本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高小鼠克隆胚胎發(fā)育率的體外培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

克隆胚胎屬于克隆的一種方法，最常用的就是體細(xì)胞克隆技術(shù)，是指采用核移植的方法，利用細(xì)胞拆合或者細(xì)胞重組技術(shù)，將卵母細(xì)胞去核作為核受體，以體細(xì)胞或者含少量細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞核質(zhì)體作為核供體，將核供體移入核受體中構(gòu)建重組胚胎，然后核供體在去核卵母細(xì)胞的包質(zhì)中被重新編程、發(fā)育的過(guò)程。體細(xì)胞克隆技術(shù)在生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有許多成功案例，對(duì)于研究動(dòng)物胚胎發(fā)育、研究胚胎發(fā)育機(jī)理、藥物治療作用、克隆動(dòng)物等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

小鼠作為醫(yī)學(xué)試驗(yàn)的常用作用對(duì)象，是各種藥物試驗(yàn)的基礎(chǔ)，小鼠克隆胚胎的體外培養(yǎng)發(fā)育是常用的手段之一。然而體外培養(yǎng)環(huán)境對(duì)胚胎發(fā)育有重要的影響，培養(yǎng)溫度、濕度、營(yíng)養(yǎng)液中的化學(xué)物質(zhì)等的變化都將影響胚胎的發(fā)育效果和發(fā)育率，例如培養(yǎng)液中血清能改變與基因組印跡相關(guān)的遺傳信息。

因此，我們有必要研發(fā)一種新的培養(yǎng)方法，以減少培養(yǎng)環(huán)境對(duì)胚胎細(xì)胞發(fā)育分化的影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供的一種提高小鼠克隆胚胎發(fā)育率的體外培養(yǎng)方法，減少了培養(yǎng)環(huán)境對(duì)胚胎細(xì)胞發(fā)育分化的影響。

本發(fā)明提供的一種提高小鼠克隆胚胎發(fā)育率的體外培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

步驟1，將重組好的胚胎細(xì)胞經(jīng)激活液激活2-3h后，置于初級(jí)培養(yǎng)液中培養(yǎng)至胚胎細(xì)胞發(fā)育到二細(xì)胞期；

每升所述激活液中含有265-270mg的cacl2、0.1mg的feno3、400mg的kcl、95-100mg的mgso4·7h2o、5-6g的nacl、100mg的nah2po4、1.5g葡萄糖，余量為四蒸水；

所述初級(jí)培養(yǎng)液制備方法是向dmem培養(yǎng)液中添加乳酸，其中乳酸與dmem培養(yǎng)液的質(zhì)量比例為1～2:1000；

步驟2，將發(fā)育到二細(xì)胞期的胚胎交替置于第一后期培養(yǎng)液和第二后期培養(yǎng)液中培養(yǎng)，直至克隆胚胎發(fā)育至囊胚；

所述第一后期培養(yǎng)液為ksom培養(yǎng)液，第二后期培養(yǎng)液是不含谷氨酰胺、乙二胺四乙酸二鈉和牛血清蛋白的m16培養(yǎng)液。

優(yōu)選的，上述體外培養(yǎng)方法中，每升所述激活液中含有265mg的cacl2、0.1mg的feno3、400mg的kcl、98mg的mgso4·7h2o、5g的nacl、100mg的nah2po4、1.5g葡萄糖，余量為四蒸水。

優(yōu)選的，上述體外培養(yǎng)方法中所述初級(jí)培養(yǎng)液制備方法是向dmem培養(yǎng)液中添加乳酸，其中乳酸與dmem培養(yǎng)液的質(zhì)量比例為2:1000。

優(yōu)選的，上述體外培養(yǎng)方法中將發(fā)育到二細(xì)胞期的胚胎交替置于第一后期培養(yǎng)液和第二后期培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，每次第一后期培養(yǎng)液的培養(yǎng)時(shí)間為24-26h，每次第二后期培養(yǎng)液的培養(yǎng)時(shí)間為2-3h。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的一種提高小鼠克隆胚胎發(fā)育率的體外培養(yǎng)方法具有以下有益效果：

(1)重組胚胎的不同發(fā)育階段采用不同的培養(yǎng)液，并在二細(xì)胞期以后采用ksom培養(yǎng)液，不含谷氨酰胺、乙二胺四乙酸二鈉和牛血清蛋白的m16培養(yǎng)液交交替更換培養(yǎng)的方式，使胚胎收到牛血清蛋白的間隔性刺激，提高胚胎發(fā)育效率，促進(jìn)克隆胚胎的體外發(fā)育，成功率高，有利于進(jìn)行其他相關(guān)試驗(yàn)，節(jié)約時(shí)間成本和人力成本。

(2)本發(fā)明激活階段選用的培養(yǎng)液成分簡(jiǎn)單，成本低，激活最長(zhǎng)時(shí)間只需要3h。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明的限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件操作，所用試劑均為市售，由于不涉及發(fā)明點(diǎn)，故不對(duì)其步驟進(jìn)行詳細(xì)描述。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說(shuō)明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

我們以8-12周齡的icr雌鼠提供受精卵，8-12周齡的c57bl/6雌鼠來(lái)提供卵母細(xì)胞，上述icr雌鼠和c57bl/6小鼠均購(gòu)自南京君科生物工程有限公司，實(shí)驗(yàn)小鼠的飼養(yǎng)按照常規(guī)方式進(jìn)行。

參考公告號(hào)為101798567b、名稱(chēng)為《一種改進(jìn)的促進(jìn)小鼠克隆胚胎發(fā)育的培養(yǎng)方法》專(zhuān)利中述及的方法制備重組的胚胎細(xì)胞，采用一步法進(jìn)行體細(xì)胞核移植操作，制備重組的胚胎細(xì)胞，包括：

8-12周齡icr雌鼠腹腔注射孕馬血清促性腺激素10單位，48小時(shí)候腹腔注射人絨毛膜促性腺激素10單位，注射15小時(shí)后，斷頸處死小鼠，取下輸卵管，提取卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體，用300u/ml的透明質(zhì)酸酶消化卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體，分離顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞。

然后利用本發(fā)明的方法使胚胎體外發(fā)育，其中胚胎體外發(fā)育的方法包括以下實(shí)施例。

實(shí)施例1

一種提高小鼠克隆胚胎發(fā)育率的體外培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

步驟1，將重組好的胚胎細(xì)胞經(jīng)激活液激活2h后，置于初級(jí)培養(yǎng)液中培養(yǎng)至胚胎細(xì)胞發(fā)育到二細(xì)胞期；

每升所述激活液中含有265mg的cacl2、0.1mg的feno3、400mg的kcl、98mg的mgso4·7h2o、5g的nacl、100mg的nah2po4、1.5g葡萄糖，余量為四蒸水；

所述初級(jí)培養(yǎng)液制備方法是向dmem培養(yǎng)液中添加乳酸，其中乳酸與dmem培養(yǎng)液的質(zhì)量比例為2:1000；

步驟2，將發(fā)育到二細(xì)胞期的胚胎交替置于第一后期培養(yǎng)液和第二后期培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每次第一后期培養(yǎng)液的培養(yǎng)時(shí)間為24h，每次第二后期培養(yǎng)液的培養(yǎng)時(shí)間為2h(第一后期培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后更換第二后期培養(yǎng)液，2h后再更換第一后期培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后再次更換為第一后期培養(yǎng)液……)，直至克隆胚胎發(fā)育至囊胚；

所述第一后期培養(yǎng)液ksom培養(yǎng)液，第二后期培養(yǎng)液是不含谷氨酰胺、乙二胺四乙酸二鈉和牛血清蛋白的m16培養(yǎng)液。

實(shí)施例2

一種提高小鼠克隆胚胎發(fā)育率的體外培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

步驟1，將重組好的胚胎細(xì)胞經(jīng)激活液激活3h后，置于初級(jí)培養(yǎng)液中培養(yǎng)至胚胎細(xì)胞發(fā)育到二細(xì)胞期；

每升所述激活液中含有270mg的cacl2、0.1mg的feno3、400mg的kcl、95mg的mgso4·7h2o、6g的nacl、100mg的nah2po4、1.5g葡萄糖，余量為四蒸水；

所述初級(jí)培養(yǎng)液制備方法是向dmem培養(yǎng)液中添加乳酸，其中乳酸與dmem培養(yǎng)液的質(zhì)量比例為1:1000；

步驟2，將發(fā)育到二細(xì)胞期的胚胎交替置于第一后期培養(yǎng)液和第二后期培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每次第一后期培養(yǎng)液的培養(yǎng)時(shí)間為26h，每次第二后期培養(yǎng)液的培養(yǎng)時(shí)間3h(第一后期培養(yǎng)液培養(yǎng)26h后更換第二后期培養(yǎng)液，3h后再更換第一后期培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)26h后再次更換為第一后期培養(yǎng)液……)，直至克隆胚胎發(fā)育至囊胚；

所述第一后期培養(yǎng)液ksom培養(yǎng)液，第二后期培養(yǎng)液是不含谷氨酰胺、乙二胺四乙酸二鈉和牛血清蛋白的m16培養(yǎng)液。

我們將重組的胚胎細(xì)胞置于不同培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)方法均同實(shí)施例1，只是不同階段采用的培養(yǎng)液不同，設(shè)計(jì)以下幾組試驗(yàn)：

試驗(yàn)一組：采用實(shí)施例1的方法和培養(yǎng)液進(jìn)行胚胎發(fā)育培養(yǎng)；

試驗(yàn)二組：激活液、初級(jí)培養(yǎng)液、第一后期培養(yǎng)液和第二后期培養(yǎng)液均是czb培養(yǎng)液，胚胎后期發(fā)育過(guò)程中不存在培養(yǎng)液交替使用的操作；

試驗(yàn)三組：激活液、初級(jí)培養(yǎng)液、第一后期培養(yǎng)液和第二后期培養(yǎng)液均是ksom培養(yǎng)液，胚胎后期發(fā)育過(guò)程中不存在培養(yǎng)液交替使用的操作；

試驗(yàn)四組：激活液采用的是czb培養(yǎng)液，初級(jí)培養(yǎng)液采用的是m16培養(yǎng)液，第一后期培養(yǎng)液和第二后期培養(yǎng)液均是ksom培養(yǎng)液，胚胎后期發(fā)育過(guò)程中不存在培養(yǎng)液交替使用的操作；

分別按照上述四組方法進(jìn)行小鼠克隆胚胎發(fā)育培養(yǎng)，直至得到囊胚，觀(guān)察記錄體外發(fā)育率。結(jié)果如表1所示。由表1的結(jié)果可知，四種培養(yǎng)方法中，二細(xì)胞胚胎數(shù)量差距不大，但是四細(xì)胞胚胎數(shù)中，試驗(yàn)二、三、四組的數(shù)量分別低于試驗(yàn)一組25％、24％和16％，最終的囊胚數(shù)仍是試驗(yàn)一組最高，其次為實(shí)驗(yàn)四組，說(shuō)明本發(fā)明的體外方法通過(guò)培養(yǎng)液的交替使用可以顯著提高小鼠克隆提高小鼠克隆胚胎發(fā)育率。

表1克隆胚胎在不同培養(yǎng)方法中的體外發(fā)育率

需要說(shuō)明的是，上述實(shí)施例及試驗(yàn)中，述及的dmem培養(yǎng)液為dmem培養(yǎng)液、ksom培養(yǎng)液、m16培養(yǎng)液、czb培養(yǎng)液按常規(guī)方法制備，其配方如下：

dmem培養(yǎng)液是將市售的高糖型dmem粉末按照使用說(shuō)明配制而成的培養(yǎng)液。

每升ksom培養(yǎng)液中含有5592.7mg氯化鈉、185.13mg氯化鉀、47.63mg磷酸二氫鉀、49.3mg七水硫酸鎂、2100.25mg碳酸氫鈉、251.4mg二水氯化鈣、1870mg60％乳酸鈉、22.01mg丙酮酸鈉、36.03mg葡萄糖、3.36mgedta(二鈉鹽)、2000mg牛血清蛋白、60mg青霉素、50mg鏈霉素、20ml2％(v/v)必需氨基酸、10ml1％(v/v)非必需氨基酸(市售)、10mg酚紅，余量為四蒸水。

每升m16培養(yǎng)液中含有5680mg氯化鈉、356mg氯化鉀、162mg磷酸二氫鉀、293mg七水硫酸鎂、2100.25mg碳酸氫鈉、251.4mg二水氯化鈣、2610mg60％乳酸鈉、36mg丙酮酸鈉、1000mg葡萄糖、4000mg牛血清蛋白、50mg鏈霉素、5mg酚紅，余量為四蒸水。

每升czb培養(yǎng)液中含有4769.88mg氯化鈉、360.56mg氯化鉀、160.58mg磷酸二氫鉀、290.83mg七水硫酸鎂、2110.33mg碳酸氫鈉、251.4mg二水氯化鈣、3507.79mg乳酸鈉、29.71mg丙酮酸鈉、1001.69mg葡萄糖、36.98mgedta(二鈉鹽)、4000mg牛血清蛋白、70mg青霉素、50mg鏈霉素、20ml2％(v/v)必需氨基酸、10ml1％(v/v)非必需氨基酸、10mg酚紅，余量為四蒸水。

盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對(duì)這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。