專利名稱：：在畢赤酵母屬中由甲醇誘導(dǎo)型啟動子進(jìn)行不依賴甲醇的誘導(dǎo)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及在曱基營養(yǎng)型(methylotrophic)酵母宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多肽的方法，其中多肽的表達(dá)受曱醇誘導(dǎo)型啟動子的控制。
背景技術(shù)：
：在工業(yè)中，真核生物廣泛用作產(chǎn)生多肽的宿主細(xì)胞，所述多肽用于，例如，醫(yī)藥和工業(yè)應(yīng)用。操作基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的能力給出了提供更高的生產(chǎn)產(chǎn)率(productionyield)的基礎(chǔ)。通常，通過在染色體中擴(kuò)增表達(dá)盒而實現(xiàn)真核生物中基因的最大表達(dá)，所述表達(dá)盒包含與編碼目的多肽的基因可操作連接的單一啟動子和擴(kuò)增物選捧性標(biāo)記(amplifierselectivemarker)。受控表達(dá)常常是期望的。在曱基營養(yǎng)型酵母中，長久以來就已知某些啟動子依賴于生長培養(yǎng)基中誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的曱醇的存在。這種通過甲醇的誘導(dǎo)要求其他因子的存在，然而，這些因子確切的作用機(jī)制尚未闡明。已知來自酵母的正因子(positivefactor)的實例包括Mxrlp，其被描述為巴斯德畢赤酵母(尸/c/z/aposton'力中曱醇利用所需的關(guān)鍵正調(diào)控子(Lin-Cereghino等，2006,MolCellBiol26(3):883-897)。已經(jīng)在幾種酵母細(xì)胞中描述了這些曱醇依賴型啟動子的實例，所述酵母細(xì)胞屬于已知為曱基營養(yǎng)型酵母的酵母組?？刂婆c這些生物中曱醇代謝有關(guān)的酶的表達(dá)的啟動子是特別強(qiáng)的，并且這些啟動子通常用于控制酵母中蛋白的調(diào)控有很大影響。曱醇和甘油被認(rèn)為是曱基營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)的適當(dāng)?shù)孜?，而認(rèn)為葡萄糖是不適當(dāng)?shù)?EP299108)。因此期望的是，是否能夠使得由已知曱醇代謝啟動子的表達(dá)較少依賴于底物。發(fā)明概述本發(fā)明提供在曱基營養(yǎng)型酵母宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多肽的方法，其中多肽的表達(dá)受甲醇誘導(dǎo)型啟動子控制，所述方法包括i)從非天然啟動子表達(dá)正調(diào)控子，所述正調(diào)控子激活由曱醇誘導(dǎo)型啟動子的轉(zhuǎn)錄，和ii)不添加曱醇。本發(fā)明進(jìn)一步公開了增加異源多肽在曱醇誘導(dǎo)型啟動子的控制下的表達(dá)水平的方法，其包括提供prml基因的組成型表達(dá)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及由曱醇誘導(dǎo)型啟動子進(jìn)行多肽的受控表達(dá)。這些啟動子的實例已經(jīng)在屬于已知為曱基營養(yǎng)型酵母的酵母組的幾種酵母細(xì)胞中描述。在本發(fā)明的上下文中，將曱基營養(yǎng)型酵母定義為能夠利用曱醇作為唯一碳源用于它們的生長的一組酵母。在這些生物中與曱醇代謝有關(guān)的酶的啟動子是特別強(qiáng)的，并且這些啟動子(曱醇代謝啟動子)通常用于控制酵母中蛋白質(zhì)的異源表達(dá)。曱基營養(yǎng)型酵母宿主細(xì)胞的已知成員屬于選自下組的屬畢赤酵母屬(尸/c/z&)、漢遜酵母屬(/foraemJa)、々i絲酵母屬(Ow^/^0、^求擬酵母屬(7brw/o戸z'力。才艮據(jù)本發(fā)明，一個實施方案中的畢赤酵母屬宿主細(xì)胞可以選自下組巴斯德畢赤酵母、曱醇畢赤酵母(尸^/^^/^"0//^)、安格斯畢赤酵母(P/c/z/aawgwto)、嗜熱曱醇畢赤酵母(尸/c/n'af/2erwcwe//Mf"o//ca)。漢遜酵母屬或假絲酵母屬宿主細(xì)胞可以選自下組多態(tài)漢遜酵母(7/arae麗/a/o/ywor//za)和博4尹丁布i絲酵母(Ca"J/Ja6o/Wm7)。先前已經(jīng)分離并在文獻(xiàn)中描述了幾種啟動子，通過向生長培養(yǎng)基中添加曱醇，可以控制異源多肽由所述啟動子的表達(dá)。這些啟動子包括但不限于例如AOX1啟動子(醇氧化酶啟動子)、DHAS啟動子(或DAS啟動子)(二羥基丙酮合酶啟動子)、FDH啟動子(或FMDH啟動子)(曱酸脫氫酶(formatedehydrogenase)啟動子)、MOX啟動子(甲醇氧化酶啟動子)、AOX2啟動子、ZZA1、PEX5-、PEX8-、PEX14-啟動子。具體地，本發(fā)明中有用的啟動子是與曱醇代謝有關(guān)的酶的啟動子。這些啟動子可以由技術(shù)人員使用常規(guī)技術(shù)從酵母分離。所有上述啟動子都已經(jīng)從曱基營養(yǎng)型酵母組的特定成員分離，并通過同源性搜索能夠容易地鑒定來自其他成員的相應(yīng)啟動子。這進(jìn)一步通過本文所包括的實施例說明。更具體地，啟動子選自下組甲酸脫氫酶(FMD或FMDH)啟動子、曱醇氧化酶(MOX)啟動子、二幾基丙酮合酶(DAS或DHAS)啟動子或醇氧化酶(AOXl)啟動子。通常地，所有上述啟動子都要求存在曱醇用于它們的誘導(dǎo)。這種曱醇誘導(dǎo)要求存在其他因子(如轉(zhuǎn)錄因子)，然而，這些因子的確切作用機(jī)制尚未闡明。在酵母中，例如Mxrlp，已經(jīng)被描述為巴斯德畢赤酵母中曱醇利用所需的關(guān)鍵正調(diào)控子(Lin-Cereghino等，2006,MolCellBiol26(3):883-897)。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由來自巴斯德畢赤酵母的Prml基因編碼的單一正因子的受控表達(dá)，如本文所述，足以在生長培養(yǎng)基中無需曱醇而誘導(dǎo)由幾種甲醇誘導(dǎo)型啟動子的轉(zhuǎn)錄。如本文所公開的，這一原理已經(jīng)使用Prml蛋白質(zhì)作為正活化子的模式蛋白(modelprotein),和使用AOX1或DAS啟動子用于報告子多肽(reporterpolypeptide)的受控表達(dá)而證明。獲得的結(jié)果顯示，僅通過控制prml基因的表達(dá)，而在生長培養(yǎng)基中不存在曱醇的情況下誘導(dǎo)AOX1或DAS啟動子是可能的。在本發(fā)明的一個實施方案中，從合適的啟動子組成型表達(dá)正調(diào)控子。優(yōu)選地，啟動子不是天然啟動子，意思是控制正調(diào)控子表達(dá)的啟動子與通常控制表達(dá)的啟動子不同。在本發(fā)明的上下文中，將這些優(yōu)選的啟動子稱為"非天然的"。啟動子可以對宿主生物仍然是天然的，但是在所研究基因，例如prml基因的背景中是外源的。在一個具體實施方案中，啟動子選自下組GAP啟動子(3—磷酸甘油醛脫氫酶啟動子)、TEFl啟動子(翻譯延長因子EF-1a啟動子)和PGK啟動子(磷酸甘油酸激酶啟動子)。除了由如上所述的非天然啟動子進(jìn)行受控表達(dá)之外，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞通常從存在于染色體上的內(nèi)源基因表達(dá)正調(diào)控子。在另一個實施方案中，可將編碼正調(diào)控子的基因的內(nèi)源拷貝失活，例如通過缺失失活，或者控制基因的內(nèi)源拷貝的正常啟動子可以被選擇的非天然啟動子所代替。在另一個的實施方案中，正調(diào)控子的表達(dá)受控于并非曱醇誘導(dǎo)型的誘導(dǎo)型啟動子。根據(jù)本發(fā)明的正調(diào)控子在一個實施方案中是如本文所述的Prml。在一個具體的實施方案中，Prml包含SEQIDNO:1的氨基S吏序列或其等位變體；或其具有調(diào)控子活性的片段。6在另一個具體實施方案中，Prml由如下組成SEQIDNO:1的氨基^列或其等位變體，或其片段；或取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸并具有調(diào)控子活性的氨基酸序列。術(shù)語"多肽片段"在本文中定義為從SEQIDNO:1的氨基和/或M^末端缺失一個或多個氨基酸的多肽，或其同源序列；其中所述片段具有調(diào)控子活性。術(shù)語"等位變體，，在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。兩個氨基酸序列例如兩個功能同源物之間的相關(guān)性用參數(shù)"同一性"描述。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的比對通過使用來自EMBOSS軟件包(http:〃emboss.org)2.8.0版本的Needle程序來測定，Needle程序執(zhí)行Needleman,S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453中所述的全局比對算法。使用的取代矩陣是BLOSUM62，缺口開放罰分(gapopeningpenalty)為10，和缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)是0.5。本發(fā)明氨基酸序列("發(fā)明序列，，，例如SEQIDNO:1的氨基酸1至989)和不同的氨基酸序列("外源序列")之間的同一性程度如下所述計算兩個序列比對中精確匹配的數(shù)目，除以"發(fā)明序列"的長度或"外源序列，，的長度，取兩者中最短的。結(jié)果用百分比同一性表示。當(dāng)"發(fā)明序列"和"外源序列"在重疊的相同位置有相同的氨基酸殘基時，發(fā)生精確匹配(在下面的比對實例中用T表示)。序列長度為序列中氨基酸殘基的數(shù)目。在下述純4叚i殳的比對實例中，重疊為序列1的氨基酸序列"HTWGER-NL";或序列2的氨基酸序列"HGWGEDANL"。在實例中，缺口用"-"表示。假設(shè)的比對實例序列1:ACMSHTWGER-NLIiliu序歹ll2:HGWGEDANLAMNPS在#4居本發(fā)明的一個實施方案中，Prml的功能同源物與SEQIDNO:1至少70%相同，特別地與SEQIDNO:1至少80%相同，特別地與SEQIDNO:1至少85%相同，特別地至少90%，更特別地至少95%，最特別地與SEQIDNO:1至少98%相同。在另一個實施方案中序列雜交的多核苷酸編碼互補(bǔ)鏈。在另一個實施方案中序列雜交的多核苷酸編碼互補(bǔ)鏈。在另一個實施方案中序列雜交的多核苷酸編碼互補(bǔ)鏈。在另一個實施方案中序列雜交的多核苷酸編碼互補(bǔ)鏈。根據(jù)本發(fā)明的正調(diào)控子還可以是分離自其他酵母細(xì)胞的Prml的功能同源物。這些功能同源物可以如下所述分離由SEQIDNO:2所示序列開始，例如通過使用SEQIDNO:2或其片段，設(shè)計核酸探針以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬和種的菌株鑒定和克隆編碼具有調(diào)控子活性的多肽的DNA。具體而言，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法，可將這些4果針用于與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定和分離其中相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長度上應(yīng)為至少14，優(yōu)選至少25,更優(yōu)選至少35，并且最優(yōu)選至少70個核苦酸。然而，優(yōu)選所述核酸探針長度上為至少100個核苷酸。例如，所述核酸:探針長度上可為至少200個核芬酸，優(yōu)選至少300個核苷酸，更優(yōu)選至少400個核苷酸，或最優(yōu)選至少500個核苷酸?？梢允褂蒙踔粮L的探針，例如，長度為至少600個核苷酸，至少優(yōu)選至少700個核苷酸，更優(yōu)選至少800個核苷酸，或最優(yōu)選至少900個核苷酸的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標(biāo)記用于探測相應(yīng)的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標(biāo)記)。因而，可從由這些其它生物體制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選與上述探針雜交并且編碼具有調(diào)控子活性的多肽的DNA?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其它分離技術(shù)分離來自這些其它生物體的基因組或其它8,Prml的功能同源物由在至少低嚴(yán)緊條件下與下述:(i)SEQIDNO:2的核苷酸l至2970，或(ii)(i)的，Prml的功能同源物由在至少中嚴(yán)緊條件下與下述:(i)SEQIDNO:2的核苷酸1至2970,或(ii)(i)的,Prml的功能同源物由在至少高嚴(yán)緊條件下與下述:(i)SEQIDNO:2的核苦酸1至2970,或(ii)(i)的,Prml的功能同源物由在非常高嚴(yán)緊條件下與下述:(i)SEQIDNO:2的核苦酸1至2970，或(ii)(i)的DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDNO:2或其亞序列同源的克隆或DNA,將所述載體材料用在Sounthern印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴(yán)緊條件下與標(biāo)記的核酸探針雜交，所述核酸纟笨針對應(yīng)于SEQIDNO:2所示的核苷酸序列、它的互補(bǔ)鏈或其亞序列。可使用X射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。對于長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴(yán)緊條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200|ug/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對于非常低和低嚴(yán)緊性為25%的曱酰胺、對于中和中-高嚴(yán)緊性為35%的曱酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍?yán)緊性為50%的曱酰胺，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡法進(jìn)4亍預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2XSSC、0.2。/。SDS優(yōu)選至少在wc(非常低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在so。c(低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在M。C(中嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在60。C(中-高嚴(yán)緊性)，甚至更優(yōu)選至少在65。C(高嚴(yán)緊性)，并且最優(yōu)選至少在70。C(非常高嚴(yán)緊性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。在具體實施方案中，使用0.2XSSC、0.2。/。SDS優(yōu)選至少在45。C(非常低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在SO。C(低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在5S。C(中嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在M。C(中-高嚴(yán)緊性)，甚至更優(yōu)選至少在6S。C(高嚴(yán)緊性)，并且最優(yōu)選至少在70°C(非常高嚴(yán)緊性)進(jìn)行洗滌。在另一個具體實施方案中，使用0.1XSSC、0.2%SDS優(yōu)選至少在45°C(非常低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在50°C(低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在5S。C(中嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在60。C(中-高嚴(yán)緊性)，甚至更優(yōu)選至少在65。C(高嚴(yán)緊性)，并且最優(yōu)選至少在70。C(非常高嚴(yán)緊性)進(jìn)行洗滌。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的正調(diào)控子還可以是分離自其他酵母細(xì)胞的Prml的功能同源物。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，一個這樣的候選者可以是由來自多態(tài)漢遜酵母(同物異名(syn.):安格斯畢赤酵母)的mut3基因編碼的Mut3。在本文提供的實施例中，已在巴斯德畢赤酵母中過量產(chǎn)生Prml。然而，通過在畢赤酵母屬中過量產(chǎn)生Mut3或在漢遜酵母中過量產(chǎn)生Prml或在漢遜酵母中過量產(chǎn)生Mut3,可能可以獲得同樣的效果。尚未對此進(jìn)行測試。因此在本發(fā)明另一個實施方案中，正調(diào)控子是Mut3。也可以通過僅具有編碼宿主細(xì)胞中存在的調(diào)控子的基因的多個拷貝而提供宿主細(xì)胞中存在的正調(diào)控子水平的增加。雖然正調(diào)控子Prml的確切作用機(jī)制尚未闡明，但是最有可能的是調(diào)控子與曱醇誘導(dǎo)型啟動子的啟動子區(qū)域結(jié)合。因此在本發(fā)明的一個具體實施方案中，控制異源多肽表達(dá)的曱醇誘導(dǎo)型啟動子具有正調(diào)控子的其他結(jié)合位點，/人而增加調(diào)控子的正歲文果(positiveeffect)。通過增加細(xì)胞中正調(diào)控子的水平提供的正效果可依賴于其他因子的存在或者可為獨(dú)立的。一個這樣的其他因子可以是Mxrl蛋白質(zhì)(Lin-Cereghino等，2006，MolCellBiol26(3):883-897)。因此在根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案中，mxrl基因的表達(dá)還受非天然啟動子的控制，特別是選自下組的啟動子GAP啟動子、TEF1啟動子和PGK啟動子。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，和實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公布的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌到培養(yǎng)基中，其能夠從細(xì)胞裂解物(lysate)回收?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的對于所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，酶試-驗(enzymeassay)可用于測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明產(chǎn)生的多肽可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法純化，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，疏酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，J.-C.Janson和LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)。在一個具體實施方案中，由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多肽對于宿主細(xì)胞是異源的。在另一個實施方案中，多肽對于宿主細(xì)胞是同源的。通過下述實施例闡述本發(fā)明中觀察到的效果，所述實施例顯示可以在不向生長培養(yǎng)基中加入曱醇的情況下觀察到由選擇的啟動子的表達(dá)。加入曱醇可能進(jìn)一步增強(qiáng)觀察到的在宿主細(xì)胞中增加Prml水平的效果。因此本發(fā)明的另一個實施方案是如上述所有實施方案中所述的用于增加異源多肽在曱醇誘導(dǎo)型啟動子的控制下的表達(dá)水平的方法，其中培養(yǎng)基中存在曱醇，并且與野生型細(xì)胞相比，Prml的表達(dá)水平增加。優(yōu)選地，Prml基因的表達(dá)是組成型的。實施例材料與方法菌才朱與質(zhì)沖立將巴斯德畢赤酵母GS115(基因型ZhW，InvitrogenTM)用作蛋白質(zhì)表達(dá)的宿主菌4朱。大腸桿菌(J^c/zen'c/^co/z〕DH5a(InvitrogenTM)、TOP10(InvitrogenTM)或XL10(StratageneTM)用作表達(dá)載體構(gòu)建中的克隆宿主。質(zhì)粒pPIC9K和pGAPZa(InvitrogenTM)用于構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，而pCR2.1-TOPO(Invitrogen)、pT7Blue(NovagenTM)用于PCR片段的亞克隆。巴斯德畢赤酵母的轉(zhuǎn)化根據(jù)生產(chǎn)商的規(guī)程(Invitrogen,目錄號K1710-01)，通過電穿孔轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母菌抹。如所述制備感受態(tài)細(xì)胞，并以40)al等分試樣儲存于-70。C。將線性化的質(zhì)粒DNA(500ng)與40|al感受態(tài)細(xì)胞混合，并在冰上保存5分鐘。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰冷的0.2cm電穿孔杯中。使用BioRadTMGenePulserII進(jìn)行轉(zhuǎn)化。使用的參數(shù)為1500V、25[iF和200a加脈沖后立即將細(xì)胞懸浮于1ml水冷的1M山梨醇中。將混合物涂布于相關(guān)的篩選平板上。培養(yǎng)基與測定法RD培養(yǎng)基(1M山梨醇，2%右旋糖，1.34。/。酵母氮源(yeastnitrogenbase),4xl(rV。生物素，0.005%L-谷氨酸、L-曱硫氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸，2。/。純化瓊脂(agarnoble))用于再生用his4選擇的來自巴斯德畢赤酵母GS115的轉(zhuǎn)化子。在用博萊霉素(zeocin)抗性選4奪的情況中，將補(bǔ)加1M山梨醇和100微克/ml博萊霉素的YPD瓊脂(l。/。酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%細(xì)菌用瓊月旨)用于再生。YPD(l。/。酵母提取物，2%蛋白胨和2%葡萄糖)、YPGly(P/。酵母提取物，2%蛋白胨和2%甘油)用于用巴斯德畢赤酵母表達(dá)蛋白質(zhì)。必要時，在1天和2天培養(yǎng)后，向培養(yǎng)液(culturebroth)力。入終濃度為1%或2%(體積百分比)的曱醇。用LB培養(yǎng)基(1.0。/。胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1.0。/。NaCl)及相關(guān)抗生素培育大腸桿菌菌林。^L醇六磷酸酶測定方法將溶于乙酸緩沖液pH5.5的7.5mM肌醇六磷酸鈉與包含0.01。/。Tween20的相同乙酸緩沖液中1/2體積的酶樣品溶液混合。在37°C培育30分鐘后，加入包含溶于10.8%硝酸中的20mM七鉬酸銨和0.06%釩酸銨的終止試劑，從而與釋放的無機(jī)碌酸鹽產(chǎn)生黃色復(fù)合物。用光度計測量405nm處的吸光度作為釋放的磷酸鹽的量。一個肌醇六磷酸酶單位定義為每分鐘釋放1(imol無機(jī)磷酸鹽的酶量。肌醇六磷酸酶平板測定將來自培育轉(zhuǎn)化子2-5天之后的培養(yǎng)液的20pL上清加入下述平板中打出的4mm孔中包含O.lM乙酸鈉(pH4.5)和0.1Q/。肌醇六磷酸的1%瓊脂糖平板。37。C過夜培育平板，并將由1MCaCl2和0.2M乙酸鈉(pH4.5)組成的緩沖液傾倒于平板上。將平板在室溫放置lh，并根據(jù)澄清區(qū)(clearzone)鑒定肌醇六磷酸酶活性。PCR條件通常在下述或相當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行PCR反應(yīng)反應(yīng)化合物包含2mMdNTP、10pmol正向和反向引物，2.8單位Expand高保真混合物(Roche)，1xExpand高保真緩沖液(Roche),和100嗎模板DNA。反應(yīng)條件為，例如<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例1:在DAS1啟動子控制下表達(dá)肌醇六磷酸酶基因的菌林中Prml的組成型表達(dá)TEF1啟動子的克隆與pNo-TP10的構(gòu)建通過下述步驟從巴斯德畢赤酵母克隆TEF1(翻譯延長因子l)啟動子。通過來自酵母酉良酒酵母(5"acc/^ram少cescerWWae)、白色41絲酵母(aw<&fo0/6/<^">)和葡萄汁有孑包漢遜酵母(//""化"/0^0^3m^rww)的TEF1蛋白質(zhì)的同源區(qū)域的比對，設(shè)計下述簡并引物。TEF1(f):5，-ttyaartaygcntgggt-3，(蛋白質(zhì)FKYAWV)SEQIDNO:6和7TEF5(r):5，-arytgytcrtgrtgcatytc-3，(蛋白質(zhì)EMHHEQL)SEQIDNO:8和9使用50微升反應(yīng)液進(jìn)行PCR,所述反應(yīng)液包括4mMdNTP、10jxM每條引物，1單位Taq聚合酶(Roche)，1xTaq緩沖液(Roche)，和100ngGS115DNA的基因組DNA。PCR條件如下所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>將擴(kuò)增的0.7kbp片段純化并亞克隆進(jìn)TA克隆載體pTBlue7。得到的質(zhì)粒用于序列測定。獲得的DNA序列和假設(shè)的氨基酸序列分別如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4中所示。由于獲得的序列與已知的TEF1蛋白質(zhì)具有相似性，所以使用DNA步移SpeedUp預(yù)混試劑盒(Seegene，K1501)與下述特定引物一起克隆包含啟動子序列的上游區(qū)域(SEQIDNO:5)。TEF-TSP1:5,-tgacggtaacgtggtacttt-3，SEQIDNO:10TEF-TSP2:5，-ggagtctcgaacttccacaa-3'SEQIDNO:11TEF-TSP3:5，-agcgatgtcgatggtgatac-3'SEQIDNO:12使用50微升反應(yīng)混合物進(jìn)行PCR，所述混合物包括4mMdNTP、10|iMTEF-TSPl引物，2.5|iM試劑盒中的DW-ACP2引物，1單位Taq聚合酶(Roche)，lxTaq緩沖液(Roche)，和100ng基因組DNA。PCR程序如下所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>使用20微升反應(yīng)混合物進(jìn)行第二次PCR,所述混合物包括2mMdNTP、10)iMTEF-TSP2引物，10來自試劑盒的DW-ACPN引物，0.4單位Taq聚合酶(Roche),1xTaq緩沖液(Roche),和5pi來自第一輪的純化PCR產(chǎn)物，以下述程序進(jìn)行<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>使用50微升反應(yīng)液進(jìn)行第三次PCR，所述反應(yīng)液包括2mMdNTP、10|iMTEF-TSP3引物，10(iM來自試劑盒的通用引物，1單位Taq聚合酶(Roche),lxTaq緩沖液(Roche),和lpl稀釋10倍的來自第二輪的PCR產(chǎn)物，以下述程序進(jìn)行<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在三次巢式PCR后，擴(kuò)增出1.2kbp片段。將這個片段亞克隆進(jìn)pT7Blue并測定序歹。。獲得的序列示于SEQIDNO:5中。使用TEF1ORF上游的1.2kbp區(qū)域作為TEF1啟動子用于進(jìn)一步實驗。質(zhì)粒pNo-TP10是細(xì)菌肌醇六磷酸酶在TEFl啟動子下的表達(dá)質(zhì)粒，并攜帶博萊霉素抗性標(biāo)記基因。如下所述構(gòu)建pNo-TP10。使用下述引物從巴斯德畢赤酵母A94的基因組DNA克隆TEF1啟動子和密碼子優(yōu)化的肌醇六磷酸酶基因(參見實施例2)。引物1和2用于擴(kuò)增TEF1啟動子，而引物3和4用于擴(kuò)增肌醇六磷酸酶基因。引#勿1:5,-tacagggcgcgtggggatatcgg^^agctcatctaggga-3,(BamHI力口下劃纟戔)(SEQIDNO:13)引4勿2:5，-tgaagatggatgggaatctcatatggttggcgaataactaaaatgtatgt-3，(SEQIDNO:14)引物3:5，-acatacattttagttattcgccaaccatatgagattcccatccatcttca-3,(SEQIDNO:15)引4勿4:5，-taattcgcggccgccctagggaattcttactcggtgacagcgcactcggg-3，(EcoRJ力口下劃線)(SEQIDNO:16)使用50微升反應(yīng)液進(jìn)行PCR，所述混合物包括2mMdNTP、10(iM每條引物，2.8單位Expand高保真(Roche),lxExpand高保真緩沖液(Roche),和100ng基因組DNA。PCR程序如下所示，<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>使用凝膠提取純化擴(kuò)增的TEF1啟動子的1.2kbp片段和包含肌醇六磷酸酶基因(包括分泌信號)的1.5kbp片段，用引物1和引物4對它們進(jìn)行第二輪PCR，使用第一次PCR中產(chǎn)生的重疊將這些片段融合。使用50孩i升反應(yīng)液進(jìn)行PCR，所述反應(yīng)液包括2mMdNTP、10jiM每條引物，2.8單位Expand高保真(Roche)，lxExpand高保真緩沖液(Roche)，和1|il純化的TEF1啟動子與1lil純化的肌醇六磷酸酶基因。PCR程序如下所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>將擴(kuò)增的2.7kbp片段亞克隆進(jìn)pT7Blue，得到的質(zhì)粒命名為pT12-8。將來自pT12-8的包括TEF1啟動子和肌醇六磷酸酶基因的BamHI-EcoRI片段與用BglII和EcoRI切割的pGAPZoc連接，得到pNo-TP10。DAS1啟動子的克隆與pNo-DP3的構(gòu)建已知DAS1啟動子在博伊丁假絲酵母中受到曱醇的強(qiáng)誘導(dǎo)(Yurimoto，H.Komeda,T.Lim,C.R.Nakagawa，T.Kondo,K.Kato,N.Sakai,Y.;Biochim.Biophys.Acta1493(1-2):56-63(2000))。通過blast搜索在巴斯德畢赤酵母的基因組序列中發(fā)現(xiàn)了編碼二羥基丙酮合酶的DAS1基因作為博伊丁假絲酵母DAS1基因(EMBL:AF086822)的同源物。使用如下所示引物，通過PCR從巴斯德畢赤酵母的基因組DNA分離出DAS1基因的約1kb的5'-未翻譯區(qū)域作為啟動子區(qū)域引4勿43:5，-ttttggtcatgcatgacgtcatagggagaaaaaccgagac-3，(Nsil"f立，存、力口下劃纟戔)(SEQIDNO:17)虧1物44:5，陽ct^M^gttttgatgtttgatagtttga-3,(NdePf立點加下劃線)(SEQIDNO:18)將擴(kuò)增的1kb片段亞克隆進(jìn)pCR2.1-TOPO的Nsil/Ndel位點，用于這個片段的序列測定(SEQIDNO:19)。從pCR2.1-TOPO切除1kb的DAS1啟動子區(qū)域作為Nsil/Ndel片段，并與用Nsil/Ndel消化的pNo-TP10連接，產(chǎn)生pNo-DP2。為了將標(biāo)記基因從博萊霉素抗性基因改為His4基因，將包含DAS1啟動子的1.4kbAatl1片段和來自pNo-DP2的細(xì)菌肌醇六磷酸酶基因的部分，與來自pPICNoT-G01651的包含其余肌醇六磷酸酶基因和His4基因的9.0kbAatII片段(參見實施例2)，以及細(xì)菌載體連接。將產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pNo-DP3。Prml的克隆和pGPrm的構(gòu)建使用如下所示引物，通過PCR從巴斯德畢赤酵母的基因組DNA分離出我們命名為Prml(曱醇的正調(diào)控子)的基因，其編碼曱醇誘導(dǎo)型啟動子的新型正調(diào)控子引物32:5'-actatttcgaaatgcctcctaaacatcggctg-3，,(BstBPf立點加下劃纟戔)(SEQIDNO:20)引物33:5，-g^g^ttaactgcaaaatttattg-3，(Sall力。下劃線)(SEQIDNO:21)使用50微升反應(yīng)液進(jìn)行PCR,所述反應(yīng)液包括lxLAPCR緩沖液II(TAKARA),2.5U的LAtaq(TAKARA)，2.5mMMgCl2,2.5mMdNTP,1)aM每條引物，lOOng基因組DNA,使用如下程序<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>將獲得的1kb片段亞克隆進(jìn)pCR2.1-TOPO。在驗證序列后，使用BstBI和Sail限制性位點將包含Prml基因的1kbp片段(SEQIDNO:2)克隆進(jìn)pGAPZa(Invitrogen)，得到pGPrm。質(zhì)粒pGPrm攜帶GAP啟動子控制下的Prml基因和作為選擇標(biāo)記的博萊霉素抗性基因。在DAS1啟動子下表達(dá)肌醇六磷酸酶的菌抹DAS40中Prml的組成型表達(dá)將質(zhì)粒pNo-DP3轉(zhuǎn)化入可以his4選擇的巴斯德畢赤酵母GS115中。重新分離產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子，并使用添加曱醇的YPD培養(yǎng)基測試月幾醇六磷酸酶表達(dá)。選擇出一個轉(zhuǎn)化子DAS40作為在曱醇存在時顯示肌醇六磷酸酶活性的菌^^朱。將質(zhì)粒pGPrm轉(zhuǎn)化進(jìn)巴斯德畢赤酵母DAS40,并在博萊霉素平板上分離轉(zhuǎn)化子。在YPD培養(yǎng)基中在30。C將產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子攪拌培養(yǎng)2天，并通過肌醇六磷酸酶檢測測量培養(yǎng)液上清液中的肌醇六磷酸酶活性。結(jié)果示于下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實施例2:在AOX1啟動子下表達(dá)肌醇六磷酸酶基因的菌林中Prml的組成型表達(dá)培養(yǎng)基MD(1.34°/。YNB,4X1(TV。生物素，2。/。右S走糖)BMSY(1%酵母提取物，2%蛋白胨，100mM磷酸鉀緩沖液，pH6.0，1.34%YNB，4X10—V。生物素，1%山梨醇)載體pPIC-NoT，在AOX1啟動子下的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體，其通過從pPIC9K(InvitrogenTM)去除a-分泌信號而獲得。為了產(chǎn)生pPIC-NoT載體，用BamHI和EcoRI消化質(zhì)粒pPIC9K,從瓊脂糖凝膠分離消化的主要片段。通過將下述兩條寡核苷酸退火，產(chǎn)生包含BamHI和EcoRI位點的合成DNA片段NoT-lP-GATCCTACGTAGCTGAG(SEQIDNO:22)和NoT-2P-AATTCTCAGCTACGTAG(SEQIDNO:23)將上述合成DNA片段連接到消化的pPIC9K質(zhì)粒中，通過測序驗證得到的載體pPIC-NoT。PCR引物:<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>質(zhì)粒pPICNoT-G01651在pPICNoT-G01651中使用密碼子優(yōu)化的布氏檸檬酸桿菌(C"ra6acfer6raflh7)肌醇六磷酸酶基因，以增加巴斯德畢赤酵母中cb肌醇六磷酸酶的表達(dá)量(expressionyield)?；诎退沟庐叧嘟湍竷?yōu)選的密碼子選擇，通過替換稀有密碼子、消除重復(fù)的AT并減少GC含量的方法修飾野生型布氏檸檬酸桿菌肌醇六磷酸酶基因。還分析了設(shè)計的序列以避免潛在的內(nèi)含子?；诎退沟庐叧嘟湍傅拿艽a子偏好設(shè)計了與修飾的a-因子分泌信號序列融合的修飾的肌醇六磷酸酶基因(G01651)。巴斯德畢赤酵母密碼子選擇表來自www.kazusa.jp以及Zhao等,2000(ZhaoX，HuoKK，LiYY.SynonymouscondonusageinPichiapastoris.ChineseJournalofBiotechnology,2000,16(3):308-311)。消除了精氨酸的稀有密碼子。除了取代稀有密碼子之外，將總G+C含量降至50%以下，〈奮飾富含AT的區(qū)域，避免早期終止(prematuretermination)。jt匕夕卜，如共同未決的丹麥專利申請PA200601042/NZ10978.000-DK中所述，消除了修飾的編碼區(qū)中隱含的內(nèi)含子(crypticintron)。合成的基因序列示于SEQIDNO:30中(無信號序列的完整ORF)。如下所述產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒pPICNoT-G01651:通過下述重疊延伸PCR方法，生成與優(yōu)化的a-因子信號肽(SEQIDNO:3l)進(jìn)行框內(nèi)融合的(fusedin-frame)編碼cb肌醇六磷酸酶成熟形式的PCR片段(SEQIDNO:30):從pJ2:G01468質(zhì)粒(pJ2:G01468通過DNA2.0產(chǎn)生，并包含與a-因子分泌信號融合的菌絲霉素(plectasin)的成熟形式，其基于巴斯德畢赤酵母密碼子選擇進(jìn)行了修飾)，用特定引物OA-Na和OAPhy-R擴(kuò)增包含a-因子信號肽的片段I，而從pJ2:G01651質(zhì)粒(通過DNA2.0產(chǎn)生，并包含編石馬布氏檸檬酸桿菌肌醇六磷酸酶成熟形式的合成肌醇六磷酸酶基因)，用特定引物OAPhy-F和OPhy-Ca擴(kuò)增編碼成熟肌醇六磷酸酶的片段II。然后將片段I和II混合，用作第二步PCR擴(kuò)增的模板，使用特定引物OA-Na/b和OPhy-Ca/b，獲得目標(biāo)PCR片段。通過凝膠提取試劑盒純化DNA片段，然后亞克隆到pPIC-NoT的BamHI和EcoRI位點。通過測序驗證得到的表達(dá)構(gòu)建體。3ml恥漠的表達(dá)測試使用24孔深孔板(Whatman，UK)，以3ml的規(guī)模進(jìn)行選擇的轉(zhuǎn)化子的表達(dá)測試。每個轉(zhuǎn)化子在BMSY培養(yǎng)基中在28。C以劇烈震蕩(200rpm)生長2.5天；然后每天向每個孔加入300^il0.5%曱醇，進(jìn)行4天以誘導(dǎo)異源基因表達(dá)。在誘導(dǎo)過程中每天取出培養(yǎng)基培養(yǎng)物的樣品，保存在-20。C用于肌醇六磷酸酶活性測定。在A0X1啟動子下表達(dá)肌醇六磷酸酶的菌株A94中Prml的組成型表達(dá)將表達(dá)質(zhì)粒pPICNoT-G01651轉(zhuǎn)化到以/z/"選擇的巴斯德畢赤酵母GS115中，重新分離在含1M山梨醇的MD瓊脂上產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子，并以3ml類y莫測試肌醇六磷酸酶的表達(dá)。選擇一個分離株A94作為在曱醇存在的情況下顯示出肌醇六磷酸酶活性的菌抹。然后將質(zhì)粒pGPrm轉(zhuǎn)化入A94,用博萊霉素抗性分離轉(zhuǎn)化子。分離的轉(zhuǎn)化子在YPD培養(yǎng)基中在30。C攪拌培養(yǎng)2天，通過肌醇六磷酸酶測定法測量培養(yǎng)物上清液中的肌醇六磷酸酶活性。結(jié)果示于下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實施例3:巴斯德畢赤酵母GS115和衍生菌林中Prml的基因破壞使用下述引物通過PCR擴(kuò)增PRM1基因的1571bp基因片段5':JP23/PRMl-5'-forw-NY:5'GCGCGAATTCCACAGGGCTTGCTAAGAAATC3,(SEQIDNO:32);和JP26/PRM1-5'-rev-NY:5，GAAGGGAGATTAATACAGGGC3，(SEQIDNO:33)使用下述引物通過PCR擴(kuò)增PRM1基因的1473bp基因片段3，JP17/PRMl-3'-forw國NY:5'GATTGGACCACTGCGCCAGATAC3，(SEQIDNO:34);和JP19/P腿l-3'-rev-NY:5'GCGCGTCGACCCACCCGAGGATAAGAAGG3，(SEQIDNO:35)使用下述引物通過PCR擴(kuò)增包含HIS4基因(包括啟動子和終止子)的3382bp片段(片段每個末端都包含分別與PRMl5，和3'區(qū)的20bp重疊，意糸夂用于SOE-PCR):JP13/HIS4-forward-NY:5,CCCTGTATTAATCTCCCTTCATCAGAATTGGTTAATTGGTTG3，(SEQIDNO:36);和JP15/HIS4-rev-NY:5'TCTGGCGCAGTGGTCCAATCATCGATAAGCTTTAATGCGG3,(SEQIDNO:37)使用SOE-PCR(通過重疊延伸PCR剪接)將上述三條基因片段以下述順序融合PRMl-5，+HIS4+PRMl-3，，產(chǎn)生prml缺失片段，其具有兩側(cè)為(flankedby)5，prml片段和3，prml片段的選擇性HIS4標(biāo)記。然后將prm1缺失片段轉(zhuǎn)化進(jìn)GS115(具有his4-負(fù)(his4-minus)突變表型)，其允許在不含組氨酸的基本培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。通過PCR分析表征缺失prml基因的菌才朱PFJo435。進(jìn)4亍三次不同的PCR，以'驗i正正確的prml-缺失A)在PRM1未缺失的情況下，PCR將給出704bp的產(chǎn)物-使用下述引物JP58/P腿l-orf-forw-test7:5,CTGGAGCAGAGTATACAGCC3，(SEQIDNO:38);和JP59/PRMl-orf-rev-test8:5，CTCAATAAATGCGGGTCTGTG3，(SEQIDNO:39)B)在PRM1缺失的情況下，缺失特異性PCR將給出1950bp的產(chǎn)物-使用引物JP31/P腿l-5'-forw-testl:5'CCTGGTTGATCAGCTCCACC3'(SEQIDNO:40);和JP33/HIS4-rev-test3:5,CCCGTCAAGTCAGCGTAATGC3，(SEQIDNO:41)C)在PRM1缺失的情況下，缺失特異性PCR將給出1550bp的產(chǎn)物-使用引物JP32/PRMl-3'-rev-test2:5，CTCCCTCTCCAGCTGCTTCG3'(SEQIDNO:42);和JP34/HIS4-forw-test4:5，CGGTGCCTGACTGCGTTAGC3,(SEQIDNO:43)菌抹PFJo435從PCRA未產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，但是從B和C中都得到了預(yù)計的缺失特異性PCR產(chǎn)物一顯示PFJo435中的PRM1已經(jīng)缺失。GS115、PFJo435的Prml基因缺失突變體不能在MM(1.34%YNB,4X10、/。生物素、2%曱醇)上生長，而野生型菌抹GS115H在30。C培養(yǎng)2天后顯示良好的生長。在曱醇存在時由AOX或DAS啟動子的表達(dá)水平，例如，#4居在DAS40或A94衍生菌抹中在DAS啟動子或AOX啟動子控制下的肌醇六磷酸酶基因表達(dá)來測量，在Prml缺失衍生菌抹中，表達(dá)水平降低。在某種程度上，活性降低歸因于外源的Prml基因。對DAS啟動子的結(jié)果如下所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>DAS40和pNo-DP2之前在實施例1之中描述。pNori12的構(gòu)建如下所示。pNoril2的構(gòu)建為了進(jìn)行由DAS啟動子的肌醇六磷酸酶基因和由GAP啟動子的Prm1基因的共表達(dá)，構(gòu)建pNori12。為了替換終止子部分，使用下述引物克隆Prm的原始終止子pr136:5，-ataaattttgacagttaagtcgacctctgtaaattaattgataatttcaa-3,(SEQIDNO:44)pr137:5，-caatgatgatgatgatgatggtcgacgtttaaacttaattaaaagggaaatttacaagcc-3'(SEQIDNO:45)使用總體積50微升的反應(yīng)混合物進(jìn)行PCR，所述混合物包括2mMdNTP,lOfiM每條引物，2.8單位Expand高保真plus(Rosche)，IxExpand高保真緩沖液(Rosche)，和100ngGS115的基因組DNA。PCR程序如下所述。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><吏用In-FusionPCR克隆試劑盒(Clontech)，將擴(kuò)增的500bp片革殳插入pGPrm的SalI位點，以將其與Prm的ORF融合，得到pNorill。為了制備具有GAP-Prm和DAS-肌醇六磷酸酶的表達(dá)質(zhì)粒，從pNo-DP2分離攜帶包含DAS啟動子的肌醇六磷酸酶表達(dá)盒的3354bpSnaBI-XmaI片段，并與pNorill的5323bpXmal-Pmel片段連接，得到pNori12。質(zhì)粒pNoril2攜帶GAP啟動子控制下的Prml基因，DAS啟動子控制下的肌醇六磷酸酶基因，和作為篩選標(biāo)記的博萊霉素抗性基因。實施例4:Mxrl的組成型表達(dá)使用引物Mxr-F和Mxr-R通過PCR從巴斯德畢赤酵母的基因組DNA中分離來自巴斯德畢赤酵母的基因Mxrl，其據(jù)報道是用于曱醇誘導(dǎo)的正調(diào)控子(G.P.Lin-Cereghino等；MOLECULARANDCELLULARBIOLOGY,2006年2月，p.883-897Vol.26,No.3)。引物序列和PCR條件如下所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>將用BstBI和Xbal消化的3.5kbpPCR片段與用同樣酶消化的pGAPZa混合，然后連接。得到的質(zhì)粒pGMxr攜帶GAP啟動子控制下的Mxrl基因和作為轉(zhuǎn)化標(biāo)記的博萊霉素抗性基因。將質(zhì)粒pGMxr轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母DAS40和/或A94。在博萊霉素平板上分離轉(zhuǎn)化子。在YPD培養(yǎng)基中在30°C將產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子攪拌培養(yǎng)2天，并測定培養(yǎng)液的上清液中的肌醇六磷酸酶活性。觀察Mxrl基因的組成型表達(dá)的效果，即誘導(dǎo)pGMxr后，YPD培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化子的肌醇六磷酸酶活性增加。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>對質(zhì)粒pGMxr進(jìn)行修飾，用例如ura3、ade2、arg4、潮霉素抗性基因^,換篩選標(biāo)記基因，獲得pGMxr-m。此夕卜，可以用另一種啟動子如PGK1啟動子或TEF1啟動子替換啟動子區(qū)域，得到pPMxr-m或pTMxr-m。將質(zhì)粒pGMxr-m、pPMxr-m或pTMxr-m轉(zhuǎn)化入為轉(zhuǎn)化而進(jìn)行了必要修飾的巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化子A或轉(zhuǎn)化子3。在YPD培養(yǎng)基中在30°C將新產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子攪拌培養(yǎng)2天，并測量培養(yǎng)液的上清液中的肌醇六磷酸酶活性。權(quán)利要求1.在甲基營養(yǎng)型酵母宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多肽的方法，其中所述多肽的表達(dá)受甲醇誘導(dǎo)型啟動子的控制，所述方法包括i)由非天然啟動子表達(dá)正調(diào)控子，所述正調(diào)控子激活由甲醇誘導(dǎo)型啟動子的轉(zhuǎn)錄，和ii)不加入甲醇。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中曱基營養(yǎng)型酵母宿主細(xì)胞選自下組畢赤酵母屬(Pichia)、漢遜酵母屬(Hansenula)、假絲酵母屬(Candida)和球擬酵母屬(Torulopsis)。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中曱醇誘導(dǎo)型啟動子選自下組AOX1啟動子、DHAS啟動子、FDH啟動子、FMDH啟動子、MOX啟動子、AOX2啟動子、ZZA1、PEX5-、PEX8-、PEX14-啟動子。4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中正調(diào)控子的表達(dá)是組成型的。5.才艮據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中正調(diào)控子為SEQIDNO:1中所示的Prml或其功能同源物。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述功能同源物與SEQIDNO:1至少85%相同，優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%,最優(yōu)選與SEQIDNO:1至少98%相同。7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項的方法，其中所述正調(diào)控子在GAP啟動子、TEF1啟動子或PGK啟動子的控制下。8.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中正調(diào)控子的表達(dá)是誘導(dǎo)型的。9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中編碼正調(diào)控子的基因以多拷貝存在。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項的方法，其中所述曱醇誘導(dǎo)型啟動子具有正調(diào)控子的其他結(jié)合位點。11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中mxrl基因受非天然啟動子的控制。12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中mxrl在GAP啟動子、TEF1啟動子或PGK啟動子的控制下。13.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中畢赤酵母屬宿主細(xì)胞選自下組巴斯德畢赤酵母(尸/7aW0n》、甲醇畢赤酵母(尸m"/^wo//ca)、安格斯畢赤酵母(戶awgita)、^j甲醇畢赤酵母CPf/z^7wcw2ef/za"o//ca)。14.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中漢遜酵母屬宿主細(xì)胞選自下組多態(tài)漢遜酵母(7/(myg"M/a/o/，o/w)。15.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中假絲酵母屬宿主細(xì)胞選自下組博伊丁假絲酵母(Ca"d油6oW"/z')。16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中控制正調(diào)控子的內(nèi)源拷貝的啟動子也被非天然的組成型啟動子所代替。17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述多肽對宿主細(xì)胞是異源的。18.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項的方法，其中所述多肽對宿主細(xì)胞是同源的。19.增加異源多肽在曱醇誘導(dǎo)型啟動子的控制下的表達(dá)水平的方法，其包括提供prml基因的組成型表達(dá)。全文摘要本發(fā)明涉及在甲基營養(yǎng)型酵母宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多肽的方法，其中多肽的表達(dá)受甲醇誘導(dǎo)型啟動子的控制，所述方法包含i)由非天然啟動子表達(dá)正調(diào)控子，所述正調(diào)控子激活由甲醇誘導(dǎo)型啟動子的轉(zhuǎn)錄，和ii)不加入甲醇。文檔編號C07K14/39GK101589146SQ200880002973公開日2009年11月25日申請日期2008年1月25日優(yōu)先權(quán)日2007年1月26日發(fā)明者堤紀(jì)子,孔祥雨,照井佑治,高木忍申請人:諾維信公司