專利名稱：一種重組甲型h1n1流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白ns1的原核表達(dá)、純化及其檢測(cè)方法的建立的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于人畜共患病研究領(lǐng)域，涉及一種人畜共患病的鑒別診斷方法。 選擇了公開(kāi)的甲型H1N1加利福尼亞病毒株(A/California/08/2009 (H1N1)) cDNA序列中非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因?yàn)檠芯績(jī)?nèi)容，利用通過(guò)基因合成方法獲得基因 片段構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-6P-1-NS1;將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中得到 重組菌株(Escherichia coli BL21 rosseta/ pGEX-6P-1-NSl );通過(guò)多種層析 方法獲得純化后的H1N1的非結(jié)構(gòu)蛋白NSl,并利用所述的表達(dá)蛋白通過(guò)免疫宿 主動(dòng)物獲得特異性針對(duì)H1N1非結(jié)構(gòu)蛋白NSl的多克隆或單克隆抗體，建立酶聯(lián) 免疫吸附試驗(yàn)鑒別診斷方法，用于區(qū)分甲型H1N1流感病毒感染與其他流感病毒 感染的病人。
背景技術(shù)：
H1N1是一種病毒，是Orthomyxoviridae系列的一種病毒。它的宿主是鳥(niǎo)類 和一些哺乳動(dòng)物。有些H1N1病毒引起嚴(yán)重的疾病大多發(fā)生于家禽方面，而人類 卻很少出現(xiàn)。但經(jīng)過(guò)鳥(niǎo)類和哺乳動(dòng)物的傳播和變異，這可能導(dǎo)致疫情或人類流 感大面積傳播。
H1N1的A型流感病毒于1918-1919年造成西班牙流感流行，導(dǎo)致2000萬(wàn)-4000 萬(wàn)人死亡。1977年，H1N1與H3N2亞型病毒共同在人類流行，如果抗原變異或與 其他流感病毒亞型發(fā)生基因重排產(chǎn)生新的病毒株，則極可能引起大流行。
研究表明，NS1蛋白僅在流感病毒感染的細(xì)胞中大量表達(dá),而在正常病毒粒子牛不存在，同時(shí)經(jīng)滅活疫苗免疫的動(dòng)物也不會(huì)產(chǎn)生，因此，針對(duì)NS1蛋白的抗 體可能只在流感病毒的宿主中存在，據(jù)此可以區(qū)分滅活疫苗免疫動(dòng)物與活病毒 感染動(dòng)物。已有研究表明，非結(jié)構(gòu)蛋白及其抗體可以作為病毒感染的一個(gè)重要
標(biāo)記。上述特點(diǎn)使NS1蛋白在流感病毒的監(jiān)測(cè)和抗病毒研究中有著廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種重組甲型H1N1流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的原核 表達(dá)與純化的方法，為其抗體的制備提供高純度抗原。
其中所述的重組蛋白的制備方法，它包括下列步驟
(1) 公開(kāi)的甲型H1N1加利福尼亞病毒(A/Cal if ornia/08/2009 (H1N1)) cDNA 序列中非結(jié)抅蛋白NS1基因?yàn)槟康幕?，通過(guò)基因合成的方法獲得基因片段；
(2) 在原核表達(dá)載體pGEX-6P-l多克隆位點(diǎn)中定向插入甲型H1N1流感病毒 非結(jié)抅蛋白基因NS1的DNA序列，構(gòu)建得到原核表達(dá)載體質(zhì)粒pGEX-6P-1-NS1;
(3) 將步驟(2)所說(shuō)的原核表達(dá)載體質(zhì)粒pGEX-6P-l-NS1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BU1 rosseU感受態(tài)細(xì)胞，用氨節(jié)霉素抗性篩選單個(gè)重組菌。
(4) 所述純化具體是pGEX-6P-1-NSl在大腸桿菌Rosetta中表達(dá)，克隆接 種至Sml含有100ug/ml氨節(jié)青霉素的LB緩沖液，37°C,過(guò)夜，220rpm;將過(guò)夜培 養(yǎng)物l: 100稀釋至lL含有100ug/ml氨節(jié)青霉素的LB緩沖液，37°C, 220rpm,培養(yǎng) 5h;加入終濃度為O. lmM的IPTG， 22°C， 180rpm,繼續(xù)培養(yǎng)22h;以8000g, 15min， 4'C離心收菌;菌體用50mM Tris-cl， 200mM NaCl pH8. 0懸起至25ml ，加入5mg 溶菌酶，RT, 0. 5h;用超聲破碎儀超聲至溶液澄清，12000rpm, 20min離心3次;將上清液使用GE healthcare的Glutathione-Sepharose4B柱料純化，得到純化 融合蛋白。PSP酶切GST標(biāo)簽，柱料純化，得到除去標(biāo)簽的NS1蛋白。 實(shí)驗(yàn)證明，純化后NS1可溶性極高， 一年內(nèi)未有聚合物出現(xiàn)。 本發(fā)明提供的利用Pgex-6P-l系統(tǒng)融合表達(dá)再經(jīng)酶切處理去掉標(biāo)簽制得的 NS1蛋白，可以在大腸桿菌中成功表達(dá)，表達(dá)量與前人的結(jié)果類似，相對(duì)于真核
表達(dá)，原核表達(dá)制備工程化抗體技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單，成本更低；
本發(fā)明目的之二是提供一種基于特異性檢測(cè)甲型H1N1流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白
NS1的免疫學(xué)方法的H1N1檢測(cè)試劑盒。
將純化后重組NS1蛋白作為抗原分別免疫家兔和小鼠，獲得高特異性針對(duì) NS1蛋白的多克隆抗體及單克隆抗體；
6)利用獲得的抗體及高純度的重組NS1蛋白，利用包括但不限于雙夾心 ELISA法、免疫比濁法等方法檢測(cè)人體液中的NS1的含量；
所述鑒定的具體過(guò)程是包括但不限于用該蛋白包被ELISA酶標(biāo)板制備ELISA 抗原酶標(biāo)板。用空白對(duì)照菌(Escherichia coli BL21 rosseta/pGEX-6T-l)誘導(dǎo) 產(chǎn)物制備血清稀釋液，按照普通ELISA方法檢測(cè)待檢血清。根據(jù)反應(yīng)后的吸光 值確定陰性、可疑、陽(yáng)性的判斷臨界值。
按照如下的配方制備包被液、洗滌液、封閉液、稀釋液、底物液、終止
液
包被液(25mmo1碳酸鹽緩沖液)Na2C03 2. 322g， Na跳2. 352g, ddH20加 至1000mL(pH9. 6)。
l倍洗滌液:NaCl 8g, KC1 0. 2g， Na2HP04 . 12H20 3. 63g， KH2P04 0. 44g, 雙蒸水加至lOOOmL (pH7. 4)。封閉液2g牛血清白蛋白(BSA)溶于100mL洗滌液。 稀釋液lg牛血清白蛋白(BSA)溶于100mL洗滌液。 底物液購(gòu)買自天健生物制藥(天津)有限公司。 終止液2N H2S04
將NS1抗原酶標(biāo)板、洗滌液(25倍)、稀釋液、HRP標(biāo)記的抗人IgG抗體、 底物緩沖液、終止液組裝成NS1-ELISA鑒別診斷試劑盒。 本發(fā)明的有益效果是
1、 本發(fā)明的有益效果之一是生物安全性高。本發(fā)明所涉及到的原核表達(dá)載 體pGEX-6P-l是分子生物學(xué)中常用的原核表達(dá)載體，沒(méi)有生物危險(xiǎn)性，在此基 礎(chǔ)上構(gòu)建的原核表達(dá)載體pGEX-6P-1-NS1也沒(méi)有任何生物危險(xiǎn)性。重組大腸桿 菌BL21Rosseta/pGEX-6P-1-NS1是將原核表達(dá)載體pGEX-6P-1-NS1轉(zhuǎn)化至分子 生物學(xué)中常用的大腸桿菌BL21Rosseta感受態(tài)細(xì)胞后經(jīng)氨節(jié)霉素抗性篩選獲得， 也不具生物危險(xiǎn)性。本發(fā)明所用的抗原酶標(biāo)板是用甲型H1N1流感病毒的非結(jié)構(gòu) 蛋白制備的，制備過(guò)程中不涉及活病毒，因此沒(méi)有活病毒逃逸、擴(kuò)散的潛在危 險(xiǎn)。
2、 本發(fā)明的有益效果之二是生產(chǎn)成本低。本發(fā)明所提供的甲型H1N1流感 鑒別診斷方法和診斷試劑盒所需抗原是甲型H1N1流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。該蛋 白可以通過(guò)重組大腸桿菌BL21Rosseta/ pGEX-6P-1-NS1在體外得到大量的表 達(dá)，適合大規(guī)模的生產(chǎn)。
3、 本發(fā)明的有益效果之三是提供的鑒別診斷試劑盒使用方便。本發(fā)明在提 供了鑒別診斷方法的基礎(chǔ)上，還將該方法所需的各種試劑組裝成試劑盒，搡作 簡(jiǎn)單易行，非常適合臨床大規(guī)模檢測(cè)。


圖l顯示Pgex-6P-l載體圖譜。
圖2 NS1融和蛋白小量表達(dá)鑒定SDS-PAGE電泳圖。其中1為未誘導(dǎo)菌株，M為 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上到下依次為115KD、 66KD、 45KD、 35KD、 25KD、 18. 4KD、 14. 4KD, 2為1號(hào)誘導(dǎo)后菌株，3為2號(hào)誘導(dǎo)后菌株，4為3號(hào)誘導(dǎo)后菌株，5為4 號(hào)誘導(dǎo)后菌株,6為5號(hào)誘導(dǎo)后菌株，7為6號(hào)誘導(dǎo)后菌株,8為7號(hào)誘導(dǎo)后菌株，9 為8號(hào)誘導(dǎo)后菌株；
圖3顯示的是純化后的NS1融和蛋白SDS-PAGE電泳圖。其中1為純化后的融和 蛋白1號(hào)管蛋白，2為純化后的融和蛋白2號(hào)管蛋白，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，從 上到下依次為115KD、 66KD、 45KD、 35KD、 25KD、 18. 4KD、 14. 4KD; 圖4酶切后除掉標(biāo)簽的NS1蛋白SDS-PAGE電泳圖。其中1為酶切后不帶標(biāo)簽的 NS1蛋白，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上到下依次為115KD、 66KD、 45KD、 35KD、 25KD、 18. 4KD、 14. 4KD;
專利
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1甲型H1N1流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建
BamHI及Sail酶切PUC57-NS1和載體pGEX-6P-1,回收NS1基因和載體 pGEX-6P-1;然后用T4 DNA 1 igase連接，22度水洛1小時(shí)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossetta 感受態(tài)細(xì)胞，37。C培養(yǎng)，從中隨機(jī)挑選多個(gè)單菌落，分別放入LB液體培養(yǎng)基中
737。C培養(yǎng)5小時(shí)后，菌體OD值約0. 6時(shí)加IPTG至終濃度lmM，經(jīng)小量表達(dá)鑒定， 挑取陽(yáng)性克隆。。
實(shí)施例2甲型H1N1流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的大量誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白純化
pGEX-6P-1-NS1在大腸桿菌Rosetta中表達(dá)，克隆接種至3ml含有100ug/ml 氨芐青霉素的LB緩沖液，37°C,過(guò)夜，220rpm;將過(guò)夜培養(yǎng)物1 : IOO稀釋至 1L含有100ug/ml氨節(jié)青霉素的LB緩沖液，37°C, 220rpm,培養(yǎng)5h;加入終濃 度為0. lmM的IPTG, 22。C, 180rpm，繼續(xù)培養(yǎng)22h;以8000g, 15min, 4。C離心 收菌；菌體用50mMTris-Cl, 200mM NaCl pH8. 0懸起至25ml ，加入5mg溶菌酶， RT, 0. 5h;用超聲破碎儀超聲至溶液澄清，12000rpm，20min離心3次；將上清液 使用GE healthcare的Glutathione-S印harose4B柱料純化，得到純化融合蛋 白。PSP酶切GST標(biāo)簽，柱料純化，得到除去標(biāo)簽的NS1蛋白。
實(shí)施例3甲型H1N1感病毒NS1—ELISA鑒別診斷試劑盒構(gòu)成
1.1包被抗原的微孔板U孔xU條xl塊)
1.2 HRP標(biāo)記抗人IgG l瓶(120ul /瓶)
1. 3 25倍洗滌液濃縮液I瓶(20ml/瓶)
1.4稀釋液2瓶(2Qml/瓶)
1. 5底物液1瓶(10ml/瓶)
1.6終止液l瓶(1Qml/瓶)
實(shí)施例4甲型H1N1流感病毒NS1-ELISA操作步驟
a)從4'c冰箱中取出試劑盒，平衡各組分至室溫。
(2)取預(yù)包被的微孔條板(根據(jù)標(biāo)本多少，可拆開(kāi)分次使用)，除空白對(duì)照 孔外，每孔加入以樣品稀釋液l: 40稀釋的待檢樣品，每孔加100ul,同樣l:40稀釋對(duì)照血清，設(shè)陽(yáng)性對(duì)照2孑L，陰性對(duì)照2孑L，空白孔不加，輕輕振勻孔 中樣品(勿溢出)，置37X:溫育1小時(shí)。
(3) 甩掉板孔中的溶液，用洗滌液洗板3次，200 ul/次，每次靜置3分鐘 倒掉，最后一次拍干。
(4) 每孔加酶標(biāo)二抗100 ul,置37。C溫育30分鐘。
(5) 洗滌4次，200 ul/次，每次靜置3分鐘倒掉，最后一次拍干。
(6) 每孔加底物90ul，室溫避光顯色(30分鐘以內(nèi))。
(7) 每孔加終止液50ul, 15分鐘內(nèi)測(cè)定結(jié)果。
權(quán)利要求
1、一種重組甲型H1N1流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的原核表達(dá)、純化及其檢測(cè)方法的建立。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)，其特征是，使用裝載有包含甲型H1N1流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因的原核表達(dá)載體在原 核宿主大腸桿菌中表達(dá)蛋白產(chǎn)物。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化，其特征是，將宿主表達(dá)出的帶有 標(biāo)簽的甲型H1N1流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1蛋白利用親和層 析、分子篩、離子交換等方法提高重組蛋白純度。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型H1N1流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1， 其特征是，與天然甲型H1M流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1具有相 同或相似的免疫原性。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組甲型H1N1流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白 NS1,其特征是，該蛋白為加利福尼亞州發(fā)現(xiàn)甲型H1N1病毒 株的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征是，使用重組甲型 H1N1流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，通過(guò)免疫小鼠、家兔或通過(guò) 噬菌體庫(kù)，獲得高特異性甲型H1N1流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1 的單抗、多抗、基因工程抗體，并通過(guò)獲得的抗體及重組蛋 白，基于免疫學(xué)方法建立包括但不限于免疫比濁法以及酶聯(lián) 免疫(ELISA)法的免疫學(xué)方法檢測(cè)樣品中人甲型H1N1流感 病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1濃度的方法。
全文摘要
本發(fā)明屬于人畜共患病研究領(lǐng)域，涉及一種人畜共患病的鑒別診斷方法。選擇了公開(kāi)的甲型H1N1加利福尼亞病毒株(A/California/08/2009(H1N1))cDNA序列中非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因?yàn)檠芯績(jī)?nèi)容，利用通過(guò)基因合成方法獲得基因片段構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-6P-1-NS1；將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中得到重組菌株(Escherichia coli BL21 rosseta/pGEX-6P-1-NS1)；通過(guò)多種層析方法獲得純化后的H1N1的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，并利用所述的表達(dá)蛋白通過(guò)免疫宿主動(dòng)物獲得特異性針對(duì)H1N1非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的多克隆或單克隆抗體，建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)鑒別診斷方法，用于區(qū)分甲型H1N1流感病毒感染與其他流感病毒感染的病人。
文檔編號(hào)C07K14/11GK101603046SQ20091006249
公開(kāi)日2009年12月16日 申請(qǐng)日期2009年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月10日
發(fā)明者華權(quán)高 申請(qǐng)人:武漢華美生物工程有限公司