本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及了一種人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
：人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derivedstemcells，adscs)是目前廣泛應(yīng)用于組織工程及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一種成體干細(xì)胞，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一樣具有多向分化潛能，具有治療疾病、使器官再生、甚至延年益壽的潛力。如何保證脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代，是研發(fā)脂肪干細(xì)胞各項(xiàng)功能的前提。細(xì)胞培養(yǎng)基是培養(yǎng)細(xì)胞中供給細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促使細(xì)胞生殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的生存環(huán)境。細(xì)胞培養(yǎng)基分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時(shí)需添加血清。無(wú)血清培養(yǎng)基，就是自細(xì)胞環(huán)境中不添加血清，但是在某些應(yīng)用中需要添加生長(zhǎng)因子或血清替代品，即血清的主要成分：粘附因子、生長(zhǎng)因子、必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和激素等。無(wú)血清培養(yǎng)基能減少血清帶來的不利因素，使細(xì)胞培養(yǎng)的條件更穩(wěn)定。因此，無(wú)血清培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)成為當(dāng)今細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的一大趨勢(shì)。無(wú)血清培養(yǎng)基的市場(chǎng)巨大、潛力無(wú)限，但是由于國(guó)產(chǎn)品質(zhì)量和信譽(yù)問題，使得多年來國(guó)內(nèi)一直購(gòu)買進(jìn)口的無(wú)血清培養(yǎng)基，如何能夠打破這種局面，占有市場(chǎng)，是急需解決的一大問題。中國(guó)專利，申請(qǐng)公告號(hào)cn102732477a，公開了一種人脂肪干細(xì)胞無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基，由高糖型dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基、人血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛磺酸、還原型谷胱甘肽、銅藍(lán)蛋白、l-抗壞血酸-2-硫酸酯、α-生育酚琥珀酸單酯、亞油酸、α-酮戊二酸和硒組成；該無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基因能免除常規(guī)含血清培養(yǎng)基中動(dòng)物血清給人體健康帶來的潛在威脅，其培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞更適于臨床應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：基于
背景技術(shù)：
存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提出了一種人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，避免了血清對(duì)細(xì)胞的毒性作用和血清源性污染，有利于體外培養(yǎng)人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，保持干細(xì)胞的特性。一種人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，包括ultraculture無(wú)血清培養(yǎng)基、l-谷氨酰胺、bfgf、血清替代品、抗生素。優(yōu)選的，所述血清替代品為ultroserg。優(yōu)選的，所述抗生素包括青霉素和鏈霉素。優(yōu)選的，所述青霉素的濃度為0.01-0.05mg/ml，所述鏈霉素的濃度為0.05-0.15mg/ml。優(yōu)選的，所述l-谷氨酰胺的濃度為0.01-0.03mol/l。優(yōu)選的，所述bfgf的濃度為0.005-0.009ng/ml。優(yōu)選的，所述ultroserg與ultraculture無(wú)血清培養(yǎng)基的體積比為(1-5)∶50。一種人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基可應(yīng)用于培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。ultraculture通用型無(wú)血清培養(yǎng)基中，蛋白的含量為3mg/ml，不含l-谷氨酰胺。bfgf為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，是一種促細(xì)胞分裂的肝素結(jié)合蛋白，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞的增殖與分化，能延長(zhǎng)培養(yǎng)液中多種中樞和外周神經(jīng)元的存活。ultroserg可作為血清替代品，包含生物細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的物質(zhì)，包括生長(zhǎng)因子、粘附因子、荷爾蒙、結(jié)合蛋白、維生素、微量礦物元素等，它的生物活性是血清的5倍。ultroserg組分的一致性，批次的穩(wěn)定性，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性提高。ultroserg一般做成凍干粉的形式，具有較長(zhǎng)的保質(zhì)期，可以批量采購(gòu)，降低成本。該血清替代品兼容市場(chǎng)主流細(xì)胞培養(yǎng)基，同時(shí)提高細(xì)胞培養(yǎng)品質(zhì)。無(wú)血清培養(yǎng)基中l(wèi)-谷氨酰胺是細(xì)胞生長(zhǎng)的必須氨基酸，為培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞提供重要的能量來源，脫掉氨基后，l-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。l-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)降解，降解率隨保存溫度而變，l-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性，所以l-谷氨酰胺的量要控制在最適的濃度。添加青霉素和鏈霉素可以防止樣本在采集的過程中污染以及運(yùn)輸過程中細(xì)菌的滋生。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果在于：本發(fā)明提出的一種人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，無(wú)血清培養(yǎng)基中加入能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的成分和含量都可以確定和控制，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性；無(wú)血清培養(yǎng)基中還添加了添加青霉素和鏈霉素，防止樣本在采集的過程中污染以及運(yùn)輸過程中細(xì)菌的滋生。本發(fā)明提出的無(wú)血清培養(yǎng)基，避免了血清對(duì)細(xì)胞的毒性作用和血清源性污染，有利于體外培養(yǎng)人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，保持干細(xì)胞的特性。附圖說明圖1為市售無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的掃描電鏡圖；圖2為實(shí)施例3所得的無(wú)血清基培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的掃描電鏡圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步解說。實(shí)施例1一種人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，選用ultraculture無(wú)血清培養(yǎng)基500ml、ultroserg為30ml，然后按照如下終濃度要求稱量各組分：l-谷氨酰胺的濃度為0.01mol/l；青霉素的濃度為0.02mg/ml；鏈霉素的濃度為0.15mg/ml；bfgf的濃度為0.009ng/ml。一種人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基的制備方法：在無(wú)菌安全柜內(nèi)，將ultroserg溶于ultraculture無(wú)血清培養(yǎng)基中；然后依次加入l-谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素；待溶液混合均勻后加入bfgf；最后用0.22um濾器過濾備用。實(shí)施例2一種人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，選用ultraculture無(wú)血清培養(yǎng)基500ml、ultroserg為20ml，然后按照如下終濃度要求稱量各組分：l-谷氨酰胺的濃度為0.03mol/l；青霉素的濃度為0.01mg/ml；鏈霉素的濃度為0.05mg/ml；bfgf的濃度為0.007ng/ml。制備方法同實(shí)施例1。實(shí)施例3一種人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，選用ultraculture無(wú)血清培養(yǎng)基500ml、ultroserg為10ml，然后按照如下終濃度要求稱量各組分：l-谷氨酰胺的濃度為0.02mol/l；青霉素的濃度為0.03mg/ml；鏈霉素的濃度為0.10mg/ml；bfgf的濃度為0.008ng/ml。制備方法同實(shí)施例1。實(shí)施例4一種人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，選用ultraculture無(wú)血清培養(yǎng)基500ml、ultroserg為50ml，然后按照如下終濃度要求稱量各組分：l-谷氨酰胺的濃度為0.01mol/l；青霉素的濃度為0.05mg/ml；鏈霉素的濃度為0.08mg/ml；bfgf的濃度為0.005ng/ml。制備方法同實(shí)施例1。實(shí)施例5一種人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基，選用ultraculture無(wú)血清培養(yǎng)基500ml、ultroserg為40ml，然后按照如下終濃度要求稱量各組分：l-谷氨酰胺的濃度為0.03mol/l；青霉素的濃度為0.04mg/ml；鏈霉素的濃度為0.13mg/ml；bfgf的濃度為0.006ng/ml。制備方法同實(shí)施例1。一、細(xì)胞增殖能力測(cè)試實(shí)驗(yàn)方法：用cellcountingkit(cck-8)試劑盒比較實(shí)施例1-5培養(yǎng)基培養(yǎng)后的細(xì)胞增殖能力；1)在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100ul/孔)，向培養(yǎng)板中加入不同配方培養(yǎng)基，放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h(37℃，5％co2)；2)向每孔加入10ulcck-8溶液；3)將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3小時(shí)；4)用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：表一吸光值結(jié)果組別對(duì)照組實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3實(shí)施例4實(shí)施例5吸光值0.5260.7030.7120.7210.7320.709注：對(duì)照組為市售無(wú)血清培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：實(shí)施例1-5的吸光度值均高于對(duì)照組，吸光度值越高，細(xì)胞濃度越大，說明使用該本發(fā)明中的無(wú)血清完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，能夠使細(xì)胞具備較強(qiáng)的增殖能力。二、掃描電鏡結(jié)果分析根據(jù)圖1和2可得到以下結(jié)論：本發(fā)明所制得的無(wú)血清完全培養(yǎng)基與市售無(wú)血清培養(yǎng)基相比，更利于體外培養(yǎng)人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，其細(xì)胞數(shù)量較多且生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)良。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12