條特異性引物，通過3' -Full RACE試劑盒進行套式PCR 反應(yīng)，可以擴增出分別長約900bp、700bp的特異條帶。圖4顯示的3' RACE擴增結(jié)果，與預(yù) 期結(jié)果一致。圖5、圖6分別顯示膠回收與菌液PCR結(jié)果。測序結(jié)果顯示該目的片段分別為 896bp、710bp，經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST檢索，該片段與其他昆蟲的絲素輕鏈基因具有較高 的同源性，由此推斷該片段為亞洲玉米螟絲素輕鏈基因的部分片段。
[0166] 1. 5絲素輕鏈基因的5' Race
[0167] 1. 5. 1反應(yīng)原理與引物設(shè)計
[0168] 1) 5'端的獲得是通過TAKARA的5' -Full RACE試劑盒所獲得。
[0169] 2) 5'race引物設(shè)計與合成：
[0170]使用之前已測序的中間片段設(shè)計了 3條5'端特異性引物，分別為5e: 5' -GGTTGGACAGGTCGTTGATG-3,和 5c :5'-CTGCTGGATGGTCAGGATGTA-S'、5f : 5' -CCATTGTCAGCAACTGGAGC-3'，用于擴增亞洲玉米螟絲素輕鏈基因的3'端序列。引物由上 海生物工程公司合成。
[0171] 1. 5. 2 5'RACE 的擴增
[0172] 1)去除總RNA中裸露的5'磷酸基團
[0173] ①按下列組份配制反應(yīng)體系：
[0174]
i
[0175]
[0176] ②上述體系混勻后在50°C反應(yīng)1小時。
[0177] ③向上述反應(yīng)液中加入20 y L的3M CH3C00Na(pH5. 2)，130 y L的無RNA酶水后， 充分混勻。
[0178] @加入200 1^的苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1)，充分混勻后13000印111室溫離心 5分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的微型塑料離心管中。
[0179] ⑤加入200 y L的氯仿，充分混勻后13000rpm室溫離心5分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至 新的微型塑料離心管中。
[0180] ⑥加入2 y L的鈉載體NA Carrier后均勻混合。
[0181] ⑦加入200 yL的異丙醇，充分混勻后，冰上冷卻10分鐘。
[0182] ⑧13000rpm 4°C離心20分鐘，棄上清。
[0183] ⑨加入500 y L的70%冷乙醇（無RNA酶水配制）漂洗，13000rpm 4°C離心5分 鐘，棄上清后干燥。
[0184] ⑩加入7 y L的無RNA酶水溶解沉淀，得到去磷酸化處理過的RNA CIAP-treated RNA〇
[0185] 2)去除mRNA的5'帽子結(jié)構(gòu)，保留一個磷酸基團
[0186] ①按下列組份配制反應(yīng)體系：
[0187] ClAP-treafed RNA (去磷酸化處理過的RNA) 1UL 40 U/|-iL RNasc inhibitor 1 uL CRNA酶抑制劑)_ l〇x XAP Reaction Buffer i … 1ml (TAP反M緩沖液） 0.5 U/(.iL Tobacco Acid Pyrophosphatase (煙草酸焦磷酸酶） 1mL 總體積 10 pL
[0188] ②上述體系混勻后在37°C反應(yīng)1小時。
[0189] ③此反應(yīng)液為去磷酸化/TAP處理過的RNA CIAP/TAP-treated RNA。取5 y L用于 5' RACE Adaptor 連接反應(yīng)。
[0190] 3) 5' RACE Adaptor 的連接
[0191] ①按下列組份配制反應(yīng)體系：
[0192] GIAP/TAP-treated RNA 5 jxL
[0193] (去磷酸化/mp處理過的RNA)： 15 .S'RACE Adapter I pL (端銜接子） RNasc Free ciH^O 4nJ (無RNA酶水）
[0194] ②65°C保溫5分鐘后冰上放置2分鐘，然后加入下列試劑：
[0195] 40 U/(..iL RNasc Inhibilor ....... 1 uL (RNA酶抑制劑） 5xRNA Ligation Buffer 8 uL (IMA連接緩沖液） 40% P￡G#6000 20 uL T.4縣fM 連接酶）（40 l|_L> :1 pL
[0196] ③16°C反應(yīng)1小時。
[0197]④向上述反應(yīng)液中加入20 y L的3M CH3C00Na(pH5. 2)，140 y L的無RNA酶水后， 充分混勻。
[0198] ⑤加入200 y L的苯酚/氯仿/異戊醇（25 :24 :1)，充分混勻后13000rpm室溫離 心5分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的微型塑料離心管中。
[0199] ⑥加入200 y L的氯仿，充分混勾后13000rpm室溫離心5分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至 新的微型塑料離心管中。
[0200] ⑦加入2yL的NA Carrier后均勻混合。
[0201] ⑧加入200 yL的異丙醇，充分混勻后，冰上冷卻10分鐘。
[0202] ⑨13000rpm 4°C離心20分鐘，棄上清。加入500 y L的70%冷乙醇（無RNA酶水 配制）漂洗，13000rpm 4°C離心5分鐘，棄上清后干燥。
[0203] ⑩加入6 y L的無RNA酶水溶解沉淀，得到連接后的RNA Ligated RNA。
[0204] 4)反轉(zhuǎn)錄
[0205] ①按下列組份配制反應(yīng)體系：
[0206] Ligated RNA^iftiniKj RNA 6 0 ,uL Random 9 mers (50 ,uM )(隨機引物） 0 5 pL 滅-M? Bufife (反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)液） 2.0 pL
[0207] dNTP (lOmMeach)(三磷酸脫氧核苷復(fù)合物） 1 OfiL 40 U/|.iL RNasc Inhibitor 0.25 uL (RNA酶抑制劑） 200 U/j-iLRcvcrsc Transcriptase M-V1LV (RNasc H") 0.25 uL (無Rnase-H活性的反轉(zhuǎn)錄酶） 總體積 10.01-iL
[0208]②反應(yīng)條件：3(TC lOmin ;42°C 60min ;7(TC 15min。
[0209] 5)使用5' RACE試驗設(shè)計的特異性引物與試劑盒內(nèi)提供的引物進行反應(yīng)：
[0210] ①5'RACE設(shè)計的特異性outer引物與試劑盒內(nèi)的5'RACE Outer Primer的outer PCR體系
[0211] 上述4的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液 .2 pL 1 xcDNA Dilution Buffer 8 liL (eDNA稀釋液II) 1 OxLA PCR BulTcr 11 (Me2- Free) 4iaL (不含鎂離子的LAPCR緩沖液） MgCl：( 25 mM ) 3 j.iL TaKaRa LA Taq (5 U/(iL ) 0.25 (.lL 時5e Ouier Pdmer ,2 jiL 5'RACE Outer Primer (iA/r'J.^n 2 (.iL 帶）（KHiM) dH.O 28.75.uL 總體積 50\iL
[0212] ②反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性 5min;94°C變性 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸 2min， 設(shè)定30個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
[0213] ③再以outer PCR反應(yīng)體系為模版，分別使用5'RACE設(shè)計的特異性inner引物與 試劑盒內(nèi)提供的5' RACE inner Primer進行inner反應(yīng)：
[0214] CmterPCRS 應(yīng)液 l^iL LA PCR BufferII (Mg- Free) 5|iL (不含鎂離子的LAPCR緩沖液） MgCl2 (25mM) 5^L
[0215] each dNTP Mixture (2.5 mM ) gnL： (三磷酸脫氧核苷復(fù)合物） raKaRaLATaq〇If|iL) ?,5|lL 5c inner Primer 2 j.iL 5"RACE Inner Primer C IO 2'JaL (試劑盒自帶） ddH_?0 26.5j.iL 總體積 50jiL
[0216]④反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸 2min， 設(shè)定30個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
[0217] 6)將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物的膠回收、克隆測序。
[0218] 使用5' RACE端設(shè)計的2條特異性引物，通過5' -Full RACE試劑盒進行套式PCR 反應(yīng)，可以擴增出分別長約250bp、170bp的特異條帶。圖7顯示的5' RACE擴增結(jié)果，與預(yù) 期結(jié)果一致。圖8、圖9分別顯示膠回收與菌液PCR結(jié)果。測序結(jié)果顯示該目的片段分別為 236bp、148bp，經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST檢索，該片段與其他昆蟲的絲素輕鏈基因具有較高 的同源性，由此推斷該片段為亞洲玉米螟絲素輕鏈基因的部分片段。
[0219] 通過3' RACE和5' RACE擴增結(jié)果拼接以后，經(jīng)由ORF Finder程序得出亞洲玉米 螟絲素輕鏈基因的開放閱讀框長792bp。圖10顯示的為開放閱讀框PCR結(jié)果，目的條帶約 800bp，這與試驗結(jié)果一致。
[0220] 1.6序列分析
[0221] 利用DNAMAN軟件對所得的中間片段、3 ' RACE片段及5 ' RACE片段進行拼接， 得到亞洲玉米螟絲素輕鏈基因的eDNA全長序列。通過ORF Finder程序（http://www. nebi. nlm. nih. gov/gorf/orfig. cgi)獲得該基因的開放閱讀框，同時為驗證拼接序列 的準(zhǔn)確性及完整性，在拼接后的該基因開放閱讀框兩端設(shè)計特異性引物并驗證。引物為 5'-ATAAAGACCAGCAAAATGCT-3' 和 5'-TTATTTACAGCTGGATGCTG-3' 。
[0222] 對獲得基因序列在 NCBI 上進行 BLAST (http://blast, nebi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)，并對核酸和推導(dǎo)得到的氨基酸殘基進行相似性分析，利用（http://web. expasy. org/ cgi-bin/ptparam/protparam)估算分子量和等電點。
[0223] 測序得到的中間片段、3' RACE片段、5' RACE片段，通過DNAMAN拼接以后，得到了 亞洲玉米螟絲素清廉記憶的eDNA全長。由ORF Finder對該序列進行分析：絲素輕鏈基因 eDNA全長1098bp，起始密碼子ATG，終止