專利名稱：一種檢測有機磷農(nóng)藥的化學(xué)發(fā)光方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)藥殘留分析領(lǐng)域和化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測有機
磷農(nóng)藥的化學(xué)發(fā)光方法。
背景技術(shù)：
有機磷農(nóng)藥是含有C-P鍵，或C-O-P，或C-S-P，或C-N-P鍵的有機化合物。1938 年德國發(fā)現(xiàn)有機磷有強大的殺蟲效果后，開始廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)。我國從1956年開始研制 生產(chǎn)有機磷農(nóng)藥，現(xiàn)已能生產(chǎn)出40多個品種以供應(yīng)國內(nèi)市場，已成為世界農(nóng)藥生產(chǎn)大國之 一。自1983年我國開始禁用了六六六和滴滴涕等有機氯農(nóng)藥后，有機磷農(nóng)藥成為我國使用 量最大的農(nóng)藥。目前，我國農(nóng)藥市場上的農(nóng)藥品種主要有有機磷農(nóng)藥、氨基甲酸酯類農(nóng)藥、 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥和生物農(nóng)藥。由于價格和使用習(xí)慣等各種因素，有機磷農(nóng)藥仍是主要的 農(nóng)藥品種。 由于有機磷農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致食品發(fā)生了不同程度的農(nóng)藥殘留污染。 有機磷農(nóng)藥對人的毒性屬于神經(jīng)毒，可經(jīng)過皮膚、呼吸道和腸胃道吸收中毒，特別
是脂溶性有機磷農(nóng)藥溶液經(jīng)皮膚吸收更快。主要作用是抑制體內(nèi)的膽堿酯酶，使在神經(jīng)連
接點為實現(xiàn)神經(jīng)傳遞而產(chǎn)生的乙酰膽堿不能水解為乙酰膽堿，從而造成因乙酰膽堿在體內(nèi)
大量堆積而引起乙酰膽堿中毒。引起人體神經(jīng)功能的紊亂，導(dǎo)致副交感、交感及神經(jīng)系統(tǒng)的
抑制及副交感節(jié)后神經(jīng)的興奮。此外，有機磷農(nóng)藥在生物體內(nèi)往往會氧化成比原來毒性大
的化合物。例如甲拌磷、乙拌磷等農(nóng)藥代謝為甲砜和乙砜，毒性比原體物更大。 目前為止，國內(nèi)外用于檢測有機磷農(nóng)藥殘留的方法主要有氣相色譜法、液相色譜
法、免疫分析法、酶抑制法、生物傳感器法等。 1、氣相色譜法因其高選擇性、高效能、高靈敏度、速度快、應(yīng)用廣、樣品用量少、能 同時分離分析多組分混合物、易于自動化等特點，在有機磷農(nóng)藥殘留量分析中的應(yīng)用最為 廣泛，方法成熟；但是對于沸點高或熱穩(wěn)定性差的農(nóng)藥不能直接進行分離檢測，需進行衍生 化處理。這樣就不可避免地增加了樣品前處理的難度，不利于農(nóng)藥檢測的靈活應(yīng)用和快速 掌握；同時GC在農(nóng)藥殘留分析中的通用性也比較差。 2、高效液相色譜法雖有高分離效能、高靈敏度等優(yōu)點。但與氣相色譜法一樣其設(shè) 備都比較大型、昂貴，成本較高。加之流動相多數(shù)是用有毒的溶劑，如乙腈、甲醇等，對實驗 室人員和環(huán)境也造成了一定的危害。而且高效液相色譜所需分析時間長，需要對樣品進行 前處理，樣品的前處理過程往往比較復(fù)雜，不利于快速檢測。 3、利用免疫分析法檢測有機磷農(nóng)藥的前提和關(guān)鍵是制備好特異性的抗體，有機磷 農(nóng)藥屬于小分子物質(zhì)，必須與大分子物質(zhì)(如蛋白質(zhì))聯(lián)結(jié)，才能用作免疫原。而免疫原的 制作復(fù)雜，不易得到，因此免疫分析法在測定有機磷農(nóng)藥應(yīng)用上具有一定的局限性。
4、利用生物傳感器測定有機磷農(nóng)藥雖然簡便、快速、靈敏，但是以乙酰膽堿酯酶對
同一類的有機磷農(nóng)藥具有同樣的抑制作用，因此這類傳感器選擇性不高。并且酶很不穩(wěn)定， 存在失活現(xiàn)象，有機磷農(nóng)藥對酶的抑制是不可逆的，酶電極不能重復(fù)使用，成本極高。酶抑制法靈敏度低， 一般只適用于定性和半定量檢測。 現(xiàn)有技術(shù)方法由于檢測靈敏度低和分析操作復(fù)雜性、儀器昂貴等不利因素受到很 大的限制，所以急需尋找一種能檢測有機磷農(nóng)藥的快速、簡便、靈敏度高、可靠、低成本的方法。 化學(xué)發(fā)光(Chemiluminescence，簡稱CL)，即化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化或氧 化劑的氧化后，形成一個激發(fā)態(tài)的中間體，當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時，同時發(fā) 射出光子，可以利用發(fā)光測量儀測量光量子產(chǎn)額。由于具有靈敏、簡便、快速、低成本等優(yōu) 點，近年來，化學(xué)發(fā)光分析法在農(nóng)藥殘留分析上的研究應(yīng)用備受關(guān)注?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測有機 磷農(nóng)藥是以發(fā)光物質(zhì)魯米諾(Luminol)、光澤精(Lucigenin)等與有機磷農(nóng)藥進行一些特 殊的化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)的中間體或反應(yīng)產(chǎn)物吸收了反應(yīng)所釋放出的化學(xué)能而躍到激發(fā)態(tài)，當(dāng) 重新回到基態(tài)時，放出光子，光子通過光電倍增管和放大器后，轉(zhuǎn)變?yōu)殡娏?，并被放大，在?定條件下，電流大小與有機磷農(nóng)藥的濃度成正比。 中國發(fā)明專利公開號1664567A的專利申請中公開了一種化學(xué)發(fā)光有機磷農(nóng)藥殘 留分析儀及其檢測方法。該檢測方法用過硫酸鉀在二氧化鈦納米粒子和紫外光催化下將蔬 菜或水果上有機磷農(nóng)藥殘留分解為磷酸鹽，磷酸鹽與鉬酸鹽和釩酸鹽形成磷鉬釩雜多酸， 氧化魯米諾溶液，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，根據(jù)化學(xué)發(fā)光強度進行定量，測得蔬菜或水果上有機磷農(nóng) 藥殘留的總量。但該專利存在以下缺陷專利宣稱的可用于對蔬菜或水果上有機磷農(nóng)藥殘 留總量的測定，但有機磷農(nóng)藥的種類繁多，該專利只是提供對敵百蟲、敵敵畏、氧樂果的化 學(xué)發(fā)光檢測，并不能確定是否一定可以檢測其他化學(xué)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)不同的有機磷農(nóng)藥，因此不 能以偏概全的認為可以檢測殘留總量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點和不足，提供一種檢測有機磷農(nóng)藥的 化學(xué)發(fā)光方法。 本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的 首次采用NaCl作為體系的增敏劑，選取含有.〉f—。R基團的有機磷農(nóng)藥為研究對 象，提供一種對結(jié)構(gòu)相似的有機磷農(nóng)藥通用的化學(xué)發(fā)光檢測方法。 首先通過大量實驗，對辛硫磷、毒死蜱、殺螟硫磷在不同的化學(xué)發(fā)光體系中的發(fā)光 信號進行篩選，以選擇最佳的化學(xué)發(fā)光體系；在確定最佳反應(yīng)體系魯米諾_過氧化氫體系 后，基于辛硫磷、毒死蜱、殺螟硫磷在體系中的增敏信號較微弱，為了增加反應(yīng)的靈敏度，實
驗中考察五種無機鹽離子(KBr、 NaBr、 NaCl、 KI、 KC1)和六種表面活性劑[三種非離子型 表面活性劑吐溫-80、聚乙二醇-400、 Triton X-IOO， 一種陽離子型表面活性劑溴代十六烷 基三甲基胺(CTMAB)，兩種陰離子表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)、十二烷基硫酸鈉 (SDS)]對體系的增敏強弱，最終確定NaCl為最佳的增敏劑；通過單因素和正交實驗比較 了 luminol濃度、HA濃度、NaCl濃度和pH對辛硫磷、毒死蜱、殺螟硫磷化學(xué)發(fā)光強度的影 響，在優(yōu)化工藝下測定線性范圍，做干擾實驗驗證方法的選擇性，同時對樣品進行分析并做 回收率實驗。此外從體系的動力學(xué)曲線、熒光光譜分析、紫外光譜分析及化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的 實驗事實四個方面對化學(xué)發(fā)光機理進行初步探索，并提出辛硫磷、毒死蜱、殺螟硫磷與魯米諾_過氧化氫反應(yīng)的可能機理。同時，提出農(nóng)藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)與化學(xué)發(fā)光之間的關(guān)系。
具體地說，本發(fā)明包括下列步驟
①化學(xué)發(fā)光體系的選擇考察了有機磷農(nóng)藥在三種化學(xué)發(fā)光體系KMn04體系、魯米諾_KMn04體系和魯米諾_H202體系中的化學(xué)發(fā)光行為，確定最佳的化學(xué)發(fā)光體系為魯米諾_H202體系；
②增敏劑的選擇考察在增敏劑KBr、 NaBr、 NaCl 、 KI 、 KC1 、吐溫-80、聚乙二醇-400、 Triton X-100、CTMAB、 SDBS和SDS存在下，有機磷農(nóng)藥在魯米諾_H202體系中化學(xué)發(fā)光信號的強度，確定NaCl為最佳的增敏劑；
③單因素實驗和正交實驗 通過單因素和正交實驗比較確定體系的最佳反應(yīng)條件 魯米諾濃度為1 X 10—5mol/L 1 X 10—3mol/L， H202濃度為0. 05mol/L 0. 5mol/L， NaCl濃度為0. 5mol/L 5mol/L， pH為ll 13.5; 干擾實驗 在步驟③所確定的條件下對實際樣品中可能存在的離子或化合物進行干擾實驗； ⑤標準曲線的繪制 在步驟③所確定的條件下繪制標準曲線，以有機磷農(nóng)藥的濃度為橫坐標，以有機磷農(nóng)藥在體系中的化學(xué)發(fā)光強度為縱坐標繪制曲線，化學(xué)發(fā)光強度與農(nóng)藥在濃度1X10—8g/mL IX 10—6g/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；
⑥樣品分析 等量稱取樣品兩份于250mL的燒杯中，其中一份加蒸餾水浸泡1小時并洗滌，取洗滌液作為樣品a ;將配置的一定濃度的有機磷農(nóng)藥噴灑到另一份樣品上，放置2小時后用蒸餾水洗滌，取洗滌液作為樣品b，測定樣品a和樣品b ;
⑦化學(xué)發(fā)光機理的探討 采用RF-5301PC型熒光分光光度計和UV-1700紫外可見分光光度計分別測定體系的熒光光譜和紫外光譜，加之體系的動力學(xué)曲線和反應(yīng)的實驗事實四個方面對化學(xué)發(fā)光機理進行初步探索，提出有機磷農(nóng)藥與魯米諾_H202反應(yīng)的可能機理；
⑧農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)與化學(xué)發(fā)光之間的關(guān)系 對辛硫磷、毒死蜱、殺螟硫磷、倍硫磷、敵敵畏、磷胺、對硫磷、久效磷、三唑磷、甲基對硫磷、馬拉硫磷等有機磷農(nóng)藥的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的研究，探討含有
>|—。R 〉i-SK基團的有機磷農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)與化學(xué)發(fā)光之間的關(guān)系。 本發(fā)明具有下列優(yōu)點和積極效果 1、操作簡單、快速，線性范圍寬，成本低； 2、首次提出了以無機鹽NaCl作為體系的增敏劑，增加了體系的靈敏度。 3、適用于對具有相似結(jié)構(gòu)的有機磷農(nóng)藥殘留的檢測。


圖1是魯米諾濃度與有機磷農(nóng)藥化學(xué)發(fā)光強度A I之間的關(guān)系圖； 圖2是H202濃度與有機磷農(nóng)藥化學(xué)發(fā)光強度A I之間的關(guān)系圖； 圖3是NaCl濃度與有機磷農(nóng)藥化學(xué)發(fā)光強度A I之間的關(guān)系圖； 圖4是pH與有機磷農(nóng)藥化學(xué)發(fā)光強度A I之間的關(guān)系圖； 圖5是辛硫磷標準色譜圖； 圖6是樣品小白菜空白色譜圖； 圖7是樣品小白菜回收率色譜圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例詳細說明 一、實驗試劑
在下面的實施例中如果沒有特別說明，試驗所用的試劑均來自下面注明的信息和
廠商

制

廠















魯米諾 辛硫磷標準f
高錳酸鉀 過氧化氫 氯化鈉
分析純 實驗試
分析純 分析純 分析純
溴化鈉 分析純
碘化鉀 分析純
氯化鉀 分析純
溴化鉀 分析純
硫酸鈷 分析純
硫酸鉀 分析純
硫酸銅 分析純
硝酸鉀 分析純
磷酸三鈉 分析純
十二烷基苯磺酸鈉 化學(xué)純
吐溫-80 分析純
十六烷基三甲基溴化銨 分析純
聚乙二醇-400 分析純
十二烷基硫酸鈉 分析純
Triton X-100 分析純 二、實驗過程
為了驗證本發(fā)明，采用本方法與氣相色譜法對
sigma公司
劑農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所研
武漢市江北化學(xué)試劑廠 天津市博迪化工有限公司 焦作鑫安科技股份有限公司試劑
天津市光復(fù)精細化工研究所
國藥集團化學(xué)試劑有限公司
國藥集團化學(xué)試劑有限公司
廣州化學(xué)試劑廠
湖南湘中化學(xué)試劑采供站
上海科昌精細化學(xué)品公司
上海綠源精細化工廠
上海科昌精細化學(xué)品公司
天津市博迪化工有限公司
上?；瘜W(xué)試劑分裝廠
Amresco公司
武漢亞法生物技術(shù)有限公司
廣東西隴化工廠
廣東順德化學(xué)生物研究所
sigma公司
蔬菜中有機磷農(nóng)藥殘留的含量進行了對比檢測。 1、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)條件的確定 如圖1、2、3、4，初步實驗表明辛硫磷在堿性魯米諾_H202體系中能產(chǎn)生微弱的 化學(xué)發(fā)光信號。為提高反應(yīng)的靈敏度，考察了三種非離子型表面活性劑Triton X-IOO、 Tween-80、 PEG-400,—種陽離子型表面活性劑CTMAB，兩種陰離子表面活性劑SDBS、 SDS和 無機鹽KBr、NaBr、NaCl、KI、KC1等對反應(yīng)發(fā)光強度的增強效果。通過研究發(fā)現(xiàn)，考察的11種 增敏劑中，當(dāng)NaCl作為增敏劑時，背景信號最小，發(fā)光強度最大，綜合考慮，最終選擇NaCl 作為體系的增敏劑。通過單因素和正交實驗比較魯米諾濃度(1 X 10—6mol/L 1 X 10—3mol/ L) 、!1202濃度(0. 05mol/L 0. 5mol/L) 、NaCl濃度(0. 5mol/L 5mol/L)和pH(pH11 13. 5) 對辛硫磷化學(xué)發(fā)光強度的影響，實驗最終確定反應(yīng)的最佳條件為魯米諾濃度5X 10—4mol/ L、 NaCl濃度4mol/L、 H202濃度0. 3mol/L、 pH13。
2、干擾實驗 按照本發(fā)明檢測方法，實驗了樣品中可能有的共存物對實驗的影響。在優(yōu)化條件 下，對于濃度為5X10—7g/mL的辛硫磷標準溶液，在相對誤差不超過水平為5%的情況，可 允許下列共存物的存在1000倍的C1—、 K+不干擾測定；500倍的Na+不干擾測定；100倍的 5042—、N03—不干擾測定；10倍的A13+、C032—、P043—不干擾測定；5倍的Pb2+不干擾測定；0. 1倍 的Mg2+不干擾測定；0. 001倍的Cu2+、 Co2+不干擾測定。
3、標準曲線的繪制 在選定的最佳條件下，辛硫磷在1 X 10—8g/mL 1 X 10—6g/mL的濃度范圍內(nèi)與發(fā) 光強度呈線性關(guān)系，其回歸方程為y = 1214. 3x+95232，相關(guān)系數(shù)R為0.9959。對濃度為 5X 10—7g/mL的辛硫磷連續(xù)進行11次平行測定的相對標準偏差為4. 2% 。根據(jù)IUPAC建議， 計算得該方法檢出限為5. 4X 10—9g/mL。
4、樣品的制備及分析 (1)稱取10. 0g的小白菜樣品于250mL的燒杯中，用lOOmL蒸餾水洗滌并浸泡1小 時，取洗滌液作為樣品a;將洗滌后的lOg小白菜晾干，噴灑一定量已知濃度的辛硫磷，放置 2小時后用lOOmL蒸餾水洗滌，取洗滌液作為樣品b ;取適量樣品a和樣品b定容，按實驗方 法做化學(xué)發(fā)光測定，即做樣品實驗和回收率實驗。 (2)取剩余的樣品a和樣品b各25mL，分別置于150mL分液漏斗中，加入等體積的
二氯甲烷萃取，棄去水層，將二氯甲烷層經(jīng)活性炭脫色和無水硫酸鈉干燥后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮
近干，以二氯甲烷定容至2mL，按下述色譜條件做GC分析(對照實驗)。 由圖5、6、7可知，辛硫磷標準品的保留時間為6. 152min，氣相色譜法測定小白菜
空白樣品中不含農(nóng)藥辛硫磷，而回收率樣品辛硫磷組分的保留時間與辛硫磷標準品的保留
時間吻合。 兩種方法的測定結(jié)果見表1。
表1小白菜中辛硫磷含量測定結(jié)果分析方法 化學(xué)發(fā)光法 氣相色譜法
辛硫磷含量(l^g/g)未檢出未檢出
加入量Og/g)0. 01 0.11.00. 01 0. 11.0
測出量(Pg/g)0.0106 0.1010. 860. 0085 0. 0890. 93
回收率(％)106 皿8685 8993
相對標準偏差RSD，4. 2 2. 23. 05. 6 4. 86.8
n=7(%) 表1反映出兩種方法所測樣品和回收率實驗結(jié)果基本一致。 由此驗證了化學(xué)發(fā)光新方法的可信性。 附氣相色譜條件 Agilent 6890N氣相色譜儀附火焰光度(FPD)檢測器； DB-1701彈性石英毛細柱(30mX0. 53mmXl. Oil m); 柱溫(程序升溫)200。C (5min)_￡QZmin_+ 250°C (10 min); 進樣口溫度220。C; 檢測室溫度25(TC ; N2 :5mL/min ; H2 :75mL/min ; 空氣100mL/min ; 無分流進樣，進樣量為1 y L，峰面積外標法定量。
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權(quán)利要求
一種檢測有機磷農(nóng)藥的化學(xué)發(fā)光方法，其特征在于包括下列步驟①化學(xué)發(fā)光體系的選擇確定最佳的化學(xué)發(fā)光體系為魯米諾-H2O2體系；②增敏劑的選擇確定NaCl為最佳的增敏劑；③單因素實驗和正交實驗通過單因素和正交實驗比較確定體系的最佳反應(yīng)條件魯米諾濃度為1×10-5mol/L～1×10-3mol/L，H2O2濃度為0.05mol/L～0.5mol/L，NaCl濃度為0.5mol/L～5mol/L，pH為11～13.5；④干擾實驗在步驟③所確定的條件下對實際樣品中可能存在的離子或化合物進行干擾實驗；⑤標準曲線的繪制以有機磷農(nóng)藥的濃度為橫坐標，以有機磷農(nóng)藥在體系中的化學(xué)發(fā)光強度為縱坐標繪制曲線，化學(xué)發(fā)光強度與農(nóng)藥在濃度1×10-8g/mL～1×10-6g/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；⑥樣品分析等量稱取樣品兩份于250mL的燒杯中，其中一份加蒸餾水浸泡1小時并洗滌，取洗滌液作為樣品a；將配置的一定濃度的有機磷農(nóng)藥噴灑到另一份樣品上，放置2小時后用蒸餾水洗滌，取洗滌液作為樣品b，測定樣品a和樣品b；⑦化學(xué)發(fā)光機理的探討采用RF-5301PC型熒光分光光度計和UV-1700紫外可見分光光度計分別測定體系的熒光光譜和紫外光譜，加之體系的動力學(xué)曲線和反應(yīng)的實驗事實四個方面對化學(xué)發(fā)光機理進行初步探索，提出有機磷農(nóng)藥與魯米諾-H2O2反應(yīng)的可能機理；⑧農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)與化學(xué)發(fā)光之間的關(guān)系對辛硫磷、毒死蜱、殺螟硫磷、倍硫磷、敵敵畏、磷胺、對硫磷、久效磷、三唑磷、甲基對硫磷、馬拉硫磷等有機磷農(nóng)藥的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的研究，探討含有基團的有機磷農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)與化學(xué)發(fā)光之間的關(guān)系。F2009100626442C0000021.tif
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測有機磷農(nóng)藥的化學(xué)發(fā)光方法，屬于農(nóng)藥殘留分析領(lǐng)域和化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括下列步驟①化學(xué)發(fā)光體系的選擇；②增敏劑的選擇；③單因素實驗和正交實驗；④干擾實驗；⑤標準曲線的繪制；⑥樣品分析；⑦化學(xué)發(fā)光機理的探討；⑧農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)與化學(xué)發(fā)光之間的關(guān)系。本發(fā)明操作簡單、快速，線性范圍寬，成本低；首次提出了以無機鹽NaCl作為體系的增敏劑，增加了體系的靈敏度；適用于對具有相似結(jié)構(gòu)的有機磷農(nóng)藥殘留的檢測。
文檔編號C07F9/18GK101706431SQ20091006264
公開日2010年5月12日 申請日期2009年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月9日
發(fā)明者任紅敏, 劉曉宇, 李愛芳, 胡浩宇, 邱朝坤, 陳翊平 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)