一種籽粒莧的綠色組織特異啟動(dòng)子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種籽粒莧的綠色組織特異啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]控制轉(zhuǎn)基因在植物體內(nèi)按照人們的設(shè)計(jì)表達(dá)是安全轉(zhuǎn)基因的關(guān)鍵點(diǎn)。轉(zhuǎn)基因的表達(dá)部位、表達(dá)水平受其上游的一段DNA序列，即啟動(dòng)子的控制?，F(xiàn)在轉(zhuǎn)基因研究中主要使用組成型啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因在植株的所有部位持續(xù)恒定表達(dá)。在非必需部位的表達(dá)，額外消耗了植物的營(yíng)養(yǎng)和能量，產(chǎn)生的異源蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物，可能干擾植物原有的代謝平衡。在食用部位的表達(dá)，還易引起民眾食用安全性疑慮，遲滯轉(zhuǎn)基因品種的推廣種植。另外，在轉(zhuǎn)基因研究中，不同的基因使用相同的啟動(dòng)子，或轉(zhuǎn)基因所用的啟動(dòng)子與受體植物中已有的啟動(dòng)子相同，還易引起同源抑制，影響轉(zhuǎn)基因的高效表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是，提供一種新型的組織特異啟動(dòng)子及其應(yīng)用。該啟動(dòng)子是一種籽粒莧的綠色組織特異啟動(dòng)子，它與現(xiàn)有的啟動(dòng)子的序列不同，它驅(qū)動(dòng)外源基因只在綠色組織中表達(dá)，能避免在其它非綠色組織的表達(dá)產(chǎn)生的對(duì)植物養(yǎng)分和能量的過(guò)度消耗，將其用于以籽粒為主要收獲產(chǎn)物的作物，如小麥、玉米、水稻等主要農(nóng)作物，或用于以地下薯塊為主要收獲產(chǎn)物的作物，如馬鈴薯、甘薯等作物，讓抗除草劑、抗蟲(chóng)等外源基因只在莖葉等綠色部分表達(dá)，在籽粒和地下薯塊中不表達(dá)，以提高轉(zhuǎn)基因作物的安全性。
[0004]本發(fā)明由如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種籽粒莧的綠色組織特異性啟動(dòng)子，所述籽粒莧的綠色組織特異性啟動(dòng)子為ProAhPEPC，其核苷酸序列為:SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0005]本發(fā)明還提供一種表達(dá)盒，利用上述籽粒莧的綠色組織特異啟動(dòng)子ProAhPEPC與目的基因連接所構(gòu)建而得。
[0006]本發(fā)明還提供一種表達(dá)載體，利用所述籽粒莧的綠色組織特異啟動(dòng)子ProAhPEPC構(gòu)建而得。植物表達(dá)載體為pCAMBIA3301-ProAhPEPC-GUS，構(gòu)建方法為:
將含有籽粒莧的綠色組織特異啟動(dòng)子的T載體用Bgl II和PstI雙酶切，從酶切產(chǎn)物中回收啟動(dòng)子片段，同時(shí)用Bgl II和PstI雙酶切植物表達(dá)載體pCAMBI3301，回收Ilkb的載體片段；將回收的啟動(dòng)子片段和載體片段用T4 DNA連接酶連接，使籽粒莧的綠色組織特異啟動(dòng)子取代PCAMBI3301載體上驅(qū)動(dòng)⑶S基因表達(dá)的CaMV35S啟動(dòng)子。
[0007]本發(fā)明還提供了籽粒莧的綠色組織特異啟動(dòng)子ProAhPEPC在制備轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用。所述植物為以籽粒為主要收獲產(chǎn)物的作物或以地下根、莖為主要收獲產(chǎn)物的作物。
[0008]所述載體為植物表達(dá)載體，例如植物雙元表達(dá)載體等。所述重組表達(dá)載體具體可為將所述啟動(dòng)子核苷酸序列插入質(zhì)粒PCAMBIA3301的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒?？捎矛F(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體。為了便于鑒定及篩選，可對(duì)所用表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。
[0009]本發(fā)明還提供含有上述表達(dá)盒或載體的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞為農(nóng)桿菌LBA4404細(xì)胞和大腸桿菌ToplO細(xì)胞。
[0010]本發(fā)明還提供籽粒莧的綠色組織特異啟動(dòng)子在調(diào)控下游基因表達(dá)中的應(yīng)用，優(yōu)選下游基因?yàn)棰荢基因。
[0011]本發(fā)明還進(jìn)一步提供籽粒莧的綠色組織特異啟動(dòng)子在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。例如，可以將抗病、抗蟲(chóng)等基因可操作地連接到籽粒莧的綠色組織特異啟動(dòng)子下游，構(gòu)建得到表達(dá)盒，進(jìn)一步將該表達(dá)盒插入到植物表達(dá)載體，將獲得的重組表達(dá)載體通過(guò)比如，農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍法等方式轉(zhuǎn)化植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物。
[0012]使用本發(fā)明的籽粒莧綠色組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因只在綠色組織中表達(dá)，將其用于玉米、水稻等以籽粒為主要收獲產(chǎn)物的作物，或馬鈴薯、甘薯等以地下根、莖為主要收獲產(chǎn)物的作物中，讓抗除草劑、抗蟲(chóng)等外源基因只在莖葉等綠色部分表達(dá)，而不在籽?；虻叵率韷K等食用部分表達(dá)，以提高轉(zhuǎn)基因作物的安全性。
【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中籽粒莧綠色組織特異啟動(dòng)子的染色體步移結(jié)果圖，圖中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL5000，I為染色體步移產(chǎn)物；圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中籽粒莧綠色組織特異啟動(dòng)子連接到PSURE-T載體上用PstI酶切鑒定結(jié)果圖，圖中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL5000，I為籽粒莧綠色組織特異啟動(dòng)子連接到pSURE_T載體上用PstI酶切后的產(chǎn)物；圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中初始表達(dá)載體pCAMBIA3301結(jié)構(gòu)示意圖；圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中帶有籽粒莧綠色組織特異啟動(dòng)子的表達(dá)載體PCAMBIA3301-ProAhPEPC-GUS的結(jié)構(gòu)示意圖；圖5為用Bgl II和PstI對(duì)籽粒莧綠色組織特異啟動(dòng)子的表達(dá)載體pCAMBIA3301-ProAhPEPC-GUS的雙酶切鑒定圖，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) DL5000，I 為 pCAMBIA3301-ProAhPEPC-GUS 用 Bgl II 和 PstI 雙酶切后的產(chǎn)物；圖6為轉(zhuǎn)pCAMBIA3301-ProAhPEPC-GUS的煙草PCR檢測(cè)鑒定圖，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000, -CK為非轉(zhuǎn)基因植株，+CK為載體pCAMBIA3301-ProAhPEPC-GUS，1-3為攜帶有籽粒莧綠色組織特異啟動(dòng)子的不同轉(zhuǎn)基因株系；圖7為轉(zhuǎn)pCAMBIA3301-ProAhPEPC-GUS的馬鈴薯PCR檢測(cè)鑒定圖。M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，-CK為非轉(zhuǎn)基因植株，+CK為載體pCAMB I A3 301 -ProAhPEPC-GUS，I _7為攜帶有籽粒莧綠色組織特異啟動(dòng)子的不同轉(zhuǎn)基因株系O
【具體實(shí)施方式】
[0014]以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0015]若未特別指明，本發(fā)明以下實(shí)施例所使用的分子生物學(xué)和生物化學(xué)方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)方法。
[0016]實(shí)施例1:籽粒莧綠色組織特異啟動(dòng)子的克隆根據(jù)克隆的籽粒莧磷酸稀醇式丙酮酸羧化酶基因的核苷酸序列(GenBank登陸號(hào):HQ186302)，設(shè)計(jì)合成染色體步移所要求的三條特異性引物:
引物 SPl:5' -ATCAAGTTTCCCAGCTCCTCC-3' (SEQ ID N0.2)；
引物 SP2:5' -GGAAACGATCAAGCAACAAAGC-3' (SEQ ID N0.3)；
引物 SP3:5' -GATGCCATTTTCTCCAACTTCC-3' (SEQ ID N0.4)。
[0017]以籽粒莧基因組DNA為模板，進(jìn)行染色體步移，步移步驟如下:
(I)第一步
①按下列組份配制PCR反應(yīng)液:
籽粒莧DNAI μ L
dNTP Mixture (2.5 mM each )8 μ L
10XLA PCR Buffer II (Mg2+ plus)5 yL
TaKaRa LA Taq 酶(5 U/μ I)0.5 μ L
簡(jiǎn)并引物(100 pmol/μ I)I μ L
引物 SPl (10 pmol/μ I)I μ L
ddHoO_33.5 u L
總計(jì)50 μ L
②進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序如下:
94°C I min ；98°C I min ；
94°C 30 sec,68°C 2min，72°C 2 min ；5 Cycles ；
94°C 30 sec, 25°C 3 min，72°C 2min ；
94°C 30 sec,68°C I min，72°C 2min，94°C 30 sec,68°C I min，72°C 2min，94°C 30sec,44°C I min ；72°C 2 min ；，15 Cycles ；
72°C 10 min。
[0018]反應(yīng)完畢，將PCR反應(yīng)液稀釋100倍。
[0019](2)第 2 步
①按下列組份配制PCR反應(yīng)液:
第I步的PCR反應(yīng)液的稀釋液I μ L
dNTP Mixture (2.5 mM each )8 μ L
10XLA PCR Buffer II (Mg2+ plus)5 yL
TaKaRa LA Taq 酶(5 U/μ I)0.5 μ L
簡(jiǎn)并引物(100 pmol/μ I)I μ L
引物 SP2 (10 pmol/μ I)IyL
ddHoO_33.5 u L
總計(jì)50 μ L
②進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序如下:
940C 30 sec, 680C I min，72°C 2min，94°C 30 sec,68°C I min，72°C 2min，94°C 30sec,44°C I min,72°C 2min ；15 Cycles ；
72°C 10 min。
[0020]反應(yīng)完畢，將PCR反應(yīng)液稀釋100倍 (3)第3步
①按下列組份配制PCR反應(yīng)液。
[0021]第2步的PCR反應(yīng)液的稀釋液I μ L dNTP Mixture (2.5 mM each ) 8 μ L 10XLA PCR Buffer II (Mg2