亞洲玉米螟吐絲基因片段及其克隆方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及昆蟲絲腺泌絲因子的一種基因序列、氨基酸序列， 具體涉及亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis)絲素輕鏈蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序 列，并涉及該基因的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 亞洲玉米螟屬鱗翅目，螟蛾科，桿野螟屬，又稱為玉米鉆心蟲。亞洲玉米螟是一種 多食性害蟲，在中國(guó)、東南亞、澳大利亞、印度、朝鮮等地區(qū)廣泛分布。亞洲玉米螟食性非常 廣泛，寄主范圍廣，除玉米、高粱、谷子外，還有小麥、棉花、水稻等多達(dá)69種。亞洲玉米螟低 齡幼蟲會(huì)在玉米心葉中取食，致使玉米心葉不能展開，同時(shí)低齡幼蟲可以吐絲下垂，借助風(fēng) 力轉(zhuǎn)移為害；高齡幼蟲會(huì)在莖桿及穗部鉆蛀，使植株得不到足夠的養(yǎng)分而使生長(zhǎng)發(fā)育受阻， 導(dǎo)致玉米、棉花等籽粒干癟、灌漿不足，繼而造成產(chǎn)量下降。有研究表明，亞洲玉米螟給世界 糧食生產(chǎn)都造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，在中國(guó)亞洲玉米螟造成玉米減產(chǎn)十分嚴(yán)重，蟲害發(fā)生 嚴(yán)重的年份損失達(dá)到30%。近年來亞洲玉米螟的發(fā)生規(guī)律隨著氣候條件的改變也發(fā)生了變 化，發(fā)生頻率更是逐漸上升，鑒于此，我國(guó)每年都會(huì)耗費(fèi)巨大的人力、物力對(duì)該蟲進(jìn)行防治， 但效果卻一直不理想。
[0003] 本專利從亞洲玉米螟幼蟲吐絲轉(zhuǎn)移和化蛹滯育前吐大量絲的現(xiàn)象著手，尋找亞洲 玉米螟與吐絲相關(guān)的基因，并利用RNAi技術(shù)干擾相關(guān)基因的表達(dá)乃至沉默，從而達(dá)到減輕 亞洲玉米螟為害的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供了一種亞洲玉米螟吐絲基因片段及其克隆方法和應(yīng)用，本 發(fā)明采用同源基因克隆策略和PCR技術(shù)，擴(kuò)增中間片段，再根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)3'和5'引 物，使用RACE法，分別擴(kuò)增出3'和5'區(qū)段，測(cè)定序列后拼接成完整的基因序列，再使用0RF Finder分析得到亞洲玉米螟絲素蛋白基因輕鏈基因部分的開放閱讀框。
[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，亞洲玉米螟吐絲基因片段，序 列如SEQ ID N0. 12所示。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，亞洲玉米螟吐絲基因片段的克 隆方法，采用同源基因克隆策略和PCR技術(shù)，擴(kuò)增中間片段，再根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)3'和5' 引物，使用RACE法，分別擴(kuò)增出3'和5'區(qū)段，測(cè)定序列后拼接成完整的基因序列。
[0007] 優(yōu)選地，所述克隆方法包括以下步驟：
[0008] (1)亞洲玉米螟幼蟲總RNA的提??；
[0009](2) cDNA第一條鏈的合成；
[0010] ⑶亞洲玉米螟絲素輕鏈基因中間片段擴(kuò)增；
[0011] (4)絲素輕鏈基因的3 ' Race;
[0012] (5)絲素輕鏈基因的5 ' Race ;
[0013] (6)對(duì)所得的中間片段、3' RACE片段及5' RACE片段進(jìn)行拼接，得到亞洲玉米螟絲 素輕鏈基因的cDNA全長(zhǎng)序列。
[0014] 優(yōu)選地，所述亞洲玉米螟幼蟲總RNA的提取參照Promega公司的SV Total Isolation System 試劑盒。
[0015] 優(yōu)選地，所述cDNA第一條鏈的合成步驟為：
[0016] (1)先在微型塑料離心管Microtube中按照以下比例配制10 y L的反應(yīng)體系：
[0017]
[0018] (2) 65°C保溫5min后置于冰上急冷；
[0019] (3)在步驟⑵得到的反應(yīng)液的體系中繼續(xù)按以下比例配制反應(yīng)體系：
[0020]
[0021] (4)緩慢混勾，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42°C 60min ;70°C 15min ;
[0022] (5)反應(yīng)結(jié)束，將樣品在冰上迅速冷卻，得到cDNA。
[0023] 優(yōu)選地，所述亞洲玉米螟絲素輕鏈基因中間片段擴(kuò)增步驟包括：
[0024] 第一，引物設(shè)計(jì)與合成
[0025] 引物序列為：
[0026] Fib-F :5'-ATGCTGCCCTTCGTTTTG-3' ；
[0027] Fib-R :5'-CCCAAGCTGCTTCGAATT-3' ；
[0028] 第二，絲素輕鏈基因中間片段的擴(kuò)增
[0029] 第三，目的基因片段產(chǎn)物的回收與純化
[0030]米用TaKaRa公司的Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver. 2. 0試劑盒， 用于凝膠回收；
[0031]第四，目的基因產(chǎn)物的連接與轉(zhuǎn)化
[0032] 第五，單菌落PCR檢測(cè)。
[0033] 優(yōu)選地，所述絲素輕鏈基因的3' Race包括以下步驟：
[0034] 第一，反應(yīng)原理與引物設(shè)計(jì)
[0035] 1) 3 '端的獲得是通過TAKARA公司的3 '-Fu11 RACE試劑盒所獲得；
[0036] 2)3'race引物設(shè)計(jì)與合成：
[0037] 設(shè)計(jì)了 4條3'端特異性引物，分別為
[0038] 3g :5'-TCGCTCCAGTTGCTGACAATG-3'；
[0039] 3b :5'-GCGACACCAACATCTACATCCT-3' ；
[0040] 3c :5'-ATCATCAACGACCTGTCCAACC-3' ；
[0041] 3e :5'-GTTCAGGCAACAACTCTGGTCTC-3'；
[0042]第二，3' RACE 的擴(kuò)增
[0043] (1)以所述提取的亞洲玉米螟總RNA為模版，再通過TAKARA公司的3'-Ful1 RACE 試劑盒內(nèi)的3' RACE Adaptor引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，由此獲得1st Strand cDNA，
[0044](2)使用3'RACE設(shè)計(jì)的特異性outer引物與TAKARA公司的3'-Full RACE試劑 盒內(nèi)的 3'RACE outer Primer進(jìn)行outer PCR反應(yīng)，
[0045] (3)再以outer PCR產(chǎn)物為模版，分別使用3'RACE設(shè)計(jì)的特異性inner引物與 TAKARA公司的3'-Full RACE試劑盒內(nèi)提供的3'RACE inner Primer進(jìn)行inner反應(yīng)，
[0046](4)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增出分別長(zhǎng)約900bp、 700bp的特異條帶；擴(kuò)增產(chǎn)物的膠回收、克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示該目的片段分別為896bp、 710bp〇
[0047] 優(yōu)選地，所述絲素輕鏈基因的5' Race包括以下步驟：
[0048] 第一，反應(yīng)原理與引物設(shè)計(jì)
[0049] (1) 5 '端的獲得是通過TAKARA公司的5 '-Fu11 RACE試劑盒所獲得；
[0050] (2) 5'race引物設(shè)計(jì)與合成：
[0051] 設(shè)計(jì)了 3條5'端特異性引物，分別為
[0052] 5e :5'-GGTTGGACAGGTCGTTGATG-3'；
[0053] 5c :5'-CTGCTGGATGGTCAGGATGTA-3'；
[0054] 5f :5'-CCATTGTCAGCAACTGGAGC-3'；
[0055]第二，5'RACE 的擴(kuò)增
[0056] (1)去除總RNA中裸露的5'磷酸基團(tuán)
[0057] (2)去除mRNA的5'帽子結(jié)構(gòu)，保留一個(gè)磷酸基團(tuán)
[0058] (3) 5' RACE Adaptor 的連接
[0059] ⑷反轉(zhuǎn)錄
[0060] (5)使用5' RACE試驗(yàn)設(shè)計(jì)的特異性引物與TAKARA公司的5'-FullRACE試劑盒 內(nèi)提供的引物進(jìn)行反應(yīng)：
[0061] (6)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增出分別長(zhǎng)約250bp、 170bp的特異條帶；擴(kuò)增產(chǎn)物的膠回收、克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示該目的片段分別為236bp、 148bp〇
[0062] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是，亞洲玉米螟吐絲基因片段在調(diào)控亞洲玉米螟的吐絲卷葉 與鉆駐為害中的應(yīng)用。
[0063] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是，亞洲玉米螟吐絲基因片段導(dǎo)入靶標(biāo)作物中，成為轉(zhuǎn)基因 素材。
[0064] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：采用RACE技術(shù)克隆出了亞洲玉米 螟絲素輕鏈基因的cDNA全長(zhǎng)。該基因全長(zhǎng)1098bp，自39bp至830bp為其開放閱讀框，起 始密碼子ATG，終止密碼子TAA，一共編碼263個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為92. 756kDa，等電點(diǎn) pi為4. 99。通過同源性比對(duì)，亞洲玉米螟絲素輕鏈基因與棉大卷葉螟（Sylepta derogata Fabricius)同源性為75%，與外米綴蛾（Corcyra cephalonica)的同源性為69%;與大錯(cuò) 螟（Galleria mellonella)的同源性為68%。該基因片段對(duì)亞洲玉米螟的吐絲有重大影 響，它的成功克隆及基因序列的測(cè)定為今后進(jìn)一步研究與控制亞洲玉米螟的吐絲卷葉與鉆 蛀為害等奠定了重要基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0065] 圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果；
[0066] 圖2膠回收的結(jié)果；
[0067]圖 3 菌液 PCR 結(jié)果（注：M 為 DL2000marker);
[0068]圖 4 3' RACE PCR 擴(kuò)增結(jié)果；
[0069] 圖5 3' RACE膠回收結(jié)果；
[0070]圖 6 3' RACE 菌液 PCR 結(jié)果（M 為 DL2000marker);
[0071]圖 7 5' RACE PCR 擴(kuò)增結(jié)果；
[0072] 圖8 5' RACE膠回收結(jié)果；
[0073]圖 9 5' RACE 菌液 PCR 擴(kuò)增結(jié)果（M 為 DL2000marker);
[0074] 圖10開放閱讀框擴(kuò)增結(jié)果（M為DL2000marker);
[0075] 圖11基于輕鏈基因氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹；
[0076] 圖12目標(biāo)基因?qū)崟r(shí)定量PCR溶解曲線；
[0077] 圖13內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR溶解曲線；
[0078] 圖14目標(biāo)基因?qū)崟r(shí)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0079] 圖15內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0080] 圖16不同發(fā)育階段亞洲玉米螟絲素輕鏈基因的相對(duì)表達(dá)量；
[0081] 圖17不同溫度下亞洲玉米螟絲素輕鏈基因的相對(duì)表達(dá)量；
[0082] 圖18不同寄主條件下亞洲玉米螟絲素輕鏈基因的相對(duì)表達(dá)量；
[0083]圖 19 目標(biāo) PCR 產(chǎn)物（M 為 DL2000marker);
[0084]圖 20 pGEM-T easy 載體與 pET-2P-GFP