專利名稱：重組人共刺激分子卡介苗菌株及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)，具體是一種重組人共刺激分子卡介苗菌株及其制備方法。
背景技術(shù)：
卡介苗(BCG)是一種毒力強(qiáng)的牛型分枝桿菌減毒形成的生物免疫調(diào)節(jié)劑，具有高度的安全性和極少的嚴(yán)重并發(fā)癥，全世界廣泛用于預(yù)防結(jié)核病。
膀胱內(nèi)灌注野生型卡介苗在預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)、治療殘余腫瘤和原位癌等方面已經(jīng)取得令人滿意的臨床療效，但仍有30-45％的病人對腔內(nèi)卡介苗灌注治療無反應(yīng)，此外，腔內(nèi)卡介苗灌注可引起膀胱局部和全身反應(yīng)，5％患者可出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，0.5％甚至可危及生命，使其預(yù)防和治療淺表膀胱腫瘤受到一定限制。
中國專利1353183公開了“一種重組卡介苗菌株建立及其應(yīng)用”，該發(fā)明通過構(gòu)建一種攜帶有兩種外源基因即IL-2基因和GFP基因的rBCG，使原有的BCG具有IL-2和GFP的功能，可利用這種rBCG-GFP-IL-2菌株研究BCG或重組BCG的作用原理，同時(shí)用豬苓多糖彌補(bǔ)生物制劑的不足，從而建立一種有效消除腫瘤細(xì)胞的方法。該發(fā)明的技術(shù)特征是利用綠色熒光蛋白(GFP)作為報(bào)告基因，在穿梭質(zhì)粒中插入IL-2基因片段，構(gòu)成復(fù)合表達(dá)綠色熒光蛋白和白介素2重組BCG(rBCG-GFP-IL-2)菌株。
目前國際國內(nèi)有將其它細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)入BCG的研究，但尚無采用共刺激分子形成雙重刺激信號進(jìn)行治療的卡介苗菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決部分膀胱腫瘤病人對膀胱內(nèi)灌注野生型卡介苗治療無反應(yīng)，及野生型卡介苗對部分病人產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，而提供一種高效，低副作用，免疫預(yù)防及治療專用的基因重組卡介苗菌株，即重組人共刺激分子卡介苗菌株及其制備方法本發(fā)明的理論依據(jù)機(jī)體對腫瘤的免疫應(yīng)答主要由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，后者的活化和增殖需兩個(gè)信號抗原特異性第一信號和由共刺激分子介導(dǎo)的非抗原特異性的第二信號。缺乏共刺激信號的刺激可導(dǎo)致T細(xì)胞免疫耐受或引起活化誘導(dǎo)的T細(xì)胞死亡。共刺激因子包括B淋巴細(xì)胞激活抗原B7分子等，B7分子是其中最重要的一種，在大多數(shù)腫瘤中不表達(dá)或弱表達(dá)，這是引起腫瘤逃避的重要原因之一。
因此研究一種高效，低副作用，免疫預(yù)防與治療專用的基因重組卡介苗菌苗已成為基礎(chǔ)與臨床研究的重大課題。重組卡介苗是將卡介苗作為工程菌，利用基因工程技術(shù)將外源基因?qū)肟ń槊缰?，依靠卡介苗在宿主?nèi)復(fù)制，表達(dá)外源抗原，以誘導(dǎo)對多種疾病的特異性體液和細(xì)胞免疫。
本發(fā)明是按以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
一種重組人共刺激分子卡介苗菌株，其表達(dá)人共刺激分子B7-2的大腸桿菌-分支桿菌穿梭表達(dá)載體，在卡介苗中表達(dá)，得到具有分泌活性共刺激分子B7-2功能的重組卡介苗菌株rBCG-hB7-2。
一種重組人共刺激分子卡介苗菌株的制備方法，其重構(gòu)建大腸桿菌-分支桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒，用電穿孔法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化卡介苗。
所述的制備方法，其hB7-2(IgC+IgV)片段聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是采用上游引物5′-gctcctctgaagattc-3′、下游引物5′-agctgtaatccaaggaatg-3′。
所述的制備方法，質(zhì)粒pYL-hB7-2的建立為pYL-hIFN-α-2B質(zhì)粒與hB7-2(IgC+IgV)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物用BamHI和XhoI酶切后連接。
所述的制備方法，其質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化是每管加入感受態(tài)細(xì)菌，加入pYL-hB7-2質(zhì)粒，混合后轉(zhuǎn)化，接種到卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，選擇陽性菌落。
所述的制備方法，其單克隆菌落的擴(kuò)增是挑取單克隆菌落，將其接種到卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。
所述的制備方法，其卡介苗的電轉(zhuǎn)化取卡介苗菌液冰浴后離心、棄上清；預(yù)冷甘油洗滌沉淀二次；將質(zhì)粒DNA溶于液體，然后將感受態(tài)卡介苗菌液倒入，充分混合后電轉(zhuǎn)化，再涂布到含卡那霉素的7H10固體培養(yǎng)皿上，3～4周后選取卡那霉素陽性菌落。
所述的制備方法，其rBCG-hB7-2陽性菌落的挑選、擴(kuò)增及PCR反應(yīng)產(chǎn)物測序正確，重組卡介苗表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
這樣制備的重組人共刺激分子卡介苗菌株及其制備方法，其菌種保藏號CGMCC No.1120。
本發(fā)明的重組卡介苗與野生型卡介苗相比，①由于重組卡介苗能夠分泌細(xì)胞因子，在達(dá)到同樣甚至增加免疫效果的條件下可較野生型卡介苗降低用量，從而降低了毒副作用；②重組卡介苗能夠分泌細(xì)胞因子避免了直接使用細(xì)胞因子帶來的高額費(fèi)用和反復(fù)灌注的缺點(diǎn)；③重組卡介苗能夠在最為合適的時(shí)間和部位分泌細(xì)胞因子。
這種基因工程卡介苗菌株與分枝桿菌佐劑加病原體抗原配制的混合疫苗相比，rBCG集佐劑和載體于一身，兼多種外源基因與活菌株于一體，一次接種可獲得強(qiáng)而持久的抗腫瘤免疫?？ń槊缇阹BCG-hB7-2較以前的野生型疫苗具有高效低毒副作用的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明結(jié)合卡介苗和共刺激分子兩者在膀胱癌免疫治療中的優(yōu)勢(1)卡介苗增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞免疫原性，引誘淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞因子。(2)B7提供共刺激信號，激活淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞，殺傷腫瘤細(xì)胞。這樣重組的治療用卡介苗菌株可以加強(qiáng)第一信號，并同時(shí)提供共刺激信號，雙重作用可以達(dá)到降低卡介苗用量而減少毒副作用，并能明顯提高治療效果的目的。


附圖為重組PLY-hB7-2質(zhì)粒圖。
圖中1hB7-2基因功能區(qū)序列、2卡那霉素抗性基因、3大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)、4分支桿菌復(fù)制起點(diǎn)、5熱休克蛋白60啟動(dòng)子、6信號序列。
具體實(shí)施例方式
一.材料(一)菌株大腸桿菌為DH5α，本所保存?？ń槊缳徸员本┥镏破费芯克?，丹麥I型。
(二)質(zhì)粒載體質(zhì)粒pYL-hIFN-α-2B質(zhì)粒由美國IOWA大學(xué)YI LUO教授提供。含hB7-2cDNA的huB7-2(IgV+C)/pGEX-4T-3質(zhì)粒由西安醫(yī)科大學(xué)來寶長老師提供。
(三)主要儀器設(shè)備1.酶標(biāo)儀SUNRISE TECAN A-5082奧地利2.恒溫培養(yǎng)箱及臺(tái)式離心機(jī)3.低溫高速離心機(jī)BECKMAN J2-HS美國4.PCR儀PERKIN ELEMER GeneAmp PCR System 2400美國5.電轉(zhuǎn)儀Genepulser Electroprotocol，美國(四)主要試劑及溶液配制1.膠回收試劑盒E.Z.N.A Gel Extraction Kit2.純化試劑盒TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver 2.03.質(zhì)粒提取試劑盒E.Z.N.A Plasmid Midiprep Kit4.酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒ELISA for s-hCD86 DIACLONE公司5.培養(yǎng)基Middlebrook 7H9 Broth DIFCO公司美國Middlebrook 7H10 Agar DIFCO公司美國6.T4DNA Lingase、BamHI、XhoI、Taq酶、DNA Marker DL2000、DNA Marker DL15000均購自TaKaRa公司7.Tween-800442-500ml AMRESCO分裝8.牛血清白蛋白購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血研所科技公司二.方法(一)hB7-2(IgC+IgV)片段PCR反應(yīng)1.上游引物5’-gctcctctgaagattc-3’下游引物5’-agctgtaatccaaggaatg-3’，50μmol/l。
2.模板質(zhì)粒hB7-2(IgV+C)/pGEX-4T-3約100μg/ml，PCR反應(yīng)體系反應(yīng)總體積50μl，反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，57℃退火50秒，72℃延伸50秒，最后一次72℃延伸7分鐘，共30個(gè)循環(huán)。
(二)質(zhì)粒pYL-hB7-2的建立1.pYL-hIFN-α-2B質(zhì)粒與hB7-2(IgC+IgV)PCR產(chǎn)物用BamHI和XhoI酶37攝氏度過夜，電泳后E.Z.N.A膠回收試劑盒按說明回收DNA。
2.連接

16℃水浴中過夜連接，加入2.5μl的3M NaAC，加入62.5μl的冷無水乙醇，-20℃放置30～60分鐘，離心回收沉淀，用70％冷乙醇洗滌沉淀，真空干燥。25～50μl雙蒸消毒水溶解，取10～20μl即可轉(zhuǎn)化到100μl感受態(tài)大腸桿菌中。
(三)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化1.每管加入100μl感受態(tài)細(xì)菌，加入1μl pYL-hB7-2質(zhì)粒，充分混合，冰浴30分鐘。
2.將樣品置于42℃熱休克45秒，以增加表達(dá)載體轉(zhuǎn)化率。
3.再次冰浴5分鐘，每管加入0.9ml 42℃LB培養(yǎng)基，混勻。
4.在37℃水浴培養(yǎng)1小時(shí)30分鐘。
5.將200μl轉(zhuǎn)化后樣品接種到含30μg/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃孵育24～48小時(shí)。選擇陽性菌落。
(四)E.Coli-pYL-hB7-2單克隆菌落的擴(kuò)增、質(zhì)粒提取和純化1.單克隆菌落的擴(kuò)增。
挑取單克隆菌落，將其接種到10ml含有30μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，150rpm振蕩培養(yǎng)10小時(shí)。
2.E.Z.N.A Plasmid Midiprep Kit質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，按試劑盒說明提取質(zhì)粒，500μl高純水重懸DNA。水的體積依實(shí)驗(yàn)中DNA濃度而定。
(五)電泳、酶切及PCR鑒定pYL-hB7-2質(zhì)粒pYL-B7-2的PCR及測序引物上游-5’----ATCTTACCCATACGACGTCC----3’下游-5’-----GTTAACTACGTCGACATCG---3’1.PCR反應(yīng)體系反應(yīng)總體積50μl；PCR反應(yīng)體系反應(yīng)總體積50μl，反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，57℃退火50秒，72℃延伸50秒，最后一次72℃延伸7分鐘，共30個(gè)循環(huán)。1％瓊脂糖電泳，觀察結(jié)果位置正確。
2.測序?qū)⑸鲜鰳?gòu)建的pYL-B7-2質(zhì)粒擴(kuò)增后電泳，切膠純化回收。上述引物送TaKaRa公司進(jìn)行測序。
(六)卡介苗的電轉(zhuǎn)化1.取卡介苗菌液(600nm處OD值為0.5左右)50ml，冰浴1.5小時(shí)后4000rpm離心10分鐘。
2.棄上清，10％4℃預(yù)冷甘油20ml洗滌沉淀二次。
3.準(zhǔn)備將5-15μg質(zhì)粒DNA(溶于10-20μl液體)置于1.5ml管中。然后將100μl感受態(tài)卡介苗菌液倒入，使總體積不超過150μl，充分混合。加入到0.1cm的電轉(zhuǎn)杯中。
4.電轉(zhuǎn)條件電壓1.8KV，電容25μF，電阻100Ω，0.1cm電轉(zhuǎn)杯。
5.電轉(zhuǎn)后處理電轉(zhuǎn)后迅速將1ml不合卡那霉素的7H9培養(yǎng)基加入到電轉(zhuǎn)杯中。混勻后轉(zhuǎn)入7ml試管，180rpm振蕩培養(yǎng)5小時(shí)。取200ul上述培養(yǎng)液涂布到含30ug/ml卡那霉素的7H10固體培養(yǎng)皿上，封口膜嚴(yán)密封好培養(yǎng)皿，3～4周后選取陽性菌落。
(七)rBCG-hB7-2單克隆菌落的挑選、擴(kuò)增及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)模板的制備1.調(diào)取單個(gè)菌落接種到含有30μg/ml卡那霉素的10ml 7H9液體培養(yǎng)基中，150rpm，37℃振蕩培養(yǎng)。
2.當(dāng)600nm處OD值為1.0左右時(shí)，取1ml菌液，10000rpm離心10分鐘。
3.去上清，用雙蒸水洗滌沉淀三遍，離心去上清，在沉淀物中加入30μl雙蒸水，混勻，煮沸10分鐘。
4.10000rpm離心10分鐘后，取上清液2μl作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。
(八)rBCG-hB7-2陽性菌落的鑒定pYL-B7-2的PCR及測序引物上游-5’----ATCTTACCCATACGACGTCC----3’下游-5’-----GTTAACTACGTCGACATCG---3’1.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)反應(yīng)反應(yīng)總體積50μl；PCR反應(yīng)體系反應(yīng)總體積50μl，反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，57℃退火50秒，72℃延伸50秒，最后一次72℃延伸7分鐘，共30個(gè)循環(huán)。1％瓊脂糖電泳，觀察結(jié)果位置正確。
2.測序?qū)⑸鲜鯬CR產(chǎn)物電泳，切膠純化回收，測其含量后制作測序模板，送TaKaRa公司進(jìn)行測序。。
(九)rBCG-hB7-2表達(dá)產(chǎn)物的鑒定1.酶連免疫吸附法(ELISA)測定取出1ml上述經(jīng)鑒定的重組rBCG-hB7-2菌液，10000rpm離心10分鐘。取上清液作為分泌到細(xì)菌外表達(dá)hB7-2產(chǎn)物含量測定的樣品。將上述離心后菌液的沉淀用雙蒸水洗滌三遍，離心后在沉淀物中加入100ul雙蒸水，混勻后超聲破碎。破碎后10000rpm離心10分鐘，取其上清液作為細(xì)菌內(nèi)樣品，測定hB7-2含量。
ELISA測定方法取上述樣品100μl，加到已包被抗體的96孔板中，按試劑盒說明操作，490nm處測定。每號標(biāo)本取三份。每份樣品測兩孔。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品含量，取平均值作為最終結(jié)果。細(xì)菌內(nèi)外樣品含量分別為10.5和3.8U/ml。
2.淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)提取健康人外周血，用淋巴細(xì)胞分離液獲得淋巴細(xì)胞，用野生型卡介苗作為第一信號，以野生型卡介苗上清液為對照，上述rBCG-hB7-2上清液為實(shí)驗(yàn)組，與淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)72小時(shí)后進(jìn)行MTT法檢測，490nm處測量吸光度。淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)平均為3.5。
pYL-B72測序結(jié)果
atggctcctctgaagattcaagcttatttcaatgagactgcagacctgccatgccaatttgcaaactctcaaaaccaaagcctgagtgagctagtagtattttggcaggaccaggaaaacttggttctgaatgaggtatacttaggcaaagagaaatttgacagtgttcattccaagtatatgggccgcacaagttttgattcggacagttggaccctgagacttcacaatcttcagatcaaggacaagggcttgtatcaatgtatcatccatcacaaaaagcccacaggaatgattcgcatccaccagatgaattctgaactgtcagtgcttgctaacttcagtcaacctgaaatagtaccaatttctaatataacagaaaatgtgtacataaatttgacctgctcatctatacacggttacccagaacctaagaagatgagtgttttgctaagaaccaagaattcaactatcgagtatgatggtattatgcagaaatctcaagataatgtcacagaactgtacgacgtttccatcagcttgtctgtttcattccctgatgttacgagcaatatgaccatcttctgtattctggaaactgacaagacgcggcttttatcttcacctttctctatagagcttgaggaccctcagcctcccccagaccacattccttggattacagcttag
權(quán)利要求
1.一種重組人共刺激分子卡介苗菌株，其特征在于表達(dá)人共刺激分子B7-2的大腸桿菌-分支桿菌穿梭表達(dá)載體，在卡介苗中表達(dá)，得到具有分泌活性共刺激分子B7-2功能的重組卡介苗菌株rBCG-hB7-2。
2.一種重組人共刺激分子卡介苗菌株的制備方法，其特征在于重構(gòu)建大腸桿菌-分支桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒，用電穿孔法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化卡介苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于hB7-2(IgC+IgV)片段聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是采用上游引物5’-gctcctctgaagattc-3’、下游引物5’-agctgtaatccaaggaatg-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于質(zhì)粒pYL-hB7-2的建立為pYL-hIFN-α-2B質(zhì)粒與hB7-2(IgC+IgV)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物用BamH I和Xho I酶切后連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化是每管加入感受態(tài)細(xì)菌，加入pYL-hB7-2質(zhì)粒，混合后轉(zhuǎn)化，接種到卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，選擇陽性菌落。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于單克隆菌落的擴(kuò)增是挑取單克隆菌落，將其接種到卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于卡介苗的電轉(zhuǎn)化 取卡介苗菌液冰浴后離心、棄上清；預(yù)冷甘油洗滌沉淀二次；將質(zhì)粒DNA溶于液體，然后將感受態(tài)卡介苗菌液倒入，充分混合后電轉(zhuǎn)化，再涂布到含卡那霉素的7H10固體培養(yǎng)皿上，3～4周后選取卡那霉素陽性菌落。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于rBCG-hB7-2陽性菌落的挑選、擴(kuò)增及聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物測序正確，重組卡介苗表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)ELISA和淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組人共刺激分子卡介苗菌株及其制備方法，屬于基因工程技術(shù)，菌種保藏號CGMCC No.1120。本發(fā)明首先進(jìn)行hB7－2(IgC+IgV)片段聚合酶鏈反應(yīng)并建立質(zhì)粒pYL－h(huán)B7－2；經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，E.Coli－pYL－h(huán)B7－2單克隆菌落擴(kuò)增、質(zhì)粒提取和純化；電泳、酶切及PCR反應(yīng)鑒定pYL－h(huán)B7－2質(zhì)?？ń槊绲碾娹D(zhuǎn)化，rBCG－h(huán)B7－2單克隆菌落的挑選、擴(kuò)增、鑒定。本發(fā)明與野生型卡介苗相比，在達(dá)到同樣的甚至增加免疫效果的條件下，卡介苗用量降低，從而降低毒副作用；避免了直接使用細(xì)胞因子帶來的高額費(fèi)用和反復(fù)灌注的缺點(diǎn)；能在最為合適的時(shí)間和部位分泌細(xì)胞因子。一次接種可獲得強(qiáng)而持久的抗腫瘤免疫。本發(fā)明可望為膀胱腫瘤臨床治療提供一種新型制劑。
文檔編號C12N1/21GK1704472SQ20041001947
公開日2005年12月7日 申請日期2004年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月4日
發(fā)明者韓瑞發(fā), 王靖宇, 姚智, 劉春雨, 馬騰驤 申請人:天津市泌尿外科研究所, 韓瑞發(fā), 王靖宇, 姚智, 馬騰驤