專利名稱：：重組人腎臟損傷分子1(kim-1)的原核表達、純化及其檢測方法的建立的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種腎臟損傷相關(guān)蛋白的原核表達、純化及其在體液樣本中濃度的免疫學檢測方法的建立。具體的來講，本發(fā)明提供了腎臟損傷分子KKIM-1)的原核表達及純化的方法，該方法的建立為得到高純度的KIM-1提供了強有力的實驗基礎(chǔ)；另外本發(fā)明涉及的KIM-1作為抗原，通過免疫學方法或基因工程原理有效的獲得了，特異性針對KIM-1蛋白的抗體，通過反復的實驗驗證，該發(fā)明涉及的抗原抗體可以有效利用于人體液中人KIM-1的濃度檢測。
背景技術(shù)：
：腎臟損傷分子-UKIM-l)是一種跨膜蛋白，在正常腎臟中并不表達，而在腎臟損傷的動物模型中表達明顯增加。動物研究表明，KIM-1的外功能區(qū)斷裂后產(chǎn)物能夠通過尿中排出，因此檢測尿中KIM-1水平可以間接評價腎臟損傷的情況，但尚來證實這一理論在人類腎臟損傷中同樣成立。荷蘭學者Timmeren等對102例不同腎臟疾病病理標本及正常對照標本的腎小管中KIM-1表達的差異進行了分析，并對尿中KIM-1水平與腎臟損傷程度進行了相關(guān)性分析。結(jié)果表明，與正常對照組相比，在所有腎臟疾病中腎組織KIM-1的表達和尿中KIM-l水平均明顯增高。免疫組化檢測顯示，腎臟損傷時KIM-l在發(fā)生纖維化及炎癥反應部位的腎小管彌漫性表達，集中在靠近管腔一側(cè)，與鈣粘蛋白分離，與波形蛋白緊密結(jié)合。另一個鮮明的特點是，不管造成腎臟損傷的原發(fā)疾病是否相同，KIM-1的表達與腎臟損傷的程度呈現(xiàn)正向相關(guān)，而與腎臟功能呈現(xiàn)明顯的負相關(guān)，與蛋白尿的水平之間并沒有相關(guān)關(guān)系。尿中KIM-1水平與局部組織中KIM-1表達水平具有密切的正相關(guān)關(guān)系，同時局部組織中的炎癥情況也會影響尿中KIM-l的水平，尿中KIM-l排泄增多提示腎臟功能的下降，這種相關(guān)關(guān)系同樣具有統(tǒng)計學差異，尿中KIM-l水平與蛋白尿水平間同樣沒有明確的相關(guān)關(guān)系。因此Ti腿eren等認為，在腎臟疾病患者中，KIM-1在腎小管細胞表達增加并與腎臟損傷程度密切相關(guān)。尿中KIM-l水平能夠反映組織中KIM-1表達情況及炎癥反應程度，并與腎臟功能密切相關(guān)，因此可將KIM-l作為監(jiān)測腎臟病損傷狀態(tài)的非侵入性生物標志。從蛋白一級結(jié)構(gòu)分析，人KIM-1共包括364個氨基酸，其中1-20為信號肽，表達時被切除成為成熟狀態(tài)；21-290位為胞外部分；291位-311位為一段具有21個氨基酸的跨膜序列；最后48個氨基酸則構(gòu)成了該蛋白的胞內(nèi)'域。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了重組人KIM-1的原核表達、純化及其檢測方法的建立，包括以下步驟將KIM-l編碼胞外域的基因擴增獲得后插入表達載體PET28a,得到PET28a-KIM-1。所述表達是在將質(zhì)粒HIS-KIM-1在大腸桿菌中表達和培養(yǎng)。所述純化是指將大腸桿菌破碎，然后離心或過濾分離出融和蛋白。破碎可采用電動搗碎機或勻漿機破碎或用超聲波處理破碎，也可以用溶菌酶處理?？捎帽绢I(lǐng)域內(nèi)常用的層析法或電泳法進行，優(yōu)選凝膠層析法進行。所述檢測方法是指利用上述方法得到蛋白作為抗原通過免疫學方法或基因工程原理獲得的抗體，利用免疫學方法檢測樣品中的濃度的方法具體的說上述步驟如下進行-.1)PCR擴增表達KIM-l的基因片段，兩端帶有NdeI和XhoI酶切位點，酶切消化后插入Ndel和XhoI消化后的Pet28a,得到質(zhì)粒PET28a-KIM-1;2)HIS-KIM-l在大腸桿菌Rosetta中表達，克隆接種至3ml含有100ug/mlkana的LB緩沖液，37°C,過夜，220rpm;將過夜培養(yǎng)物l:100稀釋至lL含有100ug/mlkana的LB緩沖液，37°C,220rpm,培養(yǎng)5h;加入終濃度為0.lmM的IPTG，22°C,180rpm，繼續(xù)培養(yǎng)22h;以8000g，15min，4。C離心收菌；菌體用50mMTris-Cl,200mMNaClpH8.0懸起至25ml，加入5mg溶菌酶，RT,0.5h;用超聲破碎儀超聲至溶液澄清，12000rpm,20min離心3次;3)將上清液使用GEhealthcare的chelatingsepHaroseFastFlow柱料純化，得到純化融合蛋白。4)凝血酶酶切HIS標簽，Ni柱純化，得到除去標簽的KIM-1蛋白。實驗證明，純化后KIM-l可溶性極高，20mg/mlKIM-l在50mMTris，500mMNaCl中保存，于4"C幾個月內(nèi)未見明顯沉淀未有降解，F(xiàn)PLC表明KIM-1為單體，一年內(nèi)未有聚合物出現(xiàn)。本發(fā)明提供的利用PET28a系統(tǒng)融合表達再經(jīng)酶切處理去掉標簽制得的KIM-1蛋白，可以在大腸桿菌中成功表達，衷達躉與前人的結(jié)果類似，相對于真核表達，原核表達制備工程化抗體技術(shù)相對簡單，成本更低；5)將純化后重組KIM-1蛋白作為抗原分別免疫家兔和小鼠，獲得高特異性針對KIM-l蛋白的多克隆抗體及單克隆抗體；6)利用獲得的抗體及高純度的重組KIM-l蛋白，利用包括但不限于雙夾心EL工SA法、免疫比濁法等方法檢測人體液中的KIM-1的含量。圖l:圖中顯示內(nèi)容為本發(fā)明中使用的蛋白表達載體PET28a的載體圖譜。圖2:圖中顯示內(nèi)容為本發(fā)明中HIS-KIM-1融和蛋白小量表達蛋白電泳圖片。圖中1、蛋白分子量標準，由上至下分子量標準為llSkd、6"ci、4SH、35kd、25kd、18.4kck14,4kd2、未加IPTG誘導的菌株；3、加IPTG誘導的菌株。圖3:圖中顯示內(nèi)容為本發(fā)明中純化后的KIM-1蛋白電泳圖片。圖中l(wèi)和2、純化后的KIM-l蛋白M、蛋白分子量標逸，由上至下分汙量標準為115kd、66kd、45kd、35kd、25kd、18.4kd、14.4kd。圖4:圖中顯示內(nèi)容為本發(fā)明中純化后KIM-]蛋白Superdex200凝膠過濾層析洗脫曲線。圖中最高的峰為純化后KIM-1蛋白的峰。圖5:圖中顯示內(nèi)容為本發(fā)明中純化KIM-1多克隆抗體親和層析柱洗脫曲線。圖6:利用竟爭法ELISA檢測人尿液中KIM-1含量的標準曲線。表1:利用免疫比濁法檢測人尿液中KIM-1的回收率。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例lKIM-1的制備KIM-l蛋白廣泛存在于多種生物體中，其編碼基因一般可以通過RT-PCR從生物體cDNA中獲得，本發(fā)明中，以質(zhì)粒PCDNA3.1-KIM-l為模板擴增得到。1.克隆PET28a-KIM-1:選擇表達載體PET28a為克隆載體(見圖l)，根據(jù)其多克隆位點及KIM-l序列特點，設(shè)計兩端引物PCR擴增表達KIM-l的基因片段，兩端帶有MeI和XhoI酶切位點，酶切消化后插入Ndel和XhoI消化后的Pet28a,得到質(zhì)粒PET28a-KIM-1;2.表達純化PET28a-KIM-1:將質(zhì)粒HIS-KIM-l在大腸桿菌Rossetta中表達。首先通過小量表達鑒定，誘導株與未誘導株相比，在60KD左右處有明顯特異條帶(見圖2),大量培養(yǎng)后，通過SDS-PAGE分析上清沉淀，結(jié)果顯示，該蛋白在上清中存在，利用其所帶HIS標簽，通過IMAC的方法，可獲得純度為99%以上的目的蛋白(見圖3)。HIS-KIM-l在大腸桿菌Rosetta中表達，克隆接種至3ml含有100ug/mlkana的LB緩沖液，37°C,過夜，220rpm;將過夜培養(yǎng)物l:100稀釋至lL含有100ug/mlkana的LB緩沖液，37°C,220rpm，培養(yǎng)5h;加入終濃度為0.lmM的IPTG，22°C,180rpm，繼續(xù)培養(yǎng)22h;以8000g,15min,4。C離心收菌；菌體用50mMTris-Cl，200mMNaClpH8.0懸起至25ml，加入5mg溶菌酶，RT，0.5h;用超聲破碎儀超聲至溶液澄清，12000rpm，20min離心3次；上清使用GEhealthcare的chelatingsepHaroseFastFlow柱料純化，步驟參照其廠家提供的說明書。HIS-KIM-l于咪唑濃度為60mM時被洗脫。產(chǎn)量高達50-100亳克每升培養(yǎng)物。凝血酶酶切HIS標簽，Ni柱純化，得到除去標簽的KIM-l蛋白。為分析KIM-l在溶液中是否均一，將2mgKIM-l換至20mMTris-Cl,pH8.0,50mMNaCl的緩沖液中。樣品通過20mMTris-Cl，pH8.0,50mMNaCl平衡好的s叩erdex200柱子。整個操作參考AKTAPurifier提供的手冊。結(jié)果顯示純化好的KIM-l于咪唑濃度為60mM時被洗脫。產(chǎn)量高達50-100毫克每升培養(yǎng)物。通過superdex200柱子時未見明顯的多聚體，主要以一個均一的峰出現(xiàn)(見圖4)。8實施例2KIM-l多克隆抗體及單克隆抗體的制備1.多克隆抗體的制備取蛋白lml(0.5mg左右)，與弗式完全佐劑l:1(V/V)充分混合乳化，乳化物滴于冰水上幾分鐘內(nèi)完全不擴散為好。選取2.5-3kg的健康雌兔一只，初次免疫在兔后足足墊和背部皮下多點注射，每點注射量約100ul。兩周后，再取lml,與不完全佐劑l:l混合，兔背部皮下多點注射。兩周后，同樣加強免疫一次。IO天后，加強免疫一次，IO天后再加強免疫一次。若測效價高(雙擴散，1/8以上)，三天后頸動脈放血，血液于4度凝固后，于5000rpm離心5min得到抗血清，用親和層析方法純化抗體。2.單克隆抗體制備2.1免疫6周齡雌性BALB/C小鼠5只，劑量為每只O.2mL(含50ugKIM-1蛋白)，背部皮下分點注射。首免與等量弗式完全佐劑混合乳化，加強免疫與等量弗式完全佐劑混合乳化，共免5次，每次間隔4周，最后1次免疫后10天斷尾釆血分離血清，間接ELISA檢測效價，操作程序參照TIJSSEN的方法。2.2融合、雜交瘤篩選1)細胞融合融合前2d用RPMI-1640傳代培養(yǎng)NS0細胞，前l(fā)d用HAT培養(yǎng)滋養(yǎng)細胞；小鼠摘除眼球釆血，分離陽性血清，脫頸致死小鼠，無菌取脾臟制備脾細胞，在50%PEG4000作用下與NS0細胞融合，將融合后的細胞懸液加到已鋪有滋養(yǎng)細胞層的96孔細胞培養(yǎng)板中，HAT培養(yǎng)。2)融合細胞的培養(yǎng)及陽性雜交瘤的篩選與克隆融合細胞共培養(yǎng)14d,分別于第4，7，10d用HAT換液，第14d起用RPMI-1640培養(yǎng)并篩選；間接ELISA進行陽性孔篩選，選擇強陽性、抑制率高、細胞生長旺盛的孔有限稀釋克隆化，而后擴大培養(yǎng)、凍存和鑒定。3)mAb的制備采用體內(nèi)誘生腹水法。并用親和層析純化抗體。實施例3用夾心法ELISA確定病人尿液KIM-1濃度具體步驟是包被KIM-1抗體A;配制系列KIM-1標準品；準備病人尿液；將系列標準品或待定值的病人尿液加入96微孔板孔內(nèi)，再使已標記的、結(jié)合位點不同于包被在96微孔板上抗體A的抗體B結(jié)合，用基質(zhì)液顯色20-30分鐘后終止顯色，10分鐘后測定上述系列標準品和待檢測的病人尿液中KIM-1反應后的吸光度；建立系列標準品的濃度和吸光度的標準曲線并從曲線中查出待定值的病人尿液的KIM-1的濃度。實施例4用竟爭法ELISA確定病人尿液KIM-1濃度具體步驟是包被KIM-1多克隆抗體；配制系列KIM-1標準品；準備病人尿液；使系列標準品或待定值的病人尿液和已標記的KIM-1標準品混合；用基質(zhì)液顯色20-30分鐘后終止顯色，IO分鐘后測定上述系列標準品和待檢測的病人尿液中UM-1反應后的吸光度；建立系列標準品的濃度和吸光度的標準曲線并從曲線中查出待定值的病人尿液的KIM-1的濃度。實施例5乳膠增強免疫比濁法檢測病人尿液中的KIM-1含量實現(xiàn)本實例的技術(shù)方案一種檢測人KIM-1的免疫比濁法，用抗KIM-l的多克隆抗體首先與乳膠交聯(lián)，然后用交聯(lián)后的乳膠溶液與待檢標本的KIM-1反應，所形成的復合物引起濁度變化；用光投射強度或光散射強度表征這種變化；從KIM-1標準品的濃度與相應光散射強度或光投射強度的標準曲線查出待檢樣本的KIM-l含量；其中所用的KIM-l的多克隆抗體效價至少為1:500,不含雜抗體，具有識別KM-1多種抗原決定簇；待檢標本用稀釋劑做l:200-1:1000稀釋。上述方法中，所述KIM-l標準品是純KIM-l,其濃度為Q.2mg/mi，先用稀釋劑做l:200倍稀釋，再做倍比稀釋，做成系列標準品，供作標準曲線用。權(quán)利要求1、重組人腎臟損傷分子1(KIM-1)的原核表達、純化及其檢測方法的建立。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的原核表達，其特征是，使用裝載有包含人KIM-1基因的原核表達載體在原核宿主大腸桿菌中表達蛋白產(chǎn)物。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的純化，其特征是，將宿主表達出的帶有標簽的重組人KIM-l蛋白利用親和層析、分子篩、離子交換等方法提高重組蛋白純度。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的重組人KIM-1，其特征是，與天然人KIM-l具有相同或相似的免疫原性。5、根據(jù)權(quán)利要求l所述的重組人KIM-1,其特征是，該蛋白包括整個胞外域部分。6、根據(jù)權(quán)利要求l所述的檢測方法，其特征是，使用重組人KIM-1，通過免疫小鼠、家兔或通過噬菌體庫，獲得高特異性人KIM-1的單抗、多抗、基因工程抗體，并通過獲得的抗體及重組蛋白，基于免疫學方法建立包括但不限于免疫比濁法以及酶聯(lián)免疫(ELISA)法的免疫學方法檢測樣品中人KIM-1的濃度的方法。全文摘要本發(fā)明涉及一種腎臟損傷相關(guān)蛋白的原核表達、純化及其在體液樣本中濃度的免疫學檢測方法的建立。本發(fā)明提供了腎臟損傷分子1(KIM-1)的原核表達及純化的方法，該方法的建立為得到高純度的KIM-1提供了強有力的實驗基礎(chǔ)；另外本發(fā)明涉及的重組KIM-1作為抗原，通過免疫學方法或基因工程原理有效的獲得了，特異性針對KIM-1蛋白的抗體，通過反復的實驗驗證，該發(fā)明涉及的抗原抗體可以有效利用于人體液中KIM-1的濃度檢測；該發(fā)明為腎病病人尿液或血漿中KIM-1確定了一個簡便、重現(xiàn)性好、適應性強的檢測手段，并使KIM-1對臨床的指導作用及進一步研究其功能提供了可能。文檔編號C07K14/435GK101603047SQ20091006249公開日2009年12月16日申請日期2009年6月10日優(yōu)先權(quán)日2009年6月10日發(fā)明者華權(quán)高申請人:武漢華美生物工程有限公司