié)果。
【具體實施方式】
[0010]實施例1
通過對平菇品種“沈平35”(吉林農(nóng)業(yè)大學菌物所提供，公開推廣應用的品種)的凝集素基因Iec上游啟動子序列的分析，發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)域具有含多個脫水、低溫響應和ABA逆境應答順式作用元件。
[0011]選用平菇品種“沈平35”，接種在PDA培養(yǎng)基平板上生長一周后，4°C培養(yǎng)24h，取菌絲，用液氮研磨，加入含有裂解液的1.5ml的EP管中，震蕩混勻后，使用試劑盒RNAisoPlus提取總RNA，用甲醛變性膠電泳鑒定RNA質(zhì)量，然后用分光光度計測量RNA的濃度；按照美國FERMENTAS公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈；根據(jù)平菇基因組數(shù)據(jù)庫和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫序列設(shè)計引物:PCP1S:5’ CAGCATCTGCGACCACCCTAGCACG 3’，PCPlAS: 5’ AGTGAGTGCCGATGGAT 3’，采用 RT-PCR 的方法進行 cDNA 克隆，PCR 反應條件為:94°C預變性5min，94°C變性40s，52°C復性40s，72°C延伸40s, 30個循環(huán)，72°C后延伸1min JfPCR產(chǎn)物克隆至pMD-18T載體上，進行PCR和酶切檢測，電泳結(jié)果如圖1、圖2。產(chǎn)物回收測序后獲得了平菇低溫誘導啟動子序列，全長cDNA為927bp，其堿基序cDNA如序列表 SEQ ID N0.1。
[0012]實施例2
根據(jù)平菇低溫誘導啟動子的cDNA序列，設(shè)計擴增完整編碼閱讀框的引物，在上游添加Xba I酶切位點，下游添加Nco I酶切位點，上游引物:CAGCATCTGCGACCACCCTAGCACG,下游引物:CAAGTGAGTGCCGATGGAT,以實施例1中獲得的cDNA為模板進行PCR擴增，將低溫啟動子序列的cDNA克隆到pMD-18T載體上，進一步克隆到雙元表達載體pCAMBIA1302，構(gòu)建成PCAMBIA1302-載體，酶切電泳結(jié)果見圖4，PCR檢測圖片見圖5。將構(gòu)建好的植物表達載體通過農(nóng)桿菌侵染的方法轉(zhuǎn)入煙草中，將在MS篩選培養(yǎng)基中的煙草幼苗4°C低溫脅迫12h后，對照為常溫25°C培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因煙草，分別放入熒光觀察裝置，觀察轉(zhuǎn)基因煙草和對照的GFP基因表達情況。表明平菇低溫誘導啟動子能夠在低溫脅迫下誘導GFP基因的表達，在沒有脅迫的時候沒有誘導表達，說明這一啟動子序列是低溫誘導型啟動子，見圖6、7、8。
[0013]上述實驗表明本發(fā)明中克隆的平菇啟動子序列，為平菇中新發(fā)現(xiàn)的與低溫相關(guān)的誘導型啟動子序列。實施例2表明，該啟動子能夠在低溫誘導下調(diào)控下游基因的表達，具有提高植物及食用菌耐逆性的功能。本發(fā)明的基因來源于平菇，具有適合于側(cè)耳屬的優(yōu)化密碼子，其基因工程受體主要適合于側(cè)耳屬食用菌的榆黃蘑、杏鮑菇、白靈菇等。
【主權(quán)項】
1.低溫誘導型啟動子，其堿基序列如序列表SEQID N0.1所示。
2.權(quán)利要求1所述的低溫誘導型啟動子，其特征在于:它來源于平菇品種“沈平35”。
3.低溫誘導型啟動子的制備方法，它包括: 提取平菇品種“沈平35”總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈，以其為模板，用引物: PCPlS:5’ CAGCATCTGCGACCACCCTAGCACG 3’ ； PCPlAS:5’ AGTGAGTGCCGATGGAT 3’ ； 進行PCR擴增獲得。
4.一種植物表達載體，它是在植物表達載體中插入了如序列表SEQ ID N0.1所示的基因。
5.權(quán)利要求1所述的低溫誘導型啟動子在培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物和食用菌新品種中的應用。
6.低溫誘導型啟動子作為低溫脅迫選擇標記的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了低溫誘導型啟動子序列PCP1，是平菇中新發(fā)現(xiàn)的與低溫脅迫相關(guān)誘導型啟動子。經(jīng)實驗表明，將構(gòu)建好的帶有平菇低溫誘導型啟動子和GFP基因的植物表達載體轉(zhuǎn)入煙草中，在低溫脅迫下，GFP基因能夠表達，而未低溫脅迫時候GFP基因不能表達，本發(fā)明的基因來源于食用菌，具有適合于食用菌的優(yōu)化密碼子，其基因工程受體主要適合于食用菌的榆黃蘑、杏鮑菇、白靈菇等。培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物及食用菌品種中，低溫脅迫性選擇標記具有廣泛的應用前景。
【IPC分類】C12N15-82, A01H5-00, A01H15-00, C12Q1-68, C12N15-113, C12N15-10
【公開號】CN104611337
【申請?zhí)枴緾N201510085874
【發(fā)明人】付永平, 盛立柱, 李玉, 宋冰, 李丹, 戴月婷, 王欣欣, 郭昱秀, 張春蘭
【申請人】吉林農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年2月21日