本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種基因工程菌及其構(gòu)建方法與生產(chǎn)香蘭素的方法，尤其是一種生產(chǎn)香蘭素的基因工程菌及其構(gòu)建方法與利用該菌株以葡萄糖、甘油等廉價碳源生產(chǎn)香蘭素的方法。
背景技術(shù)：
香蘭素(vanillin)，又名香草醛，化學(xué)名為3-甲氧基-4-羥基苯甲醛，為白色或微黃色結(jié)晶，具有香莢蘭香氣及濃郁的奶香，是人們普遍喜愛的奶油香草香精的主要成分。香蘭素是目前世界上產(chǎn)量最大的合成香料。香蘭素的合成方法主要有化學(xué)合成法和微生物轉(zhuǎn)化法。其中化學(xué)合成法產(chǎn)率高，成本低，但存在著原料愈創(chuàng)木酚等有毒、環(huán)境污染較嚴重，產(chǎn)品不具備天然性等問題。
近年來，隨著生物學(xué)，尤其是合成生物學(xué)的迅速發(fā)展，微生物法制備香料因反應(yīng)條件溫和，能保持食品的天然性而越來越受關(guān)注。利用微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)天然香蘭素方面的研究已取得了很多重要的研究成果，但仍存在許多科學(xué)問題需要深入的探索研究，而且高效益的工業(yè)化生產(chǎn)也亟待進一步的優(yōu)化。現(xiàn)有的研究中，多以阿魏酸、丁香酚、異丁香酚等原料為底物，通過生物催化或生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)香蘭素。然而這些原料存在成本高、來源復(fù)雜及毒性等不足之處。使用如葡萄糖等廉價的天然原料，開發(fā)合成天然香蘭素的新途徑，達到工業(yè)化生產(chǎn)需要的高產(chǎn)量，是現(xiàn)階段生物法制備香蘭素研究領(lǐng)域的瓶頸，亟待突破性的創(chuàng)新研究。
1998年li等利用重組大腸桿菌以葡萄糖為底物經(jīng)莽草酸途徑生產(chǎn)香草酸，在體外由粗糙脈孢菌產(chǎn)生的芳香酸還原酶催化下，生產(chǎn)微量的香蘭素，但該方法步驟繁瑣。2009年hansen等通過代謝工程方法改造粟酒裂殖酵母及釀酒酵母，改造后的菌株分別可以以葡萄糖為底物，可產(chǎn)生65mg/l及45mg/l香蘭素，然而該方法一方面產(chǎn)生了異香蘭素這一難以分離的副產(chǎn)物，另一方面由于酵母對香蘭素降解能力較強及香蘭素對菌體的毒性，需要將香蘭素進一步衍生為葡糖苷-香蘭素，不利于后續(xù)的應(yīng)用。2015年，許平等利用代謝工程方法改造大腸桿菌，構(gòu)建的菌株以酪氨酸為底物生產(chǎn)97.2mg/l香蘭素，以葡萄糖、木糖和甘油等底物分別產(chǎn)生19.3mg/l、13.3mg/l和24.7mg/l香蘭素，但該路徑引入的外源基因較多，路線較長，效率有待提高。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種基因工程菌，所述菌株能夠以葡萄糖、甘油等廉價底物發(fā)酵生產(chǎn)香蘭素，可以獲得香蘭素的有效積累。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種基因工程菌，其中一個或多個與3-脫氫莽草酸代謝途徑相關(guān)的基因被突變，并且/或者一個或多個與3-脫氫莽草酸代謝途徑相關(guān)的基因被敲除或失活，并且/或者一個或多個與香蘭素代謝相關(guān)的基因被敲除或失活，并且/或者一個或多個與3-脫氫莽草酸代謝途徑相關(guān)的基因表達被增強，并且/或者一個或多個與香蘭素生產(chǎn)途徑相關(guān)的基因表達被增強。
優(yōu)選地，所述被突變的與3-脫氫莽草酸代謝途徑相關(guān)的基因為aroffbr、arogfbr或trpefbr中至少一個。所述突變基因aroffbr、arogfbr、trpefbr具有代謝終產(chǎn)物抗反饋抑制的特性。
更優(yōu)選地，所述aroffbr的突變?yōu)?48位脯氨酸突變成亮氨酸。
優(yōu)選地，所述被敲除或失活的與3-脫氫莽草酸代謝途徑相關(guān)的基因為aroe。
優(yōu)選地，所述被敲除或失活的與香蘭素代謝相關(guān)的基因為yqhc、yqhd、dkga、yahk或yjgb中至少一個。
優(yōu)選地，所述被過表達的與3-脫氫莽草酸代謝途徑相關(guān)的基因為aroffbr和/或arob。
優(yōu)選地，所述被過表達的與香蘭素生產(chǎn)途徑相關(guān)的基因為3-脫氫莽草酸脫水酶基因aroz，o-甲基轉(zhuǎn)移酶基因comt或香草酸還原酶基因car中至少一個。
其中，優(yōu)選地，所述3-脫氫莽草酸脫水酶來源于芽孢桿菌屬(蠟狀芽孢桿菌或蘇云金桿菌)。更優(yōu)選地，所述3-脫氫莽草酸脫水酶基因與seqidno.1的核酸序列雜交，并且編碼具有3-脫氫莽草酸脫水酶活性的蛋白質(zhì)，其中所述3-脫氫莽草酸脫水酶來源于蠟狀芽孢桿菌。
優(yōu)選地，所述o-甲基轉(zhuǎn)移酶來源于番茄、人、中國對蝦、黃色黏球菌、甜椒或羅勒。更優(yōu)選地，所述o-甲基轉(zhuǎn)移酶基因與seqidno.3的核酸序列雜交，并且編碼具有o-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)，其中所述o-甲基轉(zhuǎn)移酶來源于番茄。
優(yōu)選地，所述香草酸還原酶來源于艾阿華諾卡氏菌或粗糙脈孢菌。更優(yōu)選地，所述香草酸還原酶基因與seqidno.9的核酸序列雜交，并且編碼具有香草酸還原酶活性的蛋白質(zhì)，其中所述香草酸還原酶來源于艾阿華諾卡氏菌。
在一個實施方案中，所述的基因工程菌中被突變、被敲除或滅活、被增強的基因是組合表達在合適拷貝的表達載體上或整合在基因組上。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述的基因工程菌中所述被突變的與3-脫氫莽草酸代謝途徑相關(guān)的基因為aroffbr的148位脯氨酸突變成亮氨酸；所述被敲除或失活的與3-脫氫莽草酸代謝途徑相關(guān)的基因為aroe；所述被敲除或失活的與香蘭素代謝相關(guān)的基因為yqhc、yqhd、dkga、yahk和yjgb；所述被過表達的與3-脫氫莽草酸代謝途徑相關(guān)的基因為aroffbr和arob；所述被過表達的與香蘭素生產(chǎn)途徑相關(guān)的基因為aroz、comt和car。
在某一具體實施例中，所述的基因工程菌命名為cffsh003，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為cctccno:m2016770。
本發(fā)明提供了一種重組載體，在prsfduet-1載體的多克隆位點插入3-脫氫莽草酸脫水酶基因aroz和o-甲基轉(zhuǎn)移酶基因comt，該載體命名為prsfduet-aroz-comt。優(yōu)選的，所述3-脫氫莽草酸脫水酶基因來源于蠟狀芽孢桿菌，所述o-甲基轉(zhuǎn)移酶基因comt來源于番茄。
本發(fā)明還提供了一種重組載體，在petduet-1載體的多克隆位點插入香草酸還原酶基因car，該載體命名為petduet-car。優(yōu)選的，所述香草酸還原酶基因car來源于艾阿華諾卡氏菌。
本發(fā)明還提供了一種重組載體，在pacycduet-1載體的多克隆位點插入arob和aroffbr基因，命名為pacycduet-arob-aorffbr。其中所述aroffbr是經(jīng)突變的。
優(yōu)選地，所述aroffbr基因中148位脯氨酸突變成亮氨酸。
本發(fā)明還提供了所述基因工程菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
a、敲除或失活菌株中一個或多個與3-脫氫莽草酸代謝途徑相關(guān)的基因，獲得工程菌株??；并且/或者
b、敲除或失活菌株中一個或多個與香蘭素代謝相關(guān)的基因，獲得工程菌株ⅱ；并且/或者
c、突變菌株中一個或多個與3-脫氫莽草酸代謝途徑相關(guān)的基因，獲得工程菌株ⅲ；
d、增強菌株中一個或多個與3-脫氫莽草酸代謝途徑相關(guān)的基因的表達，獲得重組載體i；
e、增強菌株中一個或多個與香蘭素生產(chǎn)相關(guān)的基因的表達，獲得重組載體ii；
f、將含有步驟d的重組載體i和步驟e的重組載體ii轉(zhuǎn)入步驟a工程菌株ⅰ、步驟b工程菌株ⅱ或步驟c工程菌株ⅲ。
優(yōu)選地，所述步驟a中與3-脫氫莽草酸代謝途徑相關(guān)的基因為aroe。
優(yōu)選地，所述步驟b中與香蘭素代謝相關(guān)的基因為yqhc、yqhd、dkga、yahk或yjgb中至少一個。更優(yōu)選的，步驟b中與香蘭素代謝相關(guān)的基因為yqhc、yqhd、dkga、yahk和yjgb。
優(yōu)選地，所述步驟c中與3-脫氫莽草酸代謝途徑相關(guān)的基因為aroffbr、arogfbr或trpefbr中至少一個。更優(yōu)選的，步驟c中與3-脫氫莽草酸代謝途徑相關(guān)的基因為aroffbr，其中所述aroffbr的突變?yōu)?48位脯氨酸突變成亮氨酸。
優(yōu)選地，所述步驟d中與3-脫氫莽草酸代謝途徑相關(guān)的基因為aroffbr和/或arob。更優(yōu)選地，所述步驟d中與3-脫氫莽草酸代謝途徑相關(guān)的基因為aroffbr和arob，其中所述aroffbr為148位脯氨酸突變成亮氨酸。
優(yōu)選地，所述步驟e中與香蘭素生產(chǎn)途徑相關(guān)的基因為3-脫氫莽草酸脫水酶基因aroz，o-甲基轉(zhuǎn)移酶基因comt或香草酸還原酶基因car中至少一個。更優(yōu)選地，為aroz、comt和car。
優(yōu)選地，步驟d所述重組載體為pacycduet-arob-aorffbr，步驟e所述重組載體為prsfduet-aroz-comt和/或petduet-car。
本發(fā)明對大腸桿菌中3-脫氫莽草酸代謝途徑進行改造，缺失了莽草酸脫氫酶編碼基因aroe，同時缺失了香蘭素降解相關(guān)基因，使菌株累積大量的3-脫氫莽草酸，并增強3-脫氫莽草酸脫水酶基因、o-甲基轉(zhuǎn)移酶基因和香草酸還原酶基因以及3-脫氫莽草酸代謝途徑的2個基因的表達，構(gòu)建獲得香蘭素的生產(chǎn)菌株，可用于發(fā)酵法生產(chǎn)香蘭素。本發(fā)明獲得的基因工程菌能夠以葡萄糖、甘油等廉價底物發(fā)酵生產(chǎn)香蘭素，可以獲得香蘭素的有效積累。因此本發(fā)明提供了所述基因工程菌在生產(chǎn)香蘭素中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)香蘭素的方法，使用本發(fā)明所述基因工程菌作為發(fā)酵生產(chǎn)菌。
優(yōu)選地，所述生產(chǎn)香蘭素的方法，具體包括以下步驟：
(1)平板培養(yǎng)：將本發(fā)明所述基因工程菌接種至含有氨芐霉素、卡那霉素和氯霉素的lb培養(yǎng)基固體平板上，37℃培養(yǎng)過夜；
(2)種子培養(yǎng)：將步驟(1)培養(yǎng)的菌株接種至含有氨芐霉素、卡那霉素和氯霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(2)中得到的種子液接種到含有氨芐霉素、卡那霉素、氯霉素和iptg的發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)48小時，得到含香蘭素的發(fā)酵液。
優(yōu)選地，步驟(1)中所述氨芐霉素的濃度為100μg/ml；卡那霉素的濃度為50μg/ml；氯霉素的濃度為25μg/ml。
優(yōu)選地，步驟(2)中所述氨芐霉素的濃度為100μg/ml；卡那霉素的濃度為50μg/ml；氯霉素的濃度為25μg/ml。
優(yōu)選地，步驟(3)中所述氨芐霉素的濃度為100μg/ml；卡那霉素的濃度為50μg/ml；氯霉素的濃度為25μg/ml；iptg的濃度為0.2mm。
優(yōu)選地，步驟(1)～(2)中所述的lb培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl10g/l。其中l(wèi)b固體培養(yǎng)基另外添加2％瓊脂。
優(yōu)選地，步驟(3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為lb培養(yǎng)基、添加20g/l葡萄糖的lb培養(yǎng)基或wvp培養(yǎng)基。
其中，所述wvp培養(yǎng)基的配方為kh2po47.5g/l、(nh4)2so42.96g/l、mgso40.24g/l、檸檬酸銨0.3g/l、一水合檸檬酸2.1g/l、苯丙氨酸0.7g/l、酪氨酸0.7g/l、色氨酸0.7g/l、對氨基苯甲酸0.01g/l、2,3-二羥基苯甲酸0.01g/l、對羥基苯甲酸0.01g/l、(nh4)6(mo7o24)·4h2o0.0037g/l、znso4·7h2o0.0029g/l、h3bo30.0247g/l、cuso4·5h2o0.0025g/l、mncl2·4h2o0.0158g/l、葡萄糖或甘油20g/l。
由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種基因工程菌及其構(gòu)建方法與生產(chǎn)香蘭素的方法。本發(fā)明所述基因工程菌對大腸桿菌中3-脫氫莽草酸代謝途徑進行改造，缺失了莽草酸脫氫酶基因，同時缺失了香蘭素降解相關(guān)基因，使菌株累積大量的3-脫氫莽草酸，并增強了3-脫氫莽草酸脫水酶基因、o-甲基轉(zhuǎn)移酶基因和香草酸還原酶基因以及3-脫氫莽草酸代謝途徑的2個基因的表達，從而增加香蘭素的產(chǎn)量，同時減少香蘭素的降解，使發(fā)酵液中香蘭素的量增多，進而提高菌株發(fā)酵產(chǎn)香蘭素的能力。實驗表明本發(fā)明所述基因工程菌可利用葡萄糖或甘油等廉價碳源為底物生產(chǎn)香蘭素，經(jīng)48小時發(fā)酵，以lb培養(yǎng)基、添加20g/l葡萄糖的lb培養(yǎng)基、添加20g/l葡萄糖的wvp培養(yǎng)基或添加20g/l甘油的wvp培養(yǎng)基，產(chǎn)生的香蘭素最高產(chǎn)量分別為24.1mg/l，88.5mg/l，85.8mg/l，51.2mg/l。采用本發(fā)明的方法發(fā)酵產(chǎn)生的香蘭素發(fā)酵液中無異香蘭素雜質(zhì)，便于后續(xù)分離，具有很好的應(yīng)用前景。
生物保藏信息：
菌株大腸桿菌cffsh003：分類命名：大腸埃希氏菌，escherichiacoli.于2016年12月20日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏中心地址中國武漢，武漢大學(xué)，保藏編號為cctccno:m2016770。
附圖說明
為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
圖1為不同基因敲除菌株對香蘭素的降解情況測試。
具體實施方式
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)香蘭素的代謝工程菌及其構(gòu)建方法與生產(chǎn)香蘭素的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及產(chǎn)品已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細闡述，下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例中l(wèi)b培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l；固體培養(yǎng)基添加2％瓊脂；在使用前進行高壓蒸汽滅菌，121℃，20min。
實施例1：大腸桿菌bl21(de3)中敲除莽草酸脫氫酶編碼基因aroe
利用pcrtargeting技術(shù)，敲除大腸桿菌bl21(de3)中莽草酸脫氫酶編碼基因aroe，獲得的菌株命名為wyv5。具體操作如下：
以bl21(de3)菌株基因組為模板，分別利用引物對aroe_up_s、aroe_up_a和aroe_dw_s、aroe_dw_a擴增aroe基因上下游同源臂，同時以pkd3為模板，以引物對aroe-cm_s、aroe-cm_a擴增氯霉素抗性基因片段，將三個片段通過重疊pcr擴增獲得aroe基因敲除片段aroe::cm，引物序列如下：
aroe_up_s：5′-aacggaagccgttttcggtg-3′；
aroe_up_a：5′-cattatgttacccctgtcga-3′；
aroe-cm_s：5′-aatccgcgatgccctgacgggtgaactgtttcgacaggggtaacataatggtgtaggctggagctgcttc-3′；
aroe-cm_a：5′-attctcgtcccactcttccctgtccggaaactggatggcctgattcacgccatatgaatatcctccttag-3′；
aroe_dw_s：5′-gcgtgaatcaggccatccag-3′；
aroe_dw_a：5′-tccacggctgcaccattggc-3′。
將pkd46質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌bl21(de3)，挑取單克隆接種至lb液體培養(yǎng)基(含氨芐霉素100μg/ml)，30℃，220rpm過夜培養(yǎng)后，以1％轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接至50mllb液體培養(yǎng)基(含氨芐霉素100μg/ml，l-阿拉伯糖10mm)，30℃，220rpm培養(yǎng)至a6000.4左右，離心收集菌體，以10％甘油洗2遍后，重懸于200μl10％甘油，加入10μl上述獲得的aroe基因敲除片段aroe::cm，混合均勻后置于1mm電轉(zhuǎn)杯中，2.5kv電壓下進行電擊轉(zhuǎn)化。電擊后迅速加入1ml無菌lb液體培養(yǎng)基，37℃，220rpm復(fù)蘇1h后，菌體涂布于lb固體平板(含氯霉素25μg/ml)。
長出的轉(zhuǎn)化子以引物對aroe_up_s、cm_up_a進行菌落pcr鑒定。引物序列如下：
aroe_up_s：5′-aacggaagccgttttcggtg-3′；
cm_up_a：5′-ttatacgcaaggcgacaagg-3′。
能夠擴增出約500bp大小條帶的菌落表明成功以氯霉素抗性基因替換aroe基因，將其接種至lb培養(yǎng)基中，制備化轉(zhuǎn)感受態(tài)，并轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pcp20，涂布lb平板(含氨芐霉素100μg/ml)，30℃培養(yǎng)至長出單菌落。挑取長出的單菌落劃線于無抗lb平板，43℃培養(yǎng)過夜。長出的單菌落分別接種至無抗lb平板、氨芐平板及氯霉素平板，以驗證抗性基因及pcp20、pkd46質(zhì)粒是否去除。在無抗平板能夠生長，在氨芐平板和氯霉素平板不能生長的菌株，再以引物對aroe_up_s、aroe_dw_a進行pcr鑒定。引物序列如下：
aroe_up_s：5′-aacggaagccgttttcggtg-3′
aroe_dw_a：5′-tccacggctgcaccattggc-3′
鑒定正確(pcr產(chǎn)物大小約為1000bp)的菌落成功敲除了aroe基因，命名為wyv5。
實施例2：可能的香蘭素降解基因簇yqhc-yqhd-dkga的敲除
利用pcrtargeting技術(shù)，對實施例1獲得的菌株敲除可能的香蘭素降解基因簇yqhc-yqhd-dkga，獲得的菌株命名為wyv18。具體操作如下：
以bl21(de3)菌株基因組為模板，分別利用引物對yqhc-dkga_up_s、yqhc-dkga_up_a和yqhc-dkga_dw_s、yqhc-dkga_dw_a擴增yqhc-yqhd-dkga基因簇上下游同源臂，同時以pkd3為模板，以引物對yqhc-dkga-cm_s、yqhc-dkga-cm_a擴增氯霉素抗性基因片段，將三個片段通過重疊pcr擴增獲得yqhc-yqhd-dkga基因簇敲除片段yqhc-yqhd-dkga::cm。引物序列如下：
yqhc-dkga_up_s：5′-ttttctgcctacgattgc-3′；
yqhc-dkga_up_a：5′-ggaaaatcgtcaggcgttac-3′；
yqhc-dkga-cm_s：5′-gtaacgcctgacgattttccccgttcccggttgctgtaccgggaacgtatgtgtaggctggagctgcttc-3′；
yqhc-dkga-cm_a：5′-tctgaaaagtccggtagcggaacattaccgccaccgggagaatttgcatgcatatgaatatcctccttag-3′；
yqhc-dkga_dw_s：5′-catgcaaattctcccggtgg-3′；
yqhc-dkga_dw_a：5′-tcagtgtctgcgtggtct-3′。
將pkd46質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至實施例1得到的大腸桿菌wyv5，挑取單克隆接種至lb液體培養(yǎng)基(含氨芐霉素100μg/ml)，30℃，220rpm過夜培養(yǎng)后，以1％轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接至50mllb液體培養(yǎng)基(含氨芐霉素100μg/ml，l-阿拉伯糖10mm)，30℃，220rpm培養(yǎng)至a6000.4左右，離心收集菌體，以10％甘油洗2遍后，重懸于200μl10％甘油，加入10μl上述獲得的yqhc-yqhd-dkga基因簇敲除片段yqhc-yqhd-dkga::cm，混合均勻后置于1mm電轉(zhuǎn)杯中，2.5kv電壓下進行電擊轉(zhuǎn)化。電擊后迅速加入1ml無菌lb液體培養(yǎng)基，37℃，220rpm復(fù)蘇1h后，菌體涂布于lb固體平板(含氯霉素25μg/ml)。長出的轉(zhuǎn)化子以引物對yqhc-dkga_up_s、cm_up_a進行菌落pcr鑒定，引物序列如下：
yqhc-dkga_up_s：5′-ttttctgcctacgattgc-3′；
cm_up_a：5′-ttatacgcaaggcgacaagg-3′。
能夠擴增出約500bp大小條帶的菌落表明成功以氯霉素抗性基因替換yqhc-yqhd-dkga基因簇，將其接種至lb培養(yǎng)基中，制備化轉(zhuǎn)感受態(tài)，并轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pcp20，涂布lb平板(含氨芐霉素100μg/ml)，30℃培養(yǎng)至長出單菌落。挑取長出的單菌落劃線于無抗lb平板，43℃培養(yǎng)過夜。長出的單菌落分別接種至無抗lb平板、氨芐平板及氯霉素平板，以驗證抗性基因及pcp20、pkd46質(zhì)粒是否去除。在無抗平板能夠生長，在氨芐平板和氯霉素平板不能生長的菌株，再以引物對yqhc-dkga_up_s、yqhc-dkga_dw_a進行pcr鑒定，引物序列如下：
yqhc-dkga_up_s：5′-ttttctgcctacgattgc-3′；
yqhc-dkga_dw_a：5′-tcagtgtctgcgtggtct-3′。
鑒定正確(pcr產(chǎn)物大小約為1000bp)的菌落成功敲除了yqhc-yqhd-dkga基因簇，命名為wyv18。
實施例3：可能的香蘭素降解基因yahk的敲除
利用pcrtargeting技術(shù)，對實施例2獲得的菌株wyv18敲除可能的香蘭素降解基因yahk，獲得的菌株命名為wyv39。具體操作如下：
以bl21(de3)菌株基因組為模板，分別利用引物對yahk_up_s、yahk_up_a和yahk_dw_s、yahk_dw_a擴增yahk基因上下游同源臂，同時以pkd3為模板，以引物對yahk-cm_s、yahk-cm_a擴增氯霉素抗性基因片段，將三個片段通過重疊pcr擴增獲得yahk基因敲除片段yahk::cm，引物序列如下：
yahk_up_s：5′-agatgaactggcgaaccgga-3′；
yahk_up_a：5′-gaacttcgaagcagctccagcctacaccattgtgtttactcctgattagc-3′；
yahk-cm_s：5′-gctaatcaggagtaaacacaatggtgtaggctggagctgcttcgaagttc-3′；
yahk-cm_a：5′-tgttaaaccacagggtatttattaattttttcacatatgaatatcctccttagttccta-3′；
yahk_dw_s：5′-taggaactaaggaggatattcatatgtgaaaaaattaataaataccctgtggtttaaca-3′；
yahk_dw_a：5′-atccatgcgcaagcgcctgc-3′；
將pkd46質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至實施例2獲得的菌株wyv18，挑取單克隆接種至lb液體培養(yǎng)基(含氨芐霉素100μg/ml)，30℃，220rpm過夜培養(yǎng)后，以1％轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接至50mllb液體培養(yǎng)基(含氨芐霉素100μg/ml，l-阿拉伯糖10mm)，30℃，220rpm培養(yǎng)至a6000.4左右，離心收集菌體，以10％甘油洗2遍后，重懸于200μl10％甘油，加入10μl上述獲得的yahk基因敲除片段yahk::cm，混合均勻后置于1mm電轉(zhuǎn)杯中，2.5kv電壓下進行電擊轉(zhuǎn)化。電擊后迅速加入1ml無菌lb液體培養(yǎng)基，37℃，220rpm復(fù)蘇1h后，菌體涂布于lb固體平板(含氯霉素25μg/ml)。長出的轉(zhuǎn)化子以引物對yahk_up_s、cm_up_a進行菌落pcr鑒定，引物序列如下：
yahk_up_s：5′-agatgaactggcgaaccgga-3′；
cm_up_a：5′-ttatacgcaaggcgacaagg-3′。
能夠擴增出約500bp大小條帶的菌落表明成功以氯霉素抗性基因替換yahk基因的菌落，將其接種至lb培養(yǎng)基中，制備化轉(zhuǎn)感受態(tài)，并轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pcp20，涂布lb平板(含氨芐霉素100μg/ml)，30℃培養(yǎng)至長出單菌落。挑取長出的單菌落劃線于無抗lb平板，43℃培養(yǎng)過夜。長出的單菌落分別接種至無抗lb平板、氨芐平板及氯霉素平板，以驗證抗性基因及pcp20、pkd46質(zhì)粒是否去除。在無抗平板能夠生長，在氨芐平板和氯霉素平板不能生長的菌株，再以引物對yahk_up_s、yahk_dw_a進行pcr鑒定，引物序列如下：
yahk_up_s：5′-agatgaactggcgaaccgga-3′；
yahk_dw_a：5′-atccatgcgcaagcgcctgc-3′。
鑒定正確(pcr產(chǎn)物大小約為1000bp)的菌落成功敲除了yahk基因，命名為wyv39。
實施例4：可能的香蘭素降解基因yjgb的敲除
利用pcrtargeting技術(shù)，對實施例3獲得的菌株wyv39敲除可能的香蘭素降解基因yjgb，獲得的菌株命名為wyv55。具體操作如下：
以bl21(de3)菌株基因組為模板，分別利用引物對yjgb_up_s、yjgb_up_a和yjgb_dw_s、yjgb_dw_a擴增yjgb基因上下游同源臂，同時以pkd3為模板，以引物對yjgb-cm_s、yjgb-cm_a擴增氯霉素抗性基因片段，將三個片段通過重疊pcr擴增獲得yjgb基因敲除片段yjgb::cm，引物序列如下：
yjgb_up_s：5′-actggaccgaataaagatc-3′；
yjgb_up_a：5′-tgtttgggaagtgtagagc-3′；
yjgb-cm_s：5′-ctgccatgctctacacttcccaaacaacaccagagaaggaccaaaaaatggtgtaggctggagctgcttc-3′；
yjgb-cm_a：5′-tatgtgcgaaagagggcagcgcctcagatcagcgctgcgaatgattttcacatatgaatatcctccttag-3′；
yjgb_dw_s：5′-tgaaaatcattcgcagcgct-3′；
yjgb_dw_a：5′-ttctgatgagtcgctatga-3′。
將pkd46質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至實施例3獲得的菌株wyv39，挑取單克隆接種至lb液體培養(yǎng)基(含氨芐霉素100μg/ml)，30℃，220rpm過夜培養(yǎng)后，以1％轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接至50mllb液體培養(yǎng)基(含氨芐霉素100μg/ml，l-阿拉伯糖10mm)，30℃，220rpm培養(yǎng)至a6000.4左右，離心收集菌體，以10％甘油洗2遍后，重懸于200μl10％甘油，加入10μl上述獲得的yjgb基因敲除片段yjgb::cm，混合均勻后置于1mm電轉(zhuǎn)杯中，2.5kv電壓下進行電擊轉(zhuǎn)化。電擊后迅速加入1ml無菌lb液體培養(yǎng)基，37℃，220rpm復(fù)蘇1h后，菌體涂布于lb固體平板(含氯霉素25μg/ml)。長出的轉(zhuǎn)化子以引物對yjgb_up_s、cm_up_a進行菌落pcr鑒定，引物序列如下：
yjgb_up_s：5′-actggaccgaataaagatc-3′；
cm_up_a：5′-ttatacgcaaggcgacaagg-3′。
能夠擴增出約500bp大小條帶的菌落表明成功以氯霉素抗性基因替換yjgb基因的菌落，將其接種至lb培養(yǎng)基中，制備化轉(zhuǎn)感受態(tài)，并轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pcp20，涂布lb平板(含氨芐霉素100μg/ml)，30℃培養(yǎng)至長出單菌落。挑取長出的單菌落劃線于無抗lb平板，43℃培養(yǎng)過夜。長出的單菌落分別接種至無抗lb平板、氨芐平板及氯霉素平板，以驗證抗性基因及pcp20、pkd46質(zhì)粒是否去除。在無抗平板能夠生長，在氨芐平板和氯霉素平板不能生長的菌株，再以引物對yjgb_up_s、yjgb_dw_a進行pcr鑒定，引物序列如下：
yjgb_up_s：5′-actggaccgaataaagatc-3′；
yjgb_dw_a：5′-ttctgatgagtcgctatga-3′。
鑒定正確(pcr產(chǎn)物大小約為1000bp)的菌落成功敲除了yjgb基因，命名為wyv55。
實施例5：測試基因敲除菌株香蘭素降解情況
分別將實施例1-4中獲得的不同基因敲除菌株，與對照菌株bl21(de3)接種至lb培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至a600～1.0左右后，加入終濃度0.5g/l香蘭素，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，24h取培養(yǎng)液，通過hplc檢測培養(yǎng)液中香蘭素、香草酸、香草醇濃度。根據(jù)測定的濃度計算香蘭素、香草酸、香草醇的相對百分百含量，見附圖1。結(jié)果顯示，組合敲除了aroe、yqhc、yqhd、dkga、yahk和yjgb等基因的工程菌中wyv55香蘭素降解程度最低。
實施例6：重組質(zhì)粒prsfduet-aroz-comt的構(gòu)建
1.擴增或合成3-脫氫莽草酸脫水酶基因(aroz)片段
利用pcr技術(shù)，以蠟狀芽孢桿菌(bacilluscereusatcc10876)基因組為模板，以引物對aroz_s(5′-cgcggatccgatgaaatattcgctatgtac-3′)、aroz_a(5′-cccaagcttttacgaagttactacttc-3′)，擴增得到片段為3-脫氫莽草酸脫水酶基因bc-aroz，基因序列如seqidno:1所示。
將得到的pcr產(chǎn)物用dna瓊脂糖凝膠回收試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)回收，獲得3-脫氫莽草酸脫水酶編碼基因片段bc-aroz。
根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性將蘇云金桿菌(bacillusthuringiensisybt-1518)中編碼3-脫氫莽草酸脫水酶的基因進行密碼子優(yōu)化，進行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上bamhi酶切位點，下游加上hindiii酶切位點，獲得片段bt-aroz(基因序列如seqidno:2所示)。
2.重組質(zhì)粒prsfduet-aroz的構(gòu)建
利用內(nèi)切酶分別對步驟1中得到的3-脫氫莽草酸脫水酶編碼基因片段bc-aroz或bt-aroz和prsfduet-1質(zhì)粒進行雙酶切；雙酶切使用的內(nèi)切酶為bamhi和hindiii(thermoscientific)；酶切產(chǎn)物以dna瓊脂糖凝膠回收試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)回收。
將雙酶切后的aroz基因片段和prsfduet-1質(zhì)粒片段用t4dna連接酶(takara)進行連接，22℃連接2h，構(gòu)建重組質(zhì)粒prsfduet-aroz。
3.合成o-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(sl-comt)片段
根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性將番茄solanumlycopersicum中命名為comt的o-甲基轉(zhuǎn)移酶基因進行密碼子優(yōu)化，進行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上ndei酶切位點，下游加上xhoi酶切位點，獲得片段sl-comt(基因序列如seqidno:3所示)。
根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性將人homosapiens中命名為comt的o-甲基轉(zhuǎn)移酶的可溶部分編碼基因進行密碼子優(yōu)化，進行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上ndei酶切位點，下游加上xhoi酶切位點，獲得片段hs-comt(基因序列如seqidno:4所示)。
根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性將中國對蝦fenneropenaeuschinensis中命名為comt的o-甲基轉(zhuǎn)移酶基因進行密碼子優(yōu)化，進行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上ndei酶切位點，下游加上xhoi酶切位點，獲得片段fc-comt(基因序列如seqidno:5所示)。
根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性將黃色黏球菌myxococcusxanthus中命名為comt的o-甲基轉(zhuǎn)移酶基因進行密碼子優(yōu)化，進行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上ndei酶切位點，下游加上xhoi酶切位點，獲得片段mx-comt(基因序列如seqidno:6所示)。
根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性將甜椒capsicumannuum中命名為comt的o-甲基轉(zhuǎn)移酶的可溶部分編碼基因進行密碼子優(yōu)化，進行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上ndei酶切位點，下游加上xhoi酶切位點，獲得片段ca-comt(基因序列如seqidno:7所示)。
根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性將羅勒ocimumbasilicum中命名為comt的o-甲基轉(zhuǎn)移酶的可溶部分編碼基因進行密碼子優(yōu)化，進行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上ndei酶切位點，下游加上xhoi酶切位點，獲得片段ob-comt(基因序列如seqidno:8所示)。
4.重組質(zhì)粒prsfduet-aroz-comt的構(gòu)建
利用內(nèi)切酶分別對步驟2中得到的prsfduet-aroz質(zhì)粒和步驟3中合成的sl-comt、hs-comt、fc-comt、mx-comt、ca-comt或ob-comt片段進行雙酶切；雙酶切使用的內(nèi)切酶為ndei和xhoi(thermoscientific)；酶切產(chǎn)物以dna瓊脂糖凝膠回收試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)回收。雙酶切后的基因片段和質(zhì)粒片段用t4dna連接酶(takara)進行連接，22℃連接2h，構(gòu)建重組質(zhì)粒prsfduet-aroz-comt。
實施例7：重組質(zhì)粒petduet-car的構(gòu)建
利用pcr技術(shù)，以艾阿華諾卡氏菌(nocardiaiowensisdsm45197)基因組為模板，以引物對car_s(5′-cgcggatccgatggcagtggattcaccgga-3′)、car_a(5′-cccaagctttcagagcagctgaagcagtt-3′)擴增得到香草酸還原酶基因ni-car的片段，(基因序列如seqidno:9所示)；將得到的pcr產(chǎn)物用dna瓊脂糖凝膠回收試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)回收，獲得ni-car片段。
根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性將粗糙脈胞菌neurosporacrassa中可能的香草酸還原酶編碼基因nc-car進行密碼子優(yōu)化后，進行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上bamhi酶切位點，下游加上hindiii酶切位點，獲得片段nc-car(基因序列如seqidno:10所示)。利用內(nèi)切酶分別對獲得的的ni-car或nc-car基因片段和petduet-1質(zhì)粒進行雙酶切；雙酶切使用的內(nèi)切酶為bamhi和hindiii(thermoscientific)；酶切產(chǎn)物以dna瓊脂糖凝膠回收試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)回收。
雙酶切后的ni-car或nc-car基因片段和petduet-1質(zhì)粒片段用t4dna連接酶(takara)進行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒petduet-car。
實施例8：重組質(zhì)粒pacycduet-arob-aroffbr的構(gòu)建
1.擴增3-脫氫奎尼酸合成酶基因(arob)片段
利用pcr技術(shù)，以大腸桿菌bl21(de3)基因組為模板，以引物對arob_s(5′-cgcggatccgatggagaggattgtcgttac-3′)、arob_a(5′-acgcgtcgacttacgctgattgacaatcg-3′)擴增得到3-脫氫奎尼酸合成酶基因arob，將得到的pcr產(chǎn)物用dna瓊脂糖凝膠回收試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)回收。
2.重組質(zhì)粒pacycduet-arob的構(gòu)建
利用內(nèi)切酶bamhi和sali(thermoscientific)分別對回收的arob基因片段和pacycduet-1質(zhì)粒進行雙酶切；雙酶切后的基因片段和pacycduet-1質(zhì)粒片段用t4dna連接酶(takara)進行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pacycduet-arob；
3.3-脫氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因(arof)片段的擴增和突變
利用pcr技術(shù)，以大腸桿菌bl21(de3)基因組為模板，以引物對arof_s(5′-cggggtaccatgcaaaaagacgcgctgaa-3′)、arof_a(5′-ccgctcgagttaagccacgcgagccgtca-3′)擴增得到3-脫氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因arof。將arof片段連接至ptg19-t載體(上海捷瑞生物工程有限公司)，構(gòu)建質(zhì)粒t-arof。利用pcr技術(shù)，以質(zhì)粒t-arof為模板，以引物對arof_m_s(5′-ctgaatagcccgcaatacctgggcgatctg-3′)、arof_m_a(5′-caggtattgcgggctattcagatctaacgc-3′)擴增得到攜帶p148l定點突變的arof基因片段aroffbr的質(zhì)粒，以dpni消化去除未突變模板后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)，獲得攜帶aroffbr基因片段的質(zhì)粒t-aroffbr；
4.重組質(zhì)粒pacycduet-arob-aroffbr的構(gòu)建
利用內(nèi)切酶kpni和xhoi(thermoscientific)分別對步驟3中得到的t-aroffbr質(zhì)粒和步驟2中得到的重組質(zhì)粒pacycduet-arob進行雙酶切；雙酶切后的aroffbr基因片段和pacycduet-arob質(zhì)粒片段用t4dna連接酶(takara)進行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pacycduet-arob-aroffbr。
實施例9：香蘭素生產(chǎn)菌的構(gòu)建
將實施例6得到的重組質(zhì)粒prsfduet-aroz-comt5μl，實施例7得到的重組質(zhì)粒petduet-car5μl，以及實施例8得到的重組質(zhì)粒pacycduet-arob-aroffbr5μl通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至實施例4得到的工程菌wyv55感受態(tài)，涂布于lb平板(含氨芐霉素100μg/ml、卡那霉素50μg/ml、氯霉素25μg/ml)，經(jīng)過篩選和驗證后獲得用于生產(chǎn)香蘭素的代謝工程大腸桿菌，其中產(chǎn)量最高的菌種cffsh003，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為cctccno:m2016770。
實施例10：工程菌cffsh003以lb培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)香蘭素
(1)平板培養(yǎng)：將實施例9得到的代謝工程大腸桿菌cffsh003接種至含有氨芐霉素、卡那霉素和氯霉素的lb培養(yǎng)基固體平板上，37℃培養(yǎng)過夜；氨芐霉素的濃度為100μg/ml；卡那霉素的濃度為50μg/ml；氯霉素的濃度為25μg/ml；
(2)種子培養(yǎng)：將步驟(1)培養(yǎng)的菌株接種至含有氨芐霉素、卡那霉素和氯霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜；氨芐霉素的濃度為100μg/ml；卡那霉素的濃度為50μg/ml；氯霉素的濃度為25μg/ml；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(2)中得到的種子液接種到含有氨芐霉素、卡那霉素、氯霉素和iptg的lb培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)48小時，得到含香蘭素的發(fā)酵液；氨芐霉素的濃度為100μg/ml；卡那霉素的濃度為50μg/ml；氯霉素的濃度為25μg/ml；iptg的濃度為0.2mm；
其中，上述步驟(1)～(3)中所述的lb培養(yǎng)基配方是：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l；固體培養(yǎng)基添加2％瓊脂；
(4)hplc檢測發(fā)酵液中香蘭素的濃度：取發(fā)酵液1ml，12000rpm離心10min后取上清，經(jīng)0.22μm過濾膜過濾至液相樣品瓶。使用高效液相色譜儀(agilenttechnologies1290infinity)進行香蘭素濃度的測定。采用agilenteclipseplusc18rrhd(2.1*50mm)色譜柱進行液相分離，流動相a為0.1％乙酸水溶液，流動相b為甲醇。流速為0.5ml/min，梯度洗脫程序為，0min90％a+10％b，1.3min90％a+10％b，1.7min，60％a+40％b，2.5min60％a+40％b，2.8min90％a+10％b，3.5min90％a+10％b。紫外檢測器波長為280nm，柱溫為30℃，香蘭素出峰時間為2.3min。經(jīng)測定，發(fā)酵液中香蘭素最高產(chǎn)量為24.1mg/l。
實施例11：工程菌cffsh003以添加20g/l葡萄糖的lb培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)香蘭素
(1)平板培養(yǎng)：將實施例9得到的代謝工程大腸桿菌cffsh003接種至含有氨芐霉素、卡那霉素和氯霉素的lb培養(yǎng)基固體平板上，37℃培養(yǎng)過夜；氨芐霉素的濃度為100μg/ml；卡那霉素的濃度為50μg/ml；氯霉素的濃度為25μg/ml；
(2)種子培養(yǎng)：將步驟(1)培養(yǎng)的菌株接種至含有氨芐霉素、卡那霉素和氯霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜；氨芐霉素的濃度為100μg/ml；卡那霉素的濃度為50μg/ml；氯霉素的濃度為25μg/ml；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(2)中得到的種子液接種到含有氨芐霉素、卡那霉素、氯霉素和iptg的發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)48小時，得到含香蘭素的發(fā)酵液；氨芐霉素的濃度為100μg/ml；卡那霉素的濃度為50μg/ml；氯霉素的濃度為25μg/ml；iptg的濃度為0.2mm；
其中，上述步驟(1)～(2)中所述的lb培養(yǎng)基配方是：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l；固體培養(yǎng)基添加2％瓊脂；
上述步驟(3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，葡萄糖20g/l。
(4)hplc檢測發(fā)酵液中香蘭素的濃度：取發(fā)酵液1ml，12000rpm離心10min后取上清，經(jīng)0.22μm過濾膜過濾至液相樣品瓶。使用高效液相色譜儀(agilenttechnologies1290infinity)進行香蘭素濃度的測定。采用agilenteclipseplusc18rrhd(2.1*50mm)色譜柱進行液相分離，流動相a為0.1％乙酸水溶液，流動相b為甲醇。流速為0.5ml/min，梯度洗脫程序為，0min90％a+10％b，1.3min90％a+10％b，1.7min，60％a+40％b，2.5min60％a+40％b，2.8min90％a+10％b，3.5min90％a+10％b。紫外檢測器波長為280nm，柱溫為30℃，香蘭素出峰時間為2.3min。經(jīng)測定，發(fā)酵液中香蘭素最高產(chǎn)量為88.5mg/l。
實施例12：工程菌cffsh003以添加20g/l甘油的lb培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)香蘭素
(1)平板培養(yǎng)：將實施例9得到的代謝工程大腸桿菌cffsh003接種至含有氨芐霉素、卡那霉素和氯霉素的lb培養(yǎng)基固體平板上，37℃培養(yǎng)過夜；氨芐霉素的濃度為100μg/ml；卡那霉素的濃度為50μg/ml；氯霉素的濃度為25μg/ml；
(2)種子培養(yǎng)：將步驟(1)培養(yǎng)的菌株接種至含有氨芐霉素、卡那霉素和氯霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜；氨芐霉素的濃度為100μg/ml；卡那霉素的濃度為50μg/ml；氯霉素的濃度為25μg/ml；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(2)中得到的種子液接種到含有氨芐霉素、卡那霉素、氯霉素和iptg的發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)48小時，得到含香蘭素的發(fā)酵液；氨芐霉素的濃度為100μg/ml；卡那霉素的濃度為50μg/ml；氯霉素的濃度為25μg/ml；iptg的濃度為0.2mm；
其中，上述步驟(1)～(2)中所述的lb培養(yǎng)基配方是：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l；固體培養(yǎng)基添加2％瓊脂；
上述步驟(3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，甘油20g/l。
(4)hplc檢測發(fā)酵液中香蘭素的濃度：取發(fā)酵液1ml，12000rpm離心10min后取上清，經(jīng)0.22μm過濾膜過濾至液相樣品瓶。使用高效液相色譜儀(agilenttechnologies1290infinity)進行香蘭素濃度的測定。采用agilenteclipseplusc18rrhd(2.1*50mm)色譜柱進行液相分離，流動相a為0.1％乙酸水溶液，流動相b為甲醇。流速為0.5ml/min，梯度洗脫程序為，0min90％a+10％b，1.3min90％a+10％b，1.7min，60％a+40％b，2.5min60％a+40％b，2.8min90％a+10％b，3.5min90％a+10％b。紫外檢測器波長為280nm，柱溫為30℃，香蘭素出峰時間為2.3min。經(jīng)測定，發(fā)酵液中香蘭素最高產(chǎn)量為61.7mg/l。
實施例13：工程菌cffsh003以葡萄糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)香蘭素
(1)平板培養(yǎng)：將實施例9得到的代謝工程大腸桿菌cffsh003接種至含有氨芐霉素、卡那霉素和氯霉素的lb培養(yǎng)基固體平板上，37℃培養(yǎng)過夜；氨芐霉素的濃度為100μg/ml；卡那霉素的濃度為50μg/ml；氯霉素的濃度為25μg/ml；
(2)種子培養(yǎng)：將步驟(1)培養(yǎng)的菌株接種至含有氨芐霉素、卡那霉素和氯霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜；氨芐霉素的濃度為100μg/ml；卡那霉素的濃度為50μg/ml；氯霉素的濃度為25μg/ml；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(2)中得到的種子液接種到含有氨芐霉素、卡那霉素、氯霉素和iptg的lb培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)48小時，得到含香蘭素的發(fā)酵液；氨芐霉素的濃度為100μg/ml；卡那霉素的濃度為50μg/ml；氯霉素的濃度為25μg/ml；iptg的濃度為0.2mm；
其中，上述步驟(1)～(2)中所述的lb培養(yǎng)基配方是：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l；固體培養(yǎng)基是在lb培養(yǎng)基配方中添加2％瓊脂；
上述步驟(3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：kh2po47.5g/l，(nh4)2so42.96g/l，mgso40.24g/l，檸檬酸銨0.3g/l，一水合檸檬酸2.1g/l，苯丙氨酸0.7g/l，酪氨酸0.7g/l，色氨酸0.7g/l，對氨基苯甲酸0.01g/l，2,3-二羥基苯甲酸0.01g/l，對羥基苯甲酸0.01g/l，(nh4)6(mo7o24)·4h2o0.0037g/l，znso4·7h2o0.0029g/l，h3bo30.0247g/l，cuso4·5h2o0.0025g/l，mncl2·4h2o0.0158g/l，葡萄糖20g/l。
(4)hplc檢測發(fā)酵液中香蘭素的濃度：取發(fā)酵液1ml，12000rpm離心10min后取上清，經(jīng)0.22μm過濾膜過濾至液相樣品瓶。使用高效液相色譜儀(agilenttechnologies1290infinity)進行香蘭素濃度的測定。采用agilenteclipseplusc18rrhd(2.1*50mm)色譜柱進行液相分離，流動相a為0.1％乙酸水溶液，流動相b為甲醇。流速為0.5ml/min，梯度洗脫程序為，0min90％a+10％b，1.3min90％a+10％b，1.7min，60％a+40％b，2.5min60％a+40％b，2.8min90％a+10％b，3.5min90％a+10％b。紫外檢測器波長為280nm，柱溫為30℃，香蘭素出峰時間為2.3min。經(jīng)測定，發(fā)酵液中香蘭素最高產(chǎn)量為85.8mg/l。
實施例14：工程菌cffsh003以甘油為碳源發(fā)酵生產(chǎn)香蘭素
(1)平板培養(yǎng)：將實施例9得到的代謝工程大腸桿菌cffsh003接種至含有氨芐霉素、卡那霉素和氯霉素的lb培養(yǎng)基固體平板上，37℃培養(yǎng)過夜；氨芐霉素的濃度為100μg/ml；卡那霉素的濃度為50μg/ml；氯霉素的濃度為25μg/ml；
(2)種子培養(yǎng)：將步驟(1)培養(yǎng)的菌株接種至含有氨芐霉素、卡那霉素和氯霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜；氨芐霉素的濃度為100μg/ml；卡那霉素的濃度為50μg/ml；氯霉素的濃度為25μg/ml；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(2)中得到的種子液接種到含有氨芐霉素、卡那霉素、氯霉素和iptg的發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)48小時，得到含香蘭素的發(fā)酵液；氨芐霉素的濃度為100μg/ml；卡那霉素的濃度為50μg/ml；氯霉素的濃度為25μg/ml；iptg的濃度為0.2mm；
其中，上述步驟(1)～(2)中所述的lb培養(yǎng)基配方是：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l；固體培養(yǎng)基添加2％瓊脂；
上述步驟(3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：kh2po47.5g/l，(nh4)2so42.96g/l，mgso40.24g/l，檸檬酸銨0.3g/l，一水合檸檬酸2.1g/l，苯丙氨酸0.7g/l，酪氨酸0.7g/l，色氨酸0.7g/l，對氨基苯甲酸0.01g/l，2,3-二羥基苯甲酸0.01g/l，對羥基苯甲酸0.01g/l，(nh4)6(mo7o24)·4h2o0.0037g/l，znso4·7h2o0.0029g/l，h3bo30.0247g/l，cuso4·5h2o0.0025g/l，mncl2·4h2o0.0158g/l，甘油20g/l。
(4)hplc檢測發(fā)酵液中香蘭素的濃度：取發(fā)酵液1ml，12000rpm離心10min后取上清，經(jīng)0.22μm過濾膜過濾至液相樣品瓶。使用高效液相色譜儀(agilenttechnologies1290infinity)進行香蘭素濃度的測定。采用agilenteclipseplusc18rrhd(2.1*50mm)色譜柱進行液相分離，流動相a為0.1％乙酸水溶液，流動相b為甲醇。流速為0.5ml/min，梯度洗脫程序為，0min90％a+10％b，1.3min90％a+10％b，1.7min，60％a+40％b，2.5min60％a+40％b，2.8min90％a+10％b，3.5min90％a+10％b。紫外檢測器波長為280nm，柱溫為30℃，香蘭素出峰時間為2.3min。經(jīng)測定，發(fā)酵液中香蘭素最高產(chǎn)量為51.2mg/l。
sequencelisting
<110>波頓（上海）生物技術(shù)有限公司
<120>一種基因工程菌及其構(gòu)建方法與生產(chǎn)香蘭素的方法
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